Name: Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Öğrenin, Schwann hücre fenotipini değerlendirmek için hücre dışı matriks mikroortamlarını nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, sinir sistemi rejenerasyonu araştırmalarında biyomateryal tasarımına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle Cincinnati Üniversitesi'nden fon desteği kabul. Yazarlar da Ron Flenniken Cincinnati Üniversitesi Gelişmiş Malzeme Karakterizasyon laboratuvarı destek için teşekkür ederiz.

1. Tunable hücre kültürü substrat hazırlama ve karakterizasyonu
<ol><li>Substrat hazırlama
	<ol>
<li>10:1 ile 60:1 arasında bir oranda pipet ucu kullanarak PDMS baz elastomer ve kür ajanlarını karıştırın, kabarcıklar karışım içinde homojen bir şekilde dağılına kadar. Kabarcıklar dağılına kadar vakum desiccation kullanarak kabarcıklar kaldırın. NOT: PDMS polimerizasyonu sırasında, son polimer istenilen mekanik özellikleri sağlamak için baz elastomer ile kür ajan çapraz bağlantılar. Çapraz bağlantı oranları, PDMS sertliğini değiştirmek için ayarlanabilir.</li>
		<li>Bir kare veya dairesel kapak lı (örneğin, 22 mm x 22 mm) üzerine kurutulmuş PDMS karışımıbir damla (~0,2 mL) yerleştirin ve 30 s için 2500 rpm bir spin coater üzerinde coverslip döndürün.</li>
		<li>PDMS'nin katılaması için kapak kaymasını 60 °C'de 1-2 saat veya oda sıcaklığında bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Yüzey hidrofililiğini artırmak için 7 dk (UV dalga boyu: 185 nm ve 254 nm) uv-ozon temizleyici kullanarak coverslip'i tedavi edin. Sterilize edilmiş 6 kuyulu bir tabağa koyun.</li>
		<li>Hücre kültürü için kullanmadan önce, en az 30 dakika boyunca% 70 etanol inkübasyon yüzeyler. DİkKAT: UV-Ozon temizleyici insanlar için zararlı ozon üretebilir. Kimyasal bir duman kaputunda veya bir çeşit havalandırma ile çalışın.</li>
		<li>37 °C'de steril bir kuluçka makinesinde 60 dakika boyunca protein çözeltisine (10 μg/mL kollajen I, fibronektin veya laminin) kapak lar batırın. NOT: UV-Ozon tedavisi nin ardından PDMS yüzeyi hala hidrofobik olabilir. Her coverslip protein çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olmak için kuyu plakası döndürün.</li>
		<li>Protein çözeltisini aspire edin ve kapak kaymasını fosfat tamponlu salin (PBS) 3x ile yıkayın.</li>
		<li>RT4-D6P2T Schwann hücre hattını (SCs) ticari olarak kullanılabilir EDTA çözeltisi (1x) kullanarak %2,5 tripsin içeren çanak geçişinden uzaklaştırın ve hemositometreli hücreleri sayın. İstenilen hücre yoğunluğunda taşınabilir PDMS yüzeyinde tohum C'leri. SC tohumlama yoğunlukları her farklı uygulama için değişebilir.</li>
		<li></li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li> <ol><li><li> </li><li><li></li></ol></li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li> </li><li></li><li><li></li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61496/61496equ01.jpg"></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li><li> </li><li> </li><li><li><li><li></li><li><li><li><li><li></li><li>&amp; </li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li></li><li></li><li></li><li><li> </li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li></ol>

Yazarlar tarafından olası bir çıkar çatışması bildirilmedi.

SCs onların phenotipik dönüşüm ve sinir yaralanması aşağıdaki rejeneratif potansiyel nedeniyle sinir rejenerasyonu teşvik edebilir. Ancak, ECM ipuçlarının bu rejeneratif kapasiteyi nasıl düzenlediği çoğunlukla belirsizliğini korumaktadır ve bu da sadece sinir rejenerasyonu yla ilgili biyomalzemelerin geliştirilmesini değil, aynı zamanda sinir yenilenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılmasını da engellemektedir. Bu etkileşimi incelemeye başlamak için, sertlik, protein kaplama ve yapışkan topografya gibi ECM ipuçlarının...

Periferik sinir sistemi (PNS) yaralanmaları hastalar için yaşam kalitesini tehlikeye atarak ve sosyoekonomik faktörlerin çok sayıda ile önemli bir etki yaratarak sağlık önemli bir klinik sorun olmaya devam etmektedir1,2. Schwann hücreleri (SC), PNS'deki başlıca glial hücreler olarak, PNS rejenerasyonuna neden olmak ve kısa boşluk yaralanmalarında fonksiyonel iyileşmelere yardımcı olmak için gerekli moleküler ve fiziksel ipuçlarını sağlar. Bunun nedeni, SC'lerin miyelinating veya Remak fenotip3'ten"onarım" hücre fenotipine ayrıştırma yeteneğine sahip olmasıdır. Onarım SC çeşitli şekillerde ayırt edici bir hücre fenotip. Yaralanmadan sonra, SC'ler hücre döngüsüne yeniden girerek çoğalma hızlarını artırır lar ve reinnervasyonu kolaylaştırmak için çeşitli transkripsiyonel faktörlerin ekspresyonuna başlarlar. C-Jun ve p75 NTR gibi bu faktörler, miyelin temel protein (MBP) gibi miyelinating SC belirteçleri, downregulated4,,5ise upregulated vardır. Buna ek olarak, SCs uzun olmak için morfolojideğiştirmek ve yaralanma site6genelinde Büngner bantları oluşturmak için birbirleri ile hizalanmış . Bu aksonlar için doğru distal hedef7genişletmek için fiziksel bir rehberlik mekanizması sağlar. Ancak, SCs kısa boşluk yaralanmalarında sinir rejenerasyonu teşvik etmek için sahip yeteneğine rağmen, fonksiyonel iyileşme sonucu ciddi yaralanmalarda kötü kalır. Bu kısmen ekstrasellüler matriks kaybı nedeniyle (ECM) rehberlik ipuçları, hem de uzun süreler boyunca rejeneratif fenotip korumak için SCs yetersizlik8.
Sinir rejenerasyon ve iyileşme süreci yakından yaralanma sonrasında bazal lamina durumuna bağlıdır. Bazal lamina rehberlik kolaylaştırır ve yaralanma9aşağıdaki bozulmadan kalır durumlarda akson ve SCs için ECM bağlı ipuçları sağlar sinir etrafında ECM bir tabakadır . ECM durumu ve hücrelere matris bağlı ipuçları sunmak için yeteneği hayati önem taşımaktadır ve daha önce farklı bağlamlarda çeşitli araştırılmıştır10,11,12,13,14. Örneğin, ECM sertliği gibi çoğalma ve farklılaşma11,,15,16gibi hücre fonksiyonları rehberlik göstermiştir. ECM bileşimi de farklı bir hücresel yanıt yol açabilir ve hücre içi sinyal yolları 17 ile göç ve farklılaşma gibi hücre davranışlarını düzenleyen17,18. Ayrıca, hücre morfolojisi, yayılma alanı ve hücresel uzama da dahil olmak üzere, fonksiyonudüzenleyen önemli bir rol oynamaktadır ve ECM bağlı ipuçları tarafından yönetilebilir19,20. Birçok önceki çalışmalarda kök hücrelerin tanımlanmış soylara farklıştırılması üzerinde duruldu, henüz SCs bir homeostatik fenotipi değiştirmek için benzer bir yeteneğe sahip, sağlıklı bir sinir içinde yetişkin SC, bir onarım SC protein ve büyüme faktörleri salgılama yeteneğine sahip ise Sinir yaralanması aşağıdaki ECM remodeling5,21. Bu nedenle, özellikle doğuştan Gelen SC rejeneratif kapasite ve ECM bağlı ipuçları arasındaki ilişkinin altında yatan mekanizmaları belirlemek için sonuçta sinir rejenerasyonu için bu kapasiteyi koşum içgörü için çok önemlidir.
Bu sorunu çözmek için, mekanik sertlik ve ligand tipinin fizyolojik olarak uygun aralıklarda kolayca ayarlanabildiği bir hücre kültürü alt katmanı üretmek için ayrıntılı bir metodoloji geliştirdik. Polidimethyl siloksan (PDMS) poliakrilamid jel ile karşılaştırıldığında son derece table mekaniği nedeniyle bir substrat olarak seçildi, maksimum Genç modülü yaklaşık 12 kPa yaklaşık 1000 kPa22,,,24PDMS tezat .23 Bu eldeki çalışma için yararlıdır, son çalışmalar bir tavşan siyatik sinir Young modülü göstermiştir gibi gelişme sırasında 50 kPa aşabilir, böylece PNS içinde sinirlerin sertlik aralığı daha önce incelenen daha geniş olduğunu düşündürmektedir. Farklı proteinler, mekanik ve ligandların SC davranışı nın kombinatoryal regülasyonlarını analiz etmek için PDMS yüzeyleri üzerine adsorpsiyon yapabilme yeteneğine sahiptir. Bu, PNS rejenerasyon sürecinde bulunan birden fazla mikroçevresel ipuçlarının araştırılmasına ve sadece25. Ayrıca, bu mühendislik hücre kültürü substratları immünohistokimya, batı lekeve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (q-PCR) gibi çok sayıda kantitatif analiz yöntemi ile uyumludur.
Bu tasarlanmış hücre kültürü platformu, her ECM'ye bağlı sinyalin bireysel ayarı yüksek düzeyde nedeniyle mekanistik yolları analiz etmek için son derece uygundur. Buna ek olarak, mikrotemas baskı da dahil olmak üzere hücre mikrodesenleme için popüler yöntemler, diğer ECM bağlı ipuçları 24 ile ilgili olarak hücre şeklini analiz etmek için kontrollü hücresel yapışma sağlamak için yüzeyler üzerinde elde edilebilir24. Bu çok önemlidir, çünkü hücre popülasyonlarında uzamayı teşvik eden çizgi desenli yüzeyler, sinir rejenerasyonu sırasında Büngner bantları içindeki uzamış ve rejeneratif SC'leri taklit etmek ve incelemek için bir araç sağlar. Ayrıca, hücresel morfoloji birden fazla hücre fonksiyonlarının güçlü bir düzenleyici ve potansiyel olarak26,,27kontrollü değilse şaşırtıcı deneysel sonuçlar tanıtabilir. ECM ipuçları28,29,,30tarafından düzenlenen olarak SC rejeneratif fenotip yöneten mekanizmalar şimdi önemli dikkat sağlanmaktadır. Bu PNS sinir rejenerasyonu yardım için sinir rehberlik kanalları olarak uygulanabilir biyomalzemelerin tasarımı içine fikir sağlamak için gereklidir. Bu ayrıntılı protokoller sonuçta ECM bağlı ipuçları tarafından düzenlenen SC ve diğer hücre tipi fonksiyonunun mekanizmaları deşifre etmek için potansiyel bir araç olarak uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Sığır Serumu (BSA) Albümini, Texas Kırmızı eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A23017</td><td>Mikro desenleri göstermek için BSA boyama</td></tr><tr><td>Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı Antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>7076S</td><td>Western blot analizi için kullanılan antikor</td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı Antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>7074S</td><td>Western blot analizi</td></tr> <tr><td>için kullanılan antikorBrdU</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B23151</td><td>Hücre proliferasyonunu ölçmek için kullanılan reaktif</td></tr><tr>Alexa Fluor 488 <td>Thermo Fisher Scientific</td> ile<td>konjuge BrdU birincil antikoru</td><td>B35130</td><td>Hücre proliferasyon deneylerinde BrdU'yu görselleştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Kollajen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01</td><td>Lamelleri kaplamak için kullanılan protein</td></tr><tr><td>Sıkıştırma kuvveti test makinesi</td><td>Test Kaynakları</td><td></td><td>Polimerlerin mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılan cihaz</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Hücre kültürü ortamı ek</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>Lamelleri kaplamak için kullanılan protein</td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78440</td><td>Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>Lamelleri kaplamak için kullanılan protein</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36971</td> ile montaj ortamı <td>Lamel montaj aparatı ve çekirdek boyama</td></tr><tr><td>Fare c-Jun birincil antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711202</td><td>C-Jun proteinini görselleştirmek için birincil antikor</td></tr><tr><td>Fare ve beta;-Aktin birincil antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>3700S</td><td>Western blot deneyleri için yükleme kontrolü</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Hücre kültürü ortamı ek</td></tr><tr><td>Fotorezist SU 2010</td><td>KAYAKU</td><td>SU8-2010</td><td>Fotorezist</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2443</td><td>Spesifik olmayan protein bağlanmasını engelleyin</td></tr><tr><td>Tavşan c-Jun birincil antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9165S</td><td>C-Jun proteininin görselleştirilmesi için birincil antikor</td></tr><tr><td>Tavşan miyelin temel protein birincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab40390</td><td>Görselleştirme için birincil antikor MBP</td></tr><tr><td>Tavşan p75NTR birincil antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>8238S</td> p75NTR Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415'in <td>görselleştirilmesi için birincil antikor</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Hücre hücre iskeleti</td></tr><tr><td>RIPA tamponunun</td> görselleştirilmesi <td>Abcam</td><td>ab156034</td><td>Hücre lizis tamponu</td></tr><tr><td>RT4-D6P2T Schwann hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-2768</td><td>Kullanılan hücre hattı deneyler</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 PDMS baz ve kürleme maddesi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td>Lamelleri kaplamak için kullanılan ayarlanabilir polimer</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090-046</td><td>Hücre ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>UV-Ozon temizleyici</td><td>Novascan</td><td></td><td>PDMS'nin hidrofisilitesini artırın</td></tr><tr><td>Versene (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>Hücre ayrışması reaktif</td></tr></tbody></table>

schwann hücre fenotip spesifikasyonunu değerlendirmek için hücre dışı matriks mikroortamlarının hazırlanması

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Travmatik periferik sinir sistemi (PNS) yaralanmaları şu anda tam fonksiyonel iyileşme yitirmek için uygun tedaviler eksikliği. Schwann hücreleri (SCs), PNS önemli glial hücreleri olarak, yaralanma sonrasında bir rejeneratif hücre fenotip içine dedifferentiating tarafından PNS rejenerasyon teşvik hayati bir rol oynamaktadır. Ancak, SCs defarklılaştırılmış devlet rejenerasyon için gerekli zaman dilimi boyunca korumak için zor ve çevreleyen ekstrasellüler matris (ECM) değişikliklerden etkilenir. Bu nedenle, SC'lerin rejeneratif potansiyeline ilişkin ipuçları sağlamak için SC'ler ile farklı ECM arasındaki karmaşık etkileşimin belirlenmesi esastır. Bunu gidermek için, farklı ECM proteinlerinin sertlik ve protein bileşiminin modüle edilebildiği bir platform sağlayan, ölçülü polidimetilsiloksane (PDMS) substratına adsord edildikleri bir strateji oluşturuldu. SC'ler ölçülebilir yüzeylere tohumlanmış ve SC fenotipinin dinamiklerini temsil eden kritik hücresel fonksiyonlar ölçüldü. SC protein ekspresyonu ile hücresel morfoloji arasındaki etkileşimi göstermek için, bireysel mikrotemas baskılı hücresel desenlere ek olarak SC'lerin farklı tohumlama yoğunlukları kullanıldı ve immünfloresans boyama ve batı lekesi ile karakterize edildi. Sonuçlar, daha küçük yayılma alanı ve hücresel uzama daha yüksek ölçüde olan hücrelerin sc rejeneratif phenotipik belirteçleri daha yüksek düzeyde teşvik gösterdi. Bu metodoloji sadece ECM ve SCs hücresel fonksiyonu arasındaki önemli ilişkiyi çözmek için başlar, ama aynı zamanda periferik sinir onarım biyomalzemelerin gelecekteki optimizasyonu için kurallar sağlar.

SC fenotipüzerinde substrat sertliği ile protein bileşimi arasındaki etkileşimi analiz etmek ve ölçmek için, bir pdms hücre kültürü alt tabakası geliştirilmiştir(Şekil 1A). Polimerin farklı tabanda sıkıştırma testi: genç modülünün (E) substratını ölçmek için kür ajan oranları kullanılmıştır(Şekil 1B). Ortaya çıkan modül değerleri fizyolojik olarak ilgili substrat koşullarını temsil eder. Substratların hazırlanmasından sonra, SC'ler kültürlü ve hücresel özellikle...

Bu metodoloji, substrat sertliği, protein bileşimi ve hücre morfolojisi gibi hücre dışı matris ipuçlarının Schwann hücresi (SC) fenotipini düzenleyen mekanizmalarını göstermeyi amaçlamaktadır.

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Bu protokol, sertlik, protein bileşimi ve hücre morfolojisi gibi hücre dışı matriks özelliklerinin tam olarak uygun maliyetli ve kolay bir şekilde kontrol edilebildiği bir hücre kültürü platformu sağlar. Yöntem uygun maliyetlidir ve özel eğitim veya tesisler gerektirmez. Ayrıca immünoresan boyama ve batı leke gibi birden fazla hücresel nicelik yöntemleri ile uyumludur.Bu teknik Schwann hücre biyolojisi mekanistik bir anlayış sağlar. Sinir sistemi rejenerasyonu için biyomalzeme tasarımı içine ek anlayış ile, herhangi bir ankraj bağımlı hücrelere uygulanabilir. Bu protokolün en zorlu kısmı, mikrotemas baskı.Protokolün başlangıcından önce, proteini etiketlemek için bir floresan kullanarak substrat üzerine mikrotemas baskısı, desendeki son baskıyı görsel olarak doğrular. PDMS baz elastomerve kür ajanlarını pipet ucuyla karıştırarak başlayın, kabarcıklar karışım içinde homojen bir şekilde dağılına kadar. Sonra vakum desiccation ile kabarcıklar kaldırın.Kurutulmuş PDMS karışımından bir damlayı kare veya dairesel bir kapak kaymasına yerleştirin ve coverslip'i 2, 500 rpm'de 30 saniye boyunca döndürün. Kapak kapağını 60 derecede, bir ila iki saat veya bir gece oda sıcaklığında bir fırında kuluçkaya yatırın. Mikro desenli bir substrat hazırlamak için, 15 milimetre yüksekliğinde Petri çanak dairesel 150 milimetre çapında içine desenli silikon gofret yerleştirin ve gofret üzerine gazdan arındırılmış PDMS dökün.PDMS'yi bir gecede 60 derecede fırında katılaştırdı. PDMS'nin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Sonra silikon gofret zarar vermemeye dikkat ederek doğru desenler içeren 30 tarafından 30 milimetre kareler pulları kesmek için bir cerrahi neşter kullanın.PDMS pullarını ve ayarlanabilir kapak fişlerini 30 dakika boyunca %70 etanolle batırarak sterilize edin. Mikro desenin etkinliğini doğrulamak için, pulun tüm desenli tarafını kapsayacak şekilde filtrelenmiş hava akımı ve mililitre BSA çözeltisi başına pipet 15 mikrogram kullanarak PDMS pullarının yüzeyini kurulayın. Protein adsorpsiyonuna izin vermek için oda sıcaklığında bir saat bsa solüsyonu ile pulları kuluçkaya yatırın, ardından BSA çözeltisini çıkarmak için pulları hava kurutun.Ayarlanabilir kapak fişlerinin yüzeyini kurutmak için filtrelenmiş hava akışını kullanın. Pulun desenli tarafını, kapak yüzeyinde BSA adsorpsiyonuna izin vermek için ayarlanabilir kapak lı kapaklı ile conformal temasa getirin ve pulu coverslip'e beş dakika boyunca hafifçe bastırın. FITC filtreli floresan mikroskobu kullanarak mikro deseni inceleyin.Floresan desenler yerine hücre yapışkan alanları yazdırmak için BSA proteini için laminin yerine. Kapak fişlerinden pulları çıkarın ve kapak fişlerini sterilize edilmiş altı kuyulu bir tabağa aktarın. Kapak kayma yüzeyini kapsayacak şekilde her kuyuya % 0.2 Pluronic F-127 çözeltisi iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca plaka kuluçka.F-127 çözeltisini aspire edin ve kapak fişlerini beş kez PBS ile yıkayın, bir kez hücre kültürü ortamı ile, sonra Schwann hücrelerini santimetre kare1000 hücre lik bir tohumlama yoğunluğunda tohumlayın. Hücre tohumlamadan 45 dakika sonra, hücre kültürünü n içini kaldırın ve birden fazla hücrenin aynı modele yapışmasını önlemek için kapak fişlerini PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri nicelemeden önce 48 saat boyunca istenilen hücre kültürü ortamında koruyun.Hizalanmış hücreleri incelemek için çizgi desenli hücre kültürü yüzeyleri oluşturmak için, pulları el yazması yönlere göre yapın ve istenilen boyutlara doğru kesin. Daha önce açıklandığı gibi ayarlanabilir BIR PDMS yüzeyi ile kaplanmış iki Petri çanak hazırlayın ve tabaklardan birine çizgi desenli hücre yapıştırıcı alanlarını yazdırmak için mikro temaslı baskı yapın. Pulları çıkardıktan sonra Petri kabını %0,2 pluronic F-127 çözeltisinin dört mililitresi ile doldurun ve bir saat kuluçkaya yatırın.PDMS damgasının her iki tarafını %70 etanolile üç kez durulayın ve havayla kurulayın. PDMS damgalarını döndürün ve daha önce açıklandığı gibi ikinci Petri kabına desensiz hücre yapıştırıcı alanını yazdırın. F-127 solüsyonu ile bulaşıkları kuluçkaya yatırdıktan sonra, çözeltiyi çıkarın ve pbs ile üç kez ve bir kez taze hücre kültürü ortamı ile yıkayın.Daha sonra tabakların üzerine tohum hücreleri ve lysates hazırlamadan önce 48 saat boyunca istenilen koşullarda muhafaza. Lysates hazırlamak için, iki dakika boyunca buz gibi PBS ile hücreleri yıkayın, sonra her hücre yapışkan alana, el yazması talimatlara göre hazırlanan RIPA çözeltisi 80 mikrolitre ekleyin ve 25 dakika boyunca bir buz bloğu üzerinde hücreleri kuluçka. Schwann hücrelerini hücre kazıyıcısıyla beş dakika kazıyın ve lysat'ı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.12 bin kez G ve dört santigrat derece 15 dakika lysate santrifüj. Supernatant toplamak ve temiz bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Lamina kaplı substratlar kollajen ve fibronektin kaplı substratlara göre daha yüksek proliferasyon oranı ile sonuçlandı.Lamina kaplamalı ve farklı modülli substratlarda bulunan Schwann hücreleri, nispeten daha yumuşak yüzeylerin hücre çoğalma oranlarını azalttığını göstermiştir. Hücreler de protein ekspresyonu için analiz edildi. Transkripsiyonel faktör c-Jun ekspresyonu substratlar daha yumuşak hale geldikçe yükseltildi.Ancak, yumuşak yüzeylerde önemli ölçüde aşağı düzenlenmiştir. Sert yüzeylerde, kollajen kaplı yüzeyler en yüksek c-Jun ifadesi ile sonuçlandı, substratlar daha yumuşak hale geldikçe, laminin c-Jun'un en yüksek seviyelerini gösterdi. Hücreler daha sonra c-Jun ifadesinde hücre yayılımı ve alan rolünü keşfetmek için rhodamine-phalloidin ile boyandı.Hücre kültürü alt tabakalarında hücre yapışkan çizgileri oluşturulduğunda, desen alt tabakasında tohumlanan hücrelerin nükleer en boy oranı, desensiz substratlar üzerindeki hücrelere kıyasla artmıştır. Hem c-Jun hem de p75 nörotrofin reseptörünün ekspresyonu daha küçük yayılma alanına sahip yoğun hücrelerde düzenlendi. Çizgi desenli hücreler de desensiz hücrelere kıyasla hem c-Jun hem de p75 NTR'nin daha yüksek bir ekspresyonu ile sonuçlandı.Hücre yayılma alanını ve uzamasını tam olarak kontrol etmek ve hücre etkileşimlerini ortadan kaldırmak için mikrotemas baskılı hücre yapıştırıcı geometrileri oluşturuldu. Hücresel enboy oranının artırılması nükleer uzamanın artmasına neden oldu. C-Jun ekspresyonu hem hücresel uzama hem de hücre yayılma inhibisyonu ile düzenlendi.Hem çekirdekler hem de aktin için immünoresans boyama, hücre yayılma alanı ve uzaması bu mikro desenleme yöntemi ile tam olarak kontrol edildiğini doğruladı. Bu teknik, schwann hücre biyolojisini ve sinyalizasyonu rejenerasyon ve kanser bağlamında mekanik olarak analiz etmek için bir yöntem olarak tunable substratlarımızı kullanmanın bir yolunu açmıştır.

preparation-tunable-extracellular-matrix-microenvironments-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

Hücresel fonksiyonları üzerinde mikro moleküler bileşim etkileri ilgili bilgi sağlamak için bir kombinatoryal fonksiyonel tarama yöntemi tarif edilmektedir. Yöntemi hücre yapışması ve fonksiyonel analiz destekleyen tanımlı Kombinatoryal mikroçevrelerde diziler oluşturmak için varolan mikroarray tabanlı teknolojileri yararlanır.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

Bu videoda, multipotent kemik iliği stromal hücrelerinden (BMSC'ler) Schwann hücresi benzeri hücreler elde etmek için bir yöntem gösterilmektedir. Başlangıçta, BMSC'ler hipoksi tedavisine tabi tutulur, ardından nöronal progenitör hücrelere yönlendirilmiş farklılaşma gelir. Daha sonra, bu progenitör hücrelerin Schwann hücresi benzeri hücrelere dönüşümünü indüklemek için spesifik ortam ve kültür koşulları kullanılır.

Kemik İliği Stromal Hücrelerinden Schwann Hücresi Benzeri Hücrelerin Üretilmesi

Video, dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının Schwann hücreleri ile birlikte kültürlenmesini göstermektedir. DRG nöronları ilk olarak hizalanmış akson büyümesi için önceden gerilmiş bir zar üzerinde büyütülür. Daha sonra aksonlara bağlanan, onları izole eden ve nöral hücre sağkalımını ve işlevini destekleyen Schwann hücreleri tanıtılır.

Schwann Hücrelerinin Önceden Gerilmiş Bir Zar Üzerinde DRG Nöronları ile Ko-Kültürü

Video, hücre fenotip spesifikasyonunu incelemek için mikro desenli bir substratın hazırlanmasını açıklar. Mikro deseni PDMS kaplı bir lamel üzerine aktarmak için protein kaplı mikro desenli bir PDMS damgası kullanılır. Lamel daha sonra istenmeyen yüzeylerde hücre yapışmasını engellemek için bir yüzey aktif madde ile muamele edilir. Hücreler daha sonra desene yerleşmek için eklenir ve daha fazla analiz için inkübe edilir.

Schwann Hücre Fenotiplerini İncelemek için Mikrodesenli Bir Substratın Hazırlanması

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC'ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.

Olgun Schwann Hücrelerinin Üretimi İçin Bir Kaynak Olarak Kemik İçi Türe Göre Progenitör Hücrelerin Hipoksik Ön Koşullandırma

Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Öğrenin, Schwann hücre fenotipini değerlendirmek için hücre dışı matriks mikroortamlarını nasıl hazırlayacağınızı. Bu yöntem, sinir sistemi rejenerasyonu araştırmalarında biyomateryal tasarımına katkı sağlar.

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Daha fazla video keşfet