Name: Arabidopsiste Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis'te osmotik stres sinyallerini incelemek için yüksek verimli fosfoproteomik yöntemini. Bu teknik, bitki fosfoproteomunun kapsamlı analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı Grant XDB27040106 tarafından desteklendi.

1. Numune hazırlama
<ol><li>Kontrol ve stresle işlenmiş fideleri (1 g) alüminyum bir folyoda hasat edin ve numuneleri sıvı nitrojende flaşla dondurun. NOT: Daha yüksek protein konsantrasyonu genellikle iki haftalık fidelerden olgun bitkilerden daha fazla gözlenir. Bir gram fide, MS analizi için yeterli olan yaklaşık 10 mg protein lysate üretir. Tüm santrifüjleme adımları 1. </li>
	<li>Donmuş fideleri sıvı nitrojenle doldurulmuş bir harç ve pestle kullanarak ince bir toz haline getirin.</li>
	<li>1 mL lizis tamponu ekleyin ((100 mM Tris-HCl'de 6 M guanidin-HCl, pH 8.5) ile 10 mM Tris (2-karboksit)fosfin hidroklorür (TCEP), 40 mM 2-kloroasetamid (CAA), proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü kokteylleri) harcına karıştırın ve pestil yardımıyla karıştırın.</li>
	<li>Bitki lisatını 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın.</li>
	<li>Tüpü 10 dakika boyunca buza yerleştirin. Tüpü 10 s buz üzerinde sonicate, 10 s için duraklatın ve üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Tüpü 20 dakika ve aliquot 150 μL bitki lysate'yi 1,5 mL'lik bir tüpe santrifüj edin.</li>
	<li>Tüpe 600 μL% 100 metanol ekleyin. Girdap ve tüp aşağı dön.</li>
	<li>Tüpe 150 μL% 100 kloroform ekleyin. Girdap ve tüp aşağı dön.</li>
	<li>Tüpe 450 μL ddH2O ekleyin. Girdap ve santrifüj tüp 3 dakika.</li>
	<li>Üst sulu tabakayı atın. Tüpe 600 μL% 100 metanol ekleyin. Tüpü 3 dakika santrifüj edin ve ardından çözeltiyi atın.</li>
	<li>Protein peletlerini% 100 metanolden 600 μL ile yıkayın. Çözeltiyi atın ve protein peletini havayla kurutun.</li>
	<li>Protein peletlerini 600 μL sindirim tamponuna (12 mM sodyum deoksikolat (SDC)/12 mM sodyum lauroyl sarkolizat (SLS) 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) olarak yeniden sunun. Süspansiyon homojenize olana kadar tüpü sonicate edin.</li>
	<li>Bir BCA kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve sindirim tamponu ile konsantrasyonu 4 μg / μL'ye ayarlayın. 100 μL lysate (400 μg protein) yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüpe 292 μL 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) ve 8 μL Lys-C (2,5 Birim/mL) ekleyin. Tüpü 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpe 8 μg tripsin ile 100 μL 50 mM TEAB ekleyin. Tüpü 37 °C'de 12 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tüpe 25 μL% 10 trifluoroasetik asit (TFA) ekleyin. Vorteks ve santrifüj tüpü 4 °C'de 20 dakika santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı tuzdan arındırma için koşullandırılmış bir tuzdan arındırma sütununa aktarın. Bir vakum santrifüj konsantratör kullanarak eluat kurutun. NOT: Reçineyi 1 mL metanol ve ardından %80 asetonitrilde (ACN) %0,1 TFA'nın 1 mL'si ile etkinleştirin. Organik çözücüyü %5 ACN'de en az 3 mL%0,1 TFA ile yıkayın. 1.16. adımda hazırlanan asitlenmiş peptit örneklerini kolona yükleyin ve ardından sütunu% 5 ACN'de% 0.1 TFA'nın en az 3 mL'si ile yıkayın. Yüksek tuz konsantrasyonlarına sahip numuneler için daha fazla yıkama gerekebilir. Fosfopenptitleri% 80 ACN'de% 0.1 TFA'nın 1 mL'si ile elute edin.</li>
</ol>2. Tandem Mass Tag (TMT) etiketleme
<ol><li>Kurutulmuş peptitleri 100 μL 200 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.5'e yeniden tanımlayın.</li>
	<li>Her kanalın TMT reaktifini (0,8 mg) 40 μL susuz ACN'de çözün. TMT reaktif tüpünü 5 dakika boyunca girdap ve aşağı çevirin.</li>
	<li>40 μL TMT'yi numune tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Bu deneyde, 126 ila 128 kanalı mannitol tedavisi olmayan bitkilerin üç biyolojik çoğaltılması ile, 129 ila 131 kanalı ise mannitol tedavisi ile bitkilerin üç biyolojik çoğaltılması ile etiketlenmiştir.</li>
	<li>8 μL% 5 hidroksilamin ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 mL'lik bir tüpte 6 numuneyi karıştırın ve% 10 TFA'nın 14 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Tüpe %0,1 TFA'nın 3.876 μL'sini ekleyin. Girdap ve aşağı dön.</li>
	<li>Çözümü tuzdan arındırma için koşullandırılmış bir tuzdan arındırma sütununa aktarın. Buharlaştırıcı kullanarak elüat kurutun.</li>
</ol>3. IMAC aşama ucunun hazırlanması
<ol><li>Polipropilen frit diske nüfuz etmek için 16 G künt uçlu bir iğne kullanın. NOT: Kesiciyi diskin yüzeyine dik tutun ve diskin tamamen ekstrüzyona maruz olduğundan emin olmak için kesiciyi birkaç kez yuvarlayın. Diski saklamak için bir Petri kabına yerleştirin. İğneyi 200 μL pipet ucuna yerleştirin ve friti bir piston kullanarak ucuna itin.</li>
	<li>Ucun ucunu kaplamak için bir piston kullanarak friti hafifçe ucuna bastırın.<ol>
<li>Frit diski, daha iyi tekrarlanabilirlik sağlayan aynı basınca sahip uçlara yerleştirin. Aşama uçları üretiminin tekrarlanabilirliği, santrifüj adımlarının zamanlamasını ve teknik yinelemeler arasındaki tekrarlanabilirliği etkileyen sabit geri basınç için önemlidir.</li>
		<li>Aşama ipuçları koşullandırma adımı sırasında yüksek sırt basıncı gösteriyorsa, numuneleri yüklerken olası uç tıkanmasını önlemek için ipuçlarını atın. Disk çok fazla yerleştirilmiş olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA spin sütununu ters çevirin ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Ni-NTA boncuklarının fritini hafifçe bastırmak ve boncukları tüpe itmek için bir piston kullanın. NOT: Spin sütunundaki olası boncuk kaybını veya adsorpsiyonunu önlemek için friti hafifçe itmeye dikkat edin.</li>
</ol>4. Hp-RP sahne ucunun hazırlanması
<ol><li>C8 disk kullanarak IMAC aşama ucu için açıklandığı gibi Hp-RP sahne ucu hazırlayın. NOT: Diske büyük kuvvet uygulamayın, çünkü yoğun bir şekilde paketlenmiş bir frit ile sonuçlanabilir ve sahne ucunun geri basıncını artırabilir. Tüm santrifüjleme adımları, 4. </li>
	<li>100 μL%100 metanolde 1 mg C18 boncuk askıya alın ve boncuk çözeltisini ucundan geçirin.</li>
	<li>Sahne ucuna 20 μL tampon 8 (%80 ACN/%20 200 mMNH 4HCO2, pH 10.0) ekleyin ve tampon 8'i santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>Sahne ucuna 20 μL Tampon A (200 mMNH 4HCO2)ekleyin ve A tamponunu santrifüjleme ile uçtan geçirin. NOT: Kullanım sırasında santrifüjü dengeleyin ve Hp-RP kademe ucunun tamamen kurumadığını sağlayın.</li>
</ol>5. Spin adaptörünün hazırlanması
<ol><li>1,5 mL'lik bir tüpün kapağının ortasındaki bir deliği delmek için keskin uçlu cımbız kullanın.</li>
	<li>IMAC kademe ucunu veya Hp-RP kademe ucunu spin adaptörünün deliğine takın. NOT: Sahne ucunun spin adaptörünün altına yakın olmadığından emin olun.</li>
</ol>6. IMAC aşama ucu kullanılarak fosfopenptid zenginleştirme
<ol><li>10 mg Ni-NTA boncuklarını 400 μL yükleme tamponu (%6 asetik asit (AA), pH 3.0) ile askıya alın ve tüm boncuk çözeltisini uç başına yükleyin. Çözeltiyi santrifüjleme ile ucundan geçirin. NOT: Tüm santrifüjleme adımları, adım 6.8'in yanı sıra 6.</li>
	<li>Nikel iyonlarını IMAC aşama ucundan çıkarmak ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirmek için 100 μL 50 mM etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) yükleyin.</li>
	<li>Sahne ucuna 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>%6 AA'da 50 mM FeCl3'ün 100 μL'sini sahne ucuna yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin. Fe3+ iyonları IMAC sahne ucuna şelatlanacaktır.</li>
	<li>Sahne ucunu koşullandırmak için 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>2.7. adımda hazırlanan numune peptitleri ile 100 μL yükleme tamponunu sahne ucuna yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin. NOT: Numunenin akışını toplamak için spin adaptörü olarak yeni bir tüp alın ve akışı gelecekteki analizler için dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Sahne ucuna 100 μL yıkama tamponu (%4,5 AA ve %25 ACN) yükleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin.</li>
	<li>yükleme arabelleği ile ikinci yıkamayı gerçekleştirin. Sahne ucuna 100 μL yükleme tamponu yükleyin ve çözeltiyi 3 dakika boyunca 1000 × g santrifüj kullanarak uçtan geçirin. NOT: Elution adımı sırasında fosfopenptit kaybını ortadan kaldırmak için yıkama tamponunun sahne ucuna tampon yükleyerek değiştirildiğinden emin olun. ACN konsantrasyonunun% 5'in altında olduğundan emin olmak için fosfopenptid elüasyonundan önce IMAC sahne ucunu aşındırın.</li>
	<li>Öndeki IMAC sahne ucunu bir makasla kırpın ve kesilmiş IMAC sahne ucunu Hp-RP ucunun içine yerleştirin. sahne uçlarının iki katmanının santrifüjün kapağına temas etmemesini sağlayın.</li>
</ol>7. Hp-RP C18 aşama ucu kullanılarak fosfopenptid fraksiyonasyonu
<ol><li>Kırpılmış IMAC sahne ucuna 100 μL elution tamponu (200 mM amonyum fosfat (NH4H2PO4)) ekleyin ve çözeltiyi santrifüjleme ile sahne uçlarının iki katmanından geçirin. NOT: Çözüm sahne ucuna geçmiyorsa, aşağı dönüş hızını artırın. Tüm santrifüjleme adımları, 7. Tüm Hp-RP arabellekleri Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
	<li>Cımbız kullanarak IMAC kademe ucunu atın ve Hp-RP kademe ucuna 20 μL Tampon A ekleyin ve tamponu santrifüjleme ile uçtan geçirin. NOT: Tüm elution tamponun atılmadan önce IMAC aşama ucundan geçtiğinden emin olun.</li>
	<li>Kesir 1'i elüte etmek için 20 μL Tampon 1 ekleyin ve eluat'ı santrifüjleme ile yeni bir tüpte toplayın. Her kesiri yeni bir tüpte toplamak için işlemi Tamponlar 2, 3, 4, 5, 6, 7 ve 8 ile tekrarlayın. Vakum konsantratörü kullanarak her fraksiyonun son eluatını kurutun. NOT: Yeni kesirli tamponlar hazırlayın. Her fraksiyonun spin adaptörü olarak 8 yeni tüp alın. Her kesirdeki eluat'ı farklı bir spin adaptöründe toplayın. Fosfopenptitler temel koşullar altında stabil değildir, bu nedenle elüatları bir konsantratörle kurulayın veya hemen% 10 TFA ile asitlendirin.</li>
</ol>8. LC-MS/MS analizi ve veri analizi
<ol><li>%0,1 formik asit (FA) için 5 μL ekleyin ve numuneyi bir kütle spektrometresi ile analiz edin.</li>
	<li>Her kesir için %6-30 arabellek B (%80 ACN ve %0,1 SK) ile 90 dk gradyan çalıştırın.</li>
	<li>Yüksek çarpışma enerjisi ayrışması (HCD) kullanarak ilk 10 etiketli peptidi parçala. Fosforilasyon alanlarını tanımlamak için bir veritabanı aramasını tamamlayın.</li>
	<li>Ham dosyaları MaxQuant yazılımına yükleyin, denemeleri adlandırın ve kesirleri ve PTM'yi ayarlayın. NOT: MaxQuant yazılımının öğreticisi https://www.maxquant.org/ bulunabilir.</li>
	<li>LC-MS/MS çalıştırması türünde muhabir iyon MS2'yi ve izobarik etiketler olarak 6plex TMT'yi seçin. PIF işlevine göre filtreyi etkinleştirin ve en az PIF'i 0,75 olarak ayarlayın.</li>
	<li>Değişken değişiklikler paneline Asetil (Protein N-terim), Oksidasyon (M) ve Fosfo (STY) seçin. Sabit değişiklikler olarak Carbamidomethyl (C) öğesini seçin.</li>
	<li>Sindirim modunu belirli olarak ayarlayın, sindirim enzimi olarak Trypsin/P'yi ve iki kaçırılan bölünmeyi seçin.</li>
	<li>PSM yanlış bulma oranını (FDR) ve protein FDR'yi 0,01 olarak ayarlayın. Değiştirilmiş peptitler için minimum puanı 40 olarak ayarlayın.</li>
	<li>Arabidopsis thaliana veritabanını fasta dosyaları paneline ekleyin ve veritabanı aramasını çalıştırın.</li>
	<li>Arama yapılırken Fosfo (STY) sitelerinin txt dosyasını Perseus yazılımına yükleyin. NOT: Perseus yazılımının ayrıntılı öğreticilerini https://www.maxquant.org/perseus/.</li>
	<li>Ters fosforilasyon bölgelerini filtreleyin. Yerelleştirme olasılığını %75 keserek kireçlenmemiş fosforilasyon alanlarını filtreleyin.</li>
	<li>İstatistiksel analiz için fosforilasyon alanlarının yoğunluklarını kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cellular+and+molecular+responses+to+high+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Plant+Physiology+Plant+Molecualr+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cellular and molecular responses to high salinity.</a> Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).</li>
<li>Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+tolerance+in+plants%3A+Changes+at+the+protein+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level.</a> Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).</li>
<li>Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+networks+in+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Enzymes%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway.</a> Enzymes. 35, 27-56 (2014).</li>
<li>Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+challenges+in+plant+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+proteome-wide+targets+of+protein+kinases+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).</li>
<li>Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+decuple+mutant+reveals+the+importance+of+SnRK2+kinases+in+osmotic+stress+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+identifies+SnRK2+protein+kinase+substrates+and+reveals+the+effectors+of+abscisic+acid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).</li>
<li>Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nine+sucrose+nonfermenting+1-related+protein+kinases+2+activated+by+hyperosmotic+and+saline+stresses+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).</li>
<li>Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+technologies+and+applications+in+plant+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 430(2015).</li>
<li>Hsu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+plant+phosphoproteomics+workflow+and+its+application+to+Tomato+signaling+in+response+to+cold+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress.</a> Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068(2018).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+affinity+chromatography+revisited%3A+pH%2Facid+control+toward+high+selectivity+in+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).</li>
<li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Ruprecht, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+reproducible+phosphopeptide+enrichment+using+iron+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+%28Fe-IMAC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns.</a> Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).</li>
<li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+enrichment+by+aliphatic+hydroxy+acid-modified+metal+oxide+chromatography+for+nano-LC-MS%2FMS+in+proteomics+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications.</a> Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+phosphoproteomic+enrichment+through+complementary+metal-directed+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+identification+of+phosphopeptides+from+putative+basophilic+kinase+substrates+using+Ti+%28IV%29+based+IMAC+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment.</a> Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-pH+reverse+phase+stageTip+for+sensitive+small-scale+membrane+proteomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling.</a> Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+the+TOR+Kinase+and+ABA+receptor+balances+plant+growth+and+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response.</a> Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAF-SnRK2+kinase+cascade+mediates+early+osmotic+stress+signaling+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants.</a> Nature Communications. 11 (1), 613(2020).</li>
<li>Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phosphoproteomics+reveals+in+vivo+insulin+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).</li>
<li>Bekker-Jensen, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+shotgun+strategy+for+the+rapid+generation+of+comprehensive+human+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes.</a> Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).</li>
<li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li>
<li>Hogrebe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+common+quantification+strategies+for+large-scale+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics.</a> Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+of+Arabidopsis+Highly+ABA-Induced1+identifies+AT-Hook-Like10+phosphorylation+required+for+stress+growth+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).</li>
<li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Bitki proteomunun dinamik aralığı ve karmaşıklığı ve fosfoproteom hala fosfoproteomik analizlerin derinliği için sınırlayıcı bir faktördür. 10.000 fosforilasyon bölgesi21 , 22'yitanımlamak için tek çalıştırmalı LC-MS / MS analizi yeteneğine rağmen, tüm bitki fosfoproteomunun kapsamı hala sınırlıdır. Bu nedenle, çevresel strese yanıt olarak tesis sinyal ağlarının küresel görünümünün profil oluşturmasında yüksek hassasiyet ve üstün ayırma verimliliği sağlayan fosfo...

Yüksek tuzluluk, düşük sıcaklık ve kuraklık, bitki verimliliğini etkileyen önemli bir çevresel faktör olan ozmotik streslere neden olur1,2. Protein fosforilasyonu, osmotik strese santral tepkisinde sinyal algısına ve transdüksiyona aracılık eden çeviri sonrası en önemli modifikasyonlardan biridir3,4,5. SNF1 ile ilgili protein kinaz 2'ler (SnRK2s) ozmotik stres sinyalinde yer almaktadır6. SnRK2 ailesinin on üyesinden dokuzu ozmotik strese yanıt olarak önemli aktivasyon gösterir7,8. On SnRK2'nin tamamında mutasyona uğrayan snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant ozmotik strese karşı aşırı duyarlılık gösterdi. Snrk2-dec mutantında, inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic asit (ABA) biyosentezinin ozmotik stres kaynaklı birikimi ve gen ifadeleri güçlü bir şekilde azalır ve SnRK2'lerin ozmotik stres yanıtlarındaki hayati rolünü vurgular6. Bununla birlikte, SnRK2s kinazlarının bu biyolojik süreçleri nasıl düzenlediği hala belirsizdir. Osmotik strese yanıt olarak fosfoproteomik değişikliklerin profillenmesi, bu boşluğu kapatmanın ve bitkilerdeki ozmotik stresi tetikleyen savunma mekanizmalarını tanımlamanın etkili bir yoludur.
Kütle spektrometresi (MS), bitki fosfoproteom9'unharitalandırılması için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, bitki fosfoproteomiklerinin karakterizasyonu, bitki proteomunun dinamik aralığı ve bitki lysate4'ünkarmaşıklığı nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fototiretik pigmentler ve ikincil metabolitler gibi istenmeyen parazitleri ortadan tanıyan ve bitki fosfoproteomunun derin kapsamasını sağlayan evrensel bir bitki fosfoproteomik iş akışı geliştirdik10. MS analizi 11,12,13,14,15,16öncesinde fosfopenptidlerin zenginleştirilmesi için hareketsiz metal iyonbenzeşim kromatografisi (IMAC) ve metal oksit kromatografisi (MOC) gibi çeşitli fosfopenptid zenginleştirme yöntemleri geliştirilmiştir. Fosfopenptitlerle birlikte saflaştırıcı asidik fosfopenptitler fosfopenptid tespiti için başlıca girişimlerdir. Daha önce, fosfopenptitlerin bağlanmasını ortadan kaldırmak, ön fraksiyonasyon adım11'iatlayarak% 90'dan fazla zenginleştirme özgüllüğü elde etmek için IMAC yükleme tamponunun pH değerini ve organik asit konsantrasyonunu standartlaştırdık.
Fosfopenptid zenginleştirme ve fraksiyonasyonun çok adımlı sürecindeki numune kaybı fosfopenptid tanımlama hassasiyetini ve fosfoproteomik kapsamın derinliğini engeller. Durdur ve git ekstraksiyon ipuçları (aşama ipuçları), peptit fraksiyonasyonu ve temizliği için kromatografi ile birleştirilebilen ucun ucunu kaplamak için küçük diskler içeren pipet uçlarıdır17. Tüpler arasında numune aktarımı önlenerek kademe ucu işlemi sırasında numune kaybı en aza indirilebilir. Ga3+-IMAC ve Fe3+-IMAC'de, insan fosfoproteomunun derinliğini artıran tekil fosforilasyonlu peptitlerden düşük bol çoklu fosforillenmiş peptitleri ayırmak için aşama ipucunu başarıyla uyguladık15. Ek olarak, yüksek pH ters fazlı (Hp-RP) faz ucunun kullanımı, güçlü katyon değişimi (SCX) ve güçlü anion değişimi (SAX) kromatografisi18ile karşılaştırıldığında insan zarı proteomunun daha geniş kapsamını göstermiştir. Bu nedenle, IMAC ve Hp-RP kademe ucu tekniklerini entegre etmek, bitki fosfoproteom kapsamını basitlik, yüksek özgüllük ve yüksek verim ile artırabilir. Bu stratejinin Arabidopsis fidelerinden 20.000'den fazla fosforilasyon alanı tanımladığını ve bitki fosfoproteomunun gelişmiş bir derinliğini temsil ettiğini gösterdik19.
Burada, Arabidopsis'te fosfoproteomik profilleme için aşama ucu tabanlı fosfoproteomik bir protokol bildiriyoruz. Bu iş akışı, ozmotik strese yanıt olarak vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerinin fosfoproteomik pertürbasyonunu incelemek için uygulanmıştır. Fosfoproteomik analiz, kinaz aktivasyonu ve erken ozmotik stres sinyali ile ilişkili fosforilasyon bölgelerini ortaya çıkardı. Vahşi tip ve snrk2-dec mutant fosfoproteome verilerinin karşılaştırmalı analizi, yüksek bitkilerde osmore stres sinyallerinde kilit rol oynayan Raf benzeri bir kinaz (RAF)-SnRK2 kinaz kaskadının keşfine yol açtı.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tüp</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR temiz, renksiz, 100 tüp</td></tr><tr><td>200 ve mikro; L pipet ucu</td><td>Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-kloroasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>amonyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>amonyum fosfat monbasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>künt uçlu iğne</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Kel-F göbek (KF), nokta stili 3, ölçü 16</td></tr><tr><td>C18-AQ boncuk</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 & mikro; m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore disk</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CX1058</td><td></td></tr><tr><td>veri analiz yazılımı</td><td></td><td>Perseus 1.6.2.1</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr> <tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formic asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Frits</td><td>SPE Kartuşları için</td><td>Agilent</td><td>12131024</td> Frits</tr><tr><td>Guanidin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Demir (III) klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>kütle spektrometresi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>nano LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA spin sütunu</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>piston</td><td>Hamilton</td><td>1122-01</td><td>Piston tertibatı N, RN, LT, LTN model 1702 için (25 & mu; l)</td></tr><tr><td>arama motoru yazılımı</td><td></td><td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>https://www.maxquant.org</td></tr><tr><td>SEP-PAK Kartuş 50 mg</td><td>Sular</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamonyum bikarbonat tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis'te osmotik stres sinyali profili Çıkarmak için fosfoproteomik strateji

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein fosforilasyonu, ozmotik durum altında enzim aktivitesinin ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi için çok önemlidir. Kütle spektrometresi (MS) bazlı fosfoproteomik, bitki sinyali transdüksiyonunu inceleme şeklini dönüştürmüştür. Bununla birlikte, kapsama derinliğini elde etmek için çok sayıda başlangıç malzemesinin ve uzun ms ölçüm süresinin gerekliliği, bitkilerdeki küresel fosfoproteomik değişikliklerin yüksek verimli çalışması için sınırlayıcı faktör olmuştur. Bitki fosfoproteomiklerinin hassasiyetini ve verimini artırmak için, ozmotik strese yanıt olarak bitki fosforilasyon pertürbasyonunun hızlı ve kapsamlı analizi için Tandem Mass Tag (TMT) etiketlemesi ile birlikte dur ve git ekstraksiyonu (aşama) uç bazlı fosfoproteomik yaklaşım geliştirdik. Sahne ucu tekniğinin basitliğinden ve yüksek veriminden yararlanan tüm prosedür, fosfopenptid zenginleştirme, fraksiyonasyon ve numune temizleme adımlarını bitirmek için iki ipucu kullanarak yaklaşık bir saat sürer ve bu da yaklaşımın kullanımı kolay ve yüksek verimliliğini önerir. Bu yaklaşım sadece derinlemesine bir bitki fosfoproteomik analizi (> 11.000 fosfopenptid tanımlaması) sağlamaz, aynı zamanda bitişik kesirler arasındaki üstün ayırma verimliliğini (< % 5 örtüşme) gösterir. Ayrıca, vahşi tip ve snrk2 mutant bitkilerinin fosfoproteomik değişikliklerini ölçmek için TMT etiketlemesi kullanılarak çoklama sağlanmıştır. Bu yaklaşım, kara bitkilerinde erken ozmotik sinyalizasyonun anlaşılmasına ışık tutan ozmotik strese yanıt olarak Raf benzeri kinazların fosforilasyon olaylarını ortaya çıkarmak için başarıyla kullanılmıştır.

Bu iş akışının performansını göstermek için, 30 dakika boyunca mannitol tedavisi olan veya olmayan vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerindeki fosfoproteomik değişiklikleri ölçmek için Hp-RP aşama ucu fraksiyonasyonu ile birlikte IMAC aşama ipucundan yararlandık. Her örnek biyolojik üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve deneysel iş akışı Şekil 1'detemsil edildi. Her numunenin sindirilmiş peptitleri (400 μg) bir TMT-6plex kanalı ile etiketlendi, havuza alındı ve tuzdan arındırıldı. F...

Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis'te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Bu strateji, biyotik veya abiyotik streslere yanıt olarak bitki fosfoproteomlarının küresel değişikliklerini kapsamlı bir şekilde incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, kullanımı kolay ve yüksek verimli bir şekilde derinlemesine fosfoproteomik analize izin verir. IMAC aşama ucu hazırlığı için, bir propilen frit diske nüfuz etmek için 16 gauge künt uçlu bir iğne kullanın ve friti uca hafifçe bastırmak için bir piston kullanın.Ardından, 1,5 mililitrelik bir tüpe ters çevrilmiş bir nikel-NTA döndürme sütunu yerleştirin ve nikel-NTA boncuklarının fritini tüpe hafifçe bastırmak için pistonu kullanın. Fosfopeptit zenginleştirme için, bir IMAC aşama ucu kullanarak, nikel-NTA boncuklarına 400 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin ve tüm boncuk çözeltisi hacmini tek bir IMAC aşama ucuna yükleyin. Çözeltiyi santrifüjleme ile uçtan geçirin ve nikel iyonlarını santrifüjleme ile uçtan çıkarmak için 100 mikrolitre 50 milimolar EDTA yükleyin.Ucu santrifüjleme ile 100 mikrolitre yükleme tamponu ile muamele edin. Daha sonra, ucu santrifüjleme ile% 6 asetik asit içinde 100 mikrolitre 50 milimolar ferrik klorür ile muamele edin. Sahneyi santrifüjleme ile 100 mikrolitre yükleme tamponu ile koşullandırın.Ardından, numune peptitleri ile desteklenmiş 100 mikrolitre yükleme tamponu ile santrifüjleme yapılır. Santrifüjlemeden sonra, ucu yıkama başına 100 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez durulayın, ardından 100 mikrolitre yükleme tamponu ile bir durulama yapın. Santrifüjlemenin sonunda, IMAC aşama ucunun önünü kesmek için makas kullanın ve kesilmiş ucu yüksek pH, ters faz ucunun içine yerleştirin.Fosfopeptit fraksiyonasyonu için, yüksek pH'lı bir ters faz C18 aşama ucu kullanarak, santrifüjleme ile her iki aşama ucu katmanından 100 mikrolitre elüsyon tamponu geçirin. Dönüşün sonunda, IMAC aşama ucunu atmak için cımbız kullanın ve yüksek pH ters faz aşama ucuna 20 mikrolitre Tampon A ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, toplanan fraksiyona 20 mikrolitre Tampon 1 ekleyin ve elüatı santrifüjleme ile yeni bir tüpte toplayın.Sekiz fraksiyonun tümü toplanana kadar işlemi Tampon 2'den 8'e kadar tekrarlayın. Daha sonra her fraksiyonun son eluatını bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun. Bu temsili analizde, vahşi tip ve SnRK2 dekuple mutant örneklerinden sırasıyla toplam 8, 107 ve 7.248 Fosfopeptit tanımlandı ve bu, Arabidopsis'te sinyal iletiminin küresel görünümünü tanımlamak için derinlemesine kapsama alanı sağlamada iş akışının verimliliğini gösterdi.Sekiz fraksiyon boyunca tanımlanan fosfopeptit sayısının karşılaştırılması, ilk iki fraksiyonda birkaç fosfopeptidin varlığını ortaya çıkardı, ancak fosfopeptitlerin çoğunluğu son altı fraksiyon arasında eşit olarak dağıldı. Bu yaklaşımın önerilmesi, karmaşık fosfopeptitleri bitki fosfoproteomundan ayırma yeteneği sağlar. İki bitişik fraksiyon arasındaki fosfopeptitlerin örtüşmesinin değerlendirilmesi, fosfopeptitlerin% 5'inden daha azının bitişik fraksiyonlarda meydana geldiğini göstermiştir.Mannitol muamelesinden sonra, vahşi tip numunede 433 fosforilasyon bölgesi arttırıldı. SnRK2 dekuple mutant örneğinde 380 bölge arttırıldı. Bunlar arasında, 312 fosfosit yabani tipte indüksiyon gösterdi, ancak SnRK2 dec mutant bitkilerde göstermedi.Analizin daha iyi tekrarlanabilirliğini sağlamak için frit diski uçlara yüklemek için aynı miktarda basınç kullanmak önemlidir. Yakında, katyon değişim kromatografisi, bitki fosfoproteomunun daha geniş bir kapsamını elde etmek için zenginleştirilmiş fosfopeptitleri fraksiyonlamak için alternatif bir önlem olarak kullanılabilir.

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Floem sap bileşimi yanı sıra yükleme ve uzun mesafe taşıma mekanizmasının Bilgi bitki gelişimi ve stres / patojen yanıt olarak ve ulaşım asimile uzun mesafe sinyal anlaşılması için gereklidir. Bu el yazması EDTA-kolaylaştırdı yöntemi kullanılarak floem eksuda toplanması açıklar.

Toplanması ve analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floem EDTA-kolaylaştırdı Yöntemi eksuda

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

Burada stres altında izole kloroplastların içine protein ithalat incelemek için yeni bir yöntem tarif. yöntemi hızlı ve basittir ve kloroplast protein alma için farklı stres koşullarında sonuçlarını ve ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için uygulanabilir.

Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Basit, çok yönlü ve düşük maliyetli vitro hydroponic sistemi başarılı bir şekilde, Steril koşullar altında büyük ölçekli deneyler etkinleştirme optimize edildi. Bu sistem bir çözüm ve moleküler, biyokimyasal ve fizyolojik çalışmalar için kökleri tarafından verimli kendi emilimi kimyasal uygulama kolaylaştırır.

Küçük moleküllere steril koşullarda bitki yanıt-e doğru değerlendirmek için Hydroponic sistemi esnek bir düşük maliyetli

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Öğrenin, Arabidopsis'te osmotik stres sinyallerini incelemek için yüksek verimli fosfoproteomik yöntemini. Bu teknik, bitki fosfoproteomunun kapsamlı analizini sağlar.

Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji

Daha fazla video keşfet