Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli

FEMI'nin yavruların bağırsak sisteminin gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için canlı organizmaların komplikasyonları olmadan anne iltihabına (FEMI) fetal maruziyeti simüle etmek için bir chorioamnionitis modeli geliştirdik. Bu, chorioamnionitis'i takiben bağırsak hasarı gelişimi için mekanistik nedenlerin incelenmesine izin verir.

Bu FEMI protokolü, maternal inflamasyona fetal maruziyeti takiben yenidoğanlar üzerindeki uzun vadeli etkilerin araştırılmasını mümkün kılar. Bu özellikle nekrotizan enterokolit veya NEC gelişimi için geçerlidir. Bu teknik, koryoamniyonitte sıklıkla görülen steril iltihabı taklit eder ve canlı bakteri eksikliği, gelişmekte olan bağırsak sistemi ve mikrobiyom üzerinde kafa karıştırıcı etkilere sahip olabilir.

Bu protokolün en önemli adımı, FEMI'yi indüklemek için LPS enjeksiyonudur. Uygun bir LPS dozunun kullanılması ve enjeksiyonun gravid farede intraperitoneal travmaya neden olmaması kritik derecede önemlidir. Mililitre başına 20 mikrogramlık bir çalışma konsantrasyonu için LPS stoğunu bir ila 100 oranında steril tuzlu su ile seyrelterek başlayın.

Gebelik günü E15'te hamile barajları enjekte edin. Kontrol hayvanları için eşdeğer hacimde normal salin kullanarak uygun LPS dozunu belirlemek için enjeksiyondan hemen önce fareleri tartın. LPS çözeltisini yüksekte 15 saniye boyunca üç kez girdaplayın.

Sonra bir mililitrelik bir şırıngaya çekin. Hamile fareyi dizginlemek için tırmalama tekniğini kullanın ve sırt yaslanma pozisyonunda tutun. 30 gauge, sekiz milimetrelik bir iğne eğiminin yaklaşık dörtte biri ila yarısını, karnın sağ alt kadranını 30 ila 40 derecelik bir açıyla kaplayacak şekilde yerleştirin.

Negatif basıncı sağlamak için şırınga pistonunu geri çekin. Ardından negatif basınç varsa enjeksiyonla devam edin. Fareleri yaklaşık 30 dakika izleyin ve ardından hamileliğin geri kalanında onları kafeslere geri koyun.

Yavruları E20'de vajinal doğum yoluyla doğurun ve ad libitum beslemeleri alarak annelerle birlikte kalmalarına izin verin. Bağırsakları doğum sonrası 14. günde hasat edin. Karnın tüm uzunluğu boyunca karnın orta hattından, deri ve peritondan dikey bir kesi yapmak için makas ve forseps kullanın.

İnce bağırsağı mideden çekuma kadar kesin ve mezenteri çıkarın. İnce bağırsağın distal üçte birini izole edin, proksimal ince bağırsağı, çekumu ve kolonu atın. İleum kısmını makas kullanarak ikiye bölün.

Daha sonra proksimal yarısını RNA kantitasyonu için bir RNA stabilizasyon solüsyonuna ve distal yarısını slayt hazırlama için %10 nötr tamponlu formaline yerleştirin. Parafine gömülü dokuyu beş mikrometre kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayırın ve bunları cam slaytlara monte edin. Slaytları deparafinize edin, ardından bölümleri standart prosedürlere göre hematoksilen ve eozin ile boyayın.

Genelleştirilmiş bağırsak yaralanmasını üç noktalı bir ölçekte iki ayrı kör araştırmacı tarafından değerlendirmek için ışık mikroskobu kullanın, villus bütünlüğünü ve bazal membrandan ayrılmayı değerlendirin. Normal mukozayı tanımlamak için sıfır puan atayın. Subepitelyal Gruenhagen boşluğunun gelişimini, vakuolizasyonu veya lamina propria veya villus uçlarıyla sınırlı subepitelyal kaldırmayı içeren hafif yaralanmayı tanımlamak için bir puan atayın.

Villusun yarısından daha büyük epitel kaldırma ve vakuolizasyon, villus distorsiyonu veya mukozal ülserasyon ve lamina propria'nın parçalanması ile gösterilen ciddi yaralanmayı tanımlamak için iki puan atayın. 10 dakika boyunca iki kez ksilen içine daldırın. Sonra onları% 100 etanol ile durulayın.

Slaytları üç dakika boyunca %100 etanol, %90 etanol, %70 etanol ve %50 etanole batırın. Daha sonra slaytları beş dakika boyunca akan su altında yıkayın ve doku örneği kaybını önlemek için bölüme sudan uzak bir yere bakacak şekilde yıkayın. Alcian mavisi leke solüsyonunu standart bir kahve filtresiyle filtreleyin ve slaytları 15 dakika boyunca lekelemek için kullanın.

Sonra iki dakika boyunca akan musluk suyu altında yıkayın. Bir miligram periyodik asidi 200 mililitre çift damıtılmış su ile seyreltin ve slaytları bu çözeltiye beş dakika batırın. Akan su altında bir dakikalık bir yıkamadan sonra, slaytları Schiff reaktifi ile 10 dakika lekeleyin ve beş dakika boyunca tekrar yıkayın.

Daha sonra, bir dakika boyunca hematoksilen ile boyayın ve iki dakika boyunca suyla yıkayın. Onları bir dakika asitli alkole, ardından bir dakika Scott'ın musluk suyuna batırın, ardından bir dakika akan musluk suyu altında yıkayın. Slaytları kurutmak için, her slaytı 10 kez %70 etanol, %90 etanol ve ardından %100 etanole batırın.

Slaytları 10 dakika boyunca %100 etanole batırın, ardından her seferinde üç dakika boyunca iki kez taze ksilene batırın. Numunenin üzerine bir damla montaj ortamı ve üstüne bir lamel yerleştirin. Mikroskop altında kadeh hücrelerini sayın.

Her bir bağırsak dokusu parçası için, goblet hücrelerinin ve 500 epitel hücresinin sayısını sayın. Daha sonra kadeh hücrelerini 100 epitel hücresi başına bir oran olarak ifade edin. Paneth hücrelerini sayın.

Her bir bağırsak dokusu parçası için, her bir bağırsak dokusu parçası için 100 bağırsak kripti sayarak, bağırsak kripti başına Paneth hücrelerinin oranını kaydedin. Embriyonik 15. günde maternal iltihaba veya FEMI'ye fetal maruziyet, doza bağlı gebelik kaybına ve doza bağlı erken doğum oranına yol açar. FEMI, doğumda ve yaşamın sekiz haftasında önemli bir bağırsak hasarına neden olur.

Bu yaralanma, hayvanlara herhangi bir ek uyaranın yokluğunda meydana gelir, bu da FEMI'nin tek başına yenidoğan murin bağırsak sisteminin normal homeostazını bozduğunu düşündürür. İnce bağırsak sisteminin distal üçte birlik kısmında müsin üreten goblet hücrelerinin ve antimikrobiyal peptit üreten Paneth hücrelerinin sayısı ölçüldü. FEMI'nin, FEMI'siz hayvanlara kıyasla, her iki hücre tipinin kaybına neden olarak bağırsak epitelinin normal bileşimini bozduğu bulundu.

FEMI'nin yenidoğan inflamatuar yanıtı üzerindeki etkilerini araştırmak için, FEMI'li ve FEMI'siz yavruların serumundan interlökin-1 beta, interlökin-10, KCGRO ve interlökin-6 dahil olmak üzere çeşitli serum inflamatuar belirteçleri ölçüldü. FEMI, P0'daki tüm sitokinler için inflamatuar kaskadı önemli ölçüde arttırdı. Daha sonraki yaşlardaki inflamatuar kaskad, zaman noktası ve sitokine bağlı olarak farklılık gösterdi. İlginç bir şekilde, FEMI ve sahte gruplarda P7 ila P28'de benzer IL6 seviyeleri vardı.

Bununla birlikte, ikincil müdahale olmamasına rağmen, FEMI grubunda P56'da anlamlı olarak daha yüksek seviyeler vardı. Farklı LPS stokları farklı potansiyellere sahip olabileceğinden, ilk LPS doz eğrisi gerçekleştirmek çok önemlidir. Yenidoğan sonuçlarımızın FEMI'yi indüklemek için kullanılan LPS dozuna bağlı olduğunu bulduk.