Name: Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Öğrenin, fare böbrek-resident CD8+ T hücrelerini akış sitometri analizi için izole etme yöntemini. Bu teknik, enfeksiyon sonrası efektör ve hafıza T hücre yanıtlarını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe AI125701 ve AI139721, Kanser Araştırma Enstitüsü CLIP programı ve Amerikan Kanser Derneği hibe RSG-18-222-01-LIB n.z tarafından desteklenir. Flow Sitometri Tesisi'nden Karla Gorena ve Sebastian Montagnino'ya teşekkür ederiz. Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'nde oluşturulan veriler San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSCSA), NIH/NCI hibe P30 CA054174-20 (UTHSCSA'daki Klinik ve Çeviriaraştırma Merkezi [CTRC] ve UL1 TR001120 (Klinik ve ÇeviriBilim Ödülü) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokole göre yapılan tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan tüm prosedürler IACUC UT Health San Antonio tarafından onaylanmıştır.
1. P14 T hücrelerinin C57BL/6 alıcılarına ve LCMV enfeksiyonuna benimsendirici transferi
<ol><li>6-12 haftalık kenP14 farelerini kullanın. Donör P14 TCR transgenik farenin cinsiyetinin C57BL/6 alıcı farelerinin cinsiyetine uygun olduğundan emin olun. Aksi takdirde, erkek T hücreleri gibi kadın farelere transfer hücreleri yaklaşık 12 gün içinde dolaşan donör T hücrelerinin bağışıklık aracılı reddi neden olur14.</li>
	<li>Üreticiprotokolünden sonra fare CD8+ T hücre saflaştırma kiti nikullanarak p14 TCR transgenik farenin dalak ve lenf düğümlerinden saf CD8+ T hücrelerini arındırın.<ol>
<li>Kısaca, dalak ve lenf düğümleri incelemek, tek hücreli süspansiyon oluşturmak için örnekleri püre.</li>
		<li>Naif T hücreleri için zenginleştirmek için, ilk antikor kuluçka adım sırasında biotin-anti-CD44 antikor ekleyin13. NOT: Bu adımda kullanılan negatif seçim ticari kiti kuluçka iki adım için iki ana bileşeni içerir (yani, biotin-antikor karışımı kuluçka ve streptavidin-manyetik boncuk kuluçka).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve kuyruk damarı ile eşleşen Her cinsiyete 200 μL PBS'de 1.000 ila 10.000 saflaştırılmış P14 T hücresi enjekte edin. NOT: Ayrıntılı kuyruk ven enjeksiyon protokolü adım 2'de tanımlanmıştır.</li>
	<li>Ertesi gün, tüm C57BL/6 alıcıları intraperitoneal bir rota ile 200 μL PBS seyreltilmiş 2 x 105 pfu LCMV Armstrong alırsınız.</li>
</ol>2. CD8+ T hücrelerinin intravasküler etiketleme
NOT: Araştırma ilgi alanlarına bağlı olarak enfeksiyon sonrası farklı zaman dilimleri seçilebilir. Gün 30 post enfeksiyon bir örnek (gün 30 sonra adım 1.4) genellikle CD8 T hücre yanıtı için erken bir bellek zaman noktası olarak kabul edilir gösterilmiştir.
<ol><li>PBS'de biotin anti-CD8α antikorlarını 15 μg/mL'ye seyreltin. Her farenin 3 μg antikor içeren 200 μL PBS aldığından emin olun. NOT: Biotin anti-CD8 antikor son FACS boyama paneli tasarımı için daha esnek olacak, böylece burada kullanılır. Floresan boya etiketli antikor doğrudan kullanılabilir. Ancak, intravenöz etiketleme ve FACS boyama için monoklonal antikorların farklı klonları kullanmak önemlidir.</li>
	<li>Düzgün damarları dilate için 5-10 dakika için bir havai ısı lambası ile farelerin kuyruk damar ısı. NOT: Hayvanların aşırı ısınmasını önlemek için ekstra özen izlenmelidir. Fareler hareket etmek için durduysa ısıyı azaltın veya ısı lambasını çıkarın.</li>
	<li>Önceden seyreltilmiş anti-CD8α antikor karışımının 200 μL'ini 100 U insülin şırıngasına (28G) çekin ve pistonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını çıkarın. İğne ve şırınga arasında 150° açı oluşturmak için iğneyi bükün, böylece iğne damara paralel olacak.</li>
	<li>Uygun boyutta bir kemirgen dizginleyici ile fareyi dizginlemek ve damar açıkça görünür hale getirmek için% 70 etanol ile kuyruk sprey. NOT: Kısıtlama süresi minimumda tutulmalıdır.</li>
	<li>Baskın olmayan elin başparmak ve orta parmakları ile distal ucunda kuyruk tutun. İşaret parmağını iğnenin takAcağı yerin altına yerleştirin.</li>
	<li>Şırıngayı baskın el ile tutun ve iğneyi kalbin yönüne paralel olarak damara takın. NOT: Doğru yerleştirirken, iğne damariçine düzgün hareket etmelidir.</li>
	<li>Kuyruk damarı üzerinden 200 μL anti-CD8α antikor enjekte edin. NOT: Kuyruktaki iğnenin üzerinde bir direnç veya beyaz bir alan görülürse, iğne damarın içinde değildir. İlk enjeksiyonu kuyruğun ucuna yakın başlatın. Gerektiğinde, sonraki enjeksiyonlar için kuyruğun altına doğru ilerleyin.</li>
	<li>İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar hafifçe sıkıştırma uygulayın.</li>
	<li>Fareyi kafese geri döndürün ve 3-5 dk sonra fareyi ötenazi edin. NOT: Fareler izofluran odası ve ardından servikal çıkış yoluyla ötenazi yapılmalıdır. CO2 inhalasyonu gibi diğer yöntemler 5 dakika kadar sürer ve intravenöz antikor etiketleme süresinin gereksiz değişimine neden olabilir.</li>
	<li>Makas kullanarak böbreği inceleyin, tüm böbreği 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneleri daha fazla işleme konana kadar buzda bırakın. NOT: Bozulmamış tüm böbrek güvenli bir şekilde sonraki işleme ve sindirim önce birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.</li>
</ol>3. Böbrek enzimatik sindirim
<ol><li>Her fare için 3mL sindirim çözeltisi (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Kollajenaz B) içeren 6 kuyu plakası hazırlayın, buz üzerinde saklayın. NOT: Stok kollajenaz B çözeltisi daha yüksek konsantrasyonda (örn. 20x) -20°C'de veya altında hazırlanabilir ve saklanabilir. Çalışma çözümü taze olarak hazırlanmalıdır. Geçerli protokolde kullanılan tüm çözüm/arabellek tarifleri için lütfen Tablo 1'e bakın.</li>
	<li>1,5 mL mikrosantrifüj numune tüplerine 300 μL sindirim çözeltisi ekleyin ve böbrek örneklerini düz bir yay makasla dolayın. NOT: Böbrek dokusu 1,5 mm'den büyük olmayan boyutlarda eşit parçalar halinde doğrılmalıdır. Decapsulation adım gereklidir.</li>
	<li>Kıymalı böbrek örneklerini sindirim çözümlü içeren 6 kuyu plakasına aktarın NOT: 6 kuyu plakası sadece işlenecek birden fazla örnek olduğunda kolaylık sağlamak için kullanılır.</li>
	<li>Numuneleri 37 °C'de 45 dakika boyunca hafif sallayarak (yaklaşık 60 rpm) kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Sindirimden sonra, doğrudan çanak içinde bir 3 mL şırınga piston flanş ile doku püre, ve 15 mL konik tüpler içine transfer. NOT: Canlı lenfositlerin arıtılması için yanında yoğunluk gradyan santrifüjü yapıldığından, genellikle hücre süzgecinden filtrasyon gerekli değildir.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk için 500 x g'de numuneleri aşağı doğru çevirin.</li>
	<li>RPMI/10% FCS 3 mL pelet resuspend.</li>
</ol>4. Sindirilmiş böbreklenfositler zenginleştirmek için yoğunluk gradyan santrifüj
<ol><li>Numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya çevirin.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve 5 mL ile hücre pelet resuspend 44% Percoll / RPMI karışımı (%44 Percoll + 56% RPMI FBS olmadan).</li>
	<li>3 mL içeren 3 mL'lik pipetin ucunu %67 Percoll/PBS (%67 Percoll + %33 PBS) doğrudan her tüpün altına koyun ve ağır çözeltinin (%67 Percoll/PBS) alt tabakada ayrı bir tabaka oluşturduğu ve ışık çözeltisinin (%44 Percoll/RPMI) yükseltilmesi için solüsyonu yavaşça bırakın. Birlikte, kokteyl katmanları oluşturacaktır. NOT: Satıcıdan yeni gelen yoğunluk gradyan ortamı için şişeye 1/10 hacim steril 10x PBS ekleyin, iyice karıştırın ve PBS dengeli yoğunluk gradyan ortamını %100 çözüm olarak düşünün.</li>
	<li>Azaltılmış gaz ve fren ayarı ile oda sıcaklığında 20 dk için 900 x g'de numuneleri döndürün. NOT: Hızlandırıcı ve fren ayarlı santrifüjler için (1-9 ölçekte (1 minimum ve 9 maksimum anlamına gelir)), gaz pedalı için 6 ve fren için 4 kullanın.</li>
	<li>Tüpleri katmanları rahatsız etmeden santrifüjden dikkatlice çıkarın; NOT: Pembe renk RPMI tabakası ile renksiz PBS tabakası arasında net bir lenfosit tabakası tanımlanır.</li>
	<li>Lenfosit tabakası dokunmadan bir transfer pipet ile üst tabaka çıkarın.</li>
	<li>Lenfosit tabakasını yeni bir 15 mL tüpe aktarın, tüpü PBS/5% FCS ile doldurun ve yeterli karıştırmayı sağlamak için tüpü 4-6x yavaşça ters çevirerek karıştırın. NOT: Bu adım herhangi bir artık Percoll yıkamak için önemlidir.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk için 500 x g'de numuneleri aşağı doğru çevirin.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve tam RPMI orta 500 μL ile hücre pelet yeniden askıya. Hücreler akış sitometri boyama için hazırdır.</li>
</ol>5. Akış sitometri boyama ve analizi
NOT: T lenfositler için standart akış sitometri boyama protokolünü uygulayın.
<ol><li>Her FACS boyama için yaklaşık 1 x 106 hücre alın. NOT: FACS boyama için bir U-alt 96 kuyu plakası kullanın. Ancak, sadece sınırlı sayıda örnek söz konusu ise, 5 mL FACS tüpleri de kullanılabilir.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya çevirin. Supernatant atın.</li>
	<li>10 μg/mL 2.4G2 FcR bloker (fcr ile eklenen FACS antikorları arasındaki etkileşimi engellemek için bir anti-CD16/32 monoklonal antikor) içeren 50 μL FACS tamponundaki her numuneyi yeniden askıya alın. 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.</li>
	<li>Daha fazla santrifüj olmadan, son boyama hacminin 100 μL/her numune olması için her numune için 50 μL yüzey boyama antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. NOT: ANTIKor karışımına floressentçe etiketli streptavidin (2 g/mL veya üreticinin tavsiyesine uyun) ekleyin ve tüm CD8 T hücrelerini etiketlemek için floresan etiketli anti-CD8β antikor kullanın. Antikor karışımı FACS tampon içine ilgilenen antikorların istenilen miktarda ekleyerek yapılır.</li>
	<li>Örnekleri iki kez PBS ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyu plakasının kuyularını soğuk PBS ile doldurun, 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.</li>
	<li>Seyreltilmiş canlı/ölüm boyası 100 μL/well'deki hücreleri yeniden askıya alın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. NOT: Yoğunluk gradyan orta spin bile, enzimatik sindirim adımı genellikle ARTC2.2/P2RX7 sinyalizasyon15nedeniyle doku yerleşik T hücrelerinde önemli hücre ölümü neden olur. Canlı/ölüm boyası boyama, fiksasyondan önce şiddetle tavsiye edilir. Anti-ARTC2 nanobody hücre izolasyonuna bağlı hücre ölümünü önlemek için ötanaziden önce farelere yönetilebilir.</li>
	<li>Örnekleri iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyulu plakanın kuyularını soğuk FACS tamponuyla doldurun, 5 000 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.</li>
	<li>Hücreleri 100 μL/iyi sabitleme tamponunda yeniden askıya alın. 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın. NOT: Tampon sabitleme% 2 formaldehit nihai konsantrasyonp PBS ile formaldehit seyreltilmesi ile taze yapılır.</li>
	<li>Örnekleri iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyu plakasının kuyularını soğuk FACS tamponuyla doldurun, 5 000 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.</li>
	<li>250 μL/well FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Plakayı kapatın, 4 °C'de saklayın ve FACS analizine kadar ışıktan koruyun. NOT: FACS analizinden önce, FACS makinesini tıkayabilecek olası hücre kümelerini kaldırmak için numuneleri 70 μM naylon kafesten filtreleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cell+subsets%2C+migration+patterns%2C+and+tissue+residence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li>
<li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%3A+local+specialists+in+immune+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li>
<li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li>
<li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li>
<li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells%3A+lessons+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li>
<li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx3+programs+CD8%28%2B%29+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li>
<li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
<li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li>
<li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARTC2.2%2FP2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8%28%2B%29+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li>
<li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Resident+Memory+CD8%28%2B%29+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li>
<li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li>
</ol>

Yazarların konuyla ilgili herhangi bir mali açıklamaları yoktur.

Dokuya özgü bağışıklık araştırma hızlı genişleyen bir alan olduğu gibi, kanıt birikmesi bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler nüfus yetişkin insan veya enfekte veya aşılanmış farelerde hemen hemen tüm organlarda tespit edilebilir öneririz. LCMV fare enfeksiyonu modeli, antijene özgü T hücre yanıtı, efektör ve bellek T hücre farklılaşmasını incelemek için kurulmuş bir modeldir. Burada böbrekteki CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir protokol tanımladık. Bu protokol büyük ölçüde TRM</sub...

Doku da yerleşik bellek (TRM)T hücreleri yetişkin insan ve enfekte farelerde en bol T hücre popülasyonlarından birini temsil eder. TRM hücreleri bağışıklık savunmasının ilk hattını sağlar ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik olarak yer alır1,2,3,4,5. Dolaşımdaki T hücreleri ile karşılaştırıldığında, TRM hücreleri benzersiz transkripsiyon programları6,7,8ile farklı yüzey belirteçleri taşır. TRM biyolojisi hakkındaki bilgimizi genişletmek, T hücre bazlı aşıların ve immünoterapilerin gelecekteki gelişimi için gerekli olan T hücre yanıtlarını anlamanın anahtarıdır.
Tüm lenfoid olmayan dokularda TRM'ninyaygın olarak paylaşılan moleküler belirteçlerine ek olarak, biriken kanıtlar dokuya özgü özelliklerin TRM biyolojisi 9'unmerkezi bir bileşeni olduğunu göstermektedir. Böbrek enfeksiyon sonrası TRM hücreleri de dahil olmak üzere birçok bağışıklık hücreleri barındırır ve olmayan bir mukozal dokuda TRM hücre biyolojisi çalışma için büyük bir fırsat sunuyor. İntraperitoneal yol ile akut LCMV (lenfositik koryomeningit virüsü) enfeksiyonu farelerde antijene özgü T hücre yanıtlarını incelemek için kurulmuş bir sistemik enfeksiyon modelidir. Enfeksiyon genellikle yabani tip farelerde 7-10 gün içinde çözülür ve böbrek10dahil olmak üzere çeşitli dokularda LCMV özgü bellek T hücrelerinin çok sayıda bırakın. P14 TCR (T hücre reseptörü) transgenik fareler CD8+ T hücreleri taşır, C57BL/6 farelerde MHC-I (sınıf I majör histokompatibilite kompleksi) molekülü H2-Db tarafından sunulan LCMV'nin immün dominant epitoplarından birini tanır. Farelerde konjenik olarak işaretlenmiş P14 T hücre evlat edinen transferi ve LCMV enfeksiyonu ile tom8+ efektör ve bellek T hücreleri, TRM farklılaşması ve homeostaz dahil olmak üzere izlenir.
Bağırsak intraepitelyal lenfositler (IEL) bölmesi ve tükürük bezleri gibi bazı bariyer dokularında, kurulan lenfosit izolasyon prosedürü fare LCMV modelinde en az kan kaynaklı T hücre kontaminasyonu ile TRM hücrelerinin yüksek yüzdesini verir11. Ancak, böbrek gibi bariyer olmayan dokularda, yoğun vasküler ağ dolaşımdaki CD8+ T hücrelerinin çok sayıda içerir. Başarılı perfüzyonun bile dolaşımdaki tüm CD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde çıkaramadığı iyi belgelenmiştir. Bu teknik engeli aşmak için, intravasküler antikor boyama TRM laboratuvarlarında en sık kullanılan tekniklerden biri olarak kurulmuştur12. Kısaca, ötanaziden 3-5 dakika önce, 3 μg/mouse anti-CD8 antikor (CD8+ T hücrelerini etiketlemek için) intravenöz olarak teslim edilir. Sağlam kan damarı duvarı bu kısa sürede antikorların hızlı difüzyonunu önler (yani 3-5 dakika) ve sadece intravasküler hücreler etiketlenir. Standart lenfosit izolasyon protokolü takip, intravasküler karşı ekstravasküler hücreler kolayca akış sitometri kullanılarak ayırt edilebilir.
Burada, trm laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan standart bir protokolü,13gün önce 30 gün önce CD45.1+ P14 T hücreleri ve LCMV enfeksiyonu aldı C57BL/6 fare kullanarak böbrek CD8+ T hücrelerinin lenfosit izolasyonve akış sitometri analizi gerçekleştirmek için açıklayacağız. Aynı protokol böbrekte hem efektör hem de bellek T hücrelerini incelemek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-130</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konik Tüpler</td><td>Corning</td><td>431470</td><td></td></tr><tr><td>3 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>37C inkübatör</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin a-CD8a antikoru (Klon 53-6.7)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Buzağı Serumu</td><td>GE Healthcare Life Fen Bilimleri</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Collegenase B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin Şırınga</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Yaylı Makas</td><td>Roboz Cerrahi</td><td>RS 5692</td><td></td></tr><tr><td>Mojosort Fare CD8 Na&iuml; ve T Hücreleri İzolasyon Kiti</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>üstten ısı lambası</td><td>Amazon</td><td>B00333PZZG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Katı Pirinç Fare Kısıtlayıcı</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SAI-MBR</td><td></td></tr><tr><td>Salıncak Kovası Buzdolabı ile</td><td>Santrifüj Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü 6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometri analizi için fare böbrek-resident cd8+ t hücrelerinin izolasyonu

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Doku da yerleşik bellek T hücresi (TRM)immünoloji araştırmalarının hızla genişleyen bir alanıdır. Çeşitli lenfoid olmayan dokulardan T hücrelerinin izole TRMaraştırmak için önemli adımlardan biridir. Farklı organlar için lenfosit izolasyon protokollerinde hafif farklılıklar vardır. Böbrek patojen maruziyet veya otoimmün aktivasyon özellikle sonra çok sayıda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile önemli bir non-lenfoid organdır. Son yıllarda, bizim de dahil olmak üzere birden fazla laboratuvar fare ve insan çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda böbrek yerleşik CD8+ T hücreleri karakterize başlamıştır. T lenfositlerin bolluğu nedeniyle, böbrek non-mukozal veya non-bariyer dokularda TRMçalışmak için cazip bir model organ temsil eder. Burada, sistemik viral enfeksiyon sonrasında fare böbreklerinden CD8+ T hücrelerini izole etmek için TRModaklı laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir protokolü açıklayacağız. Kısaca, C57BL/6 farelerinde akut lenfositik koryomeningit (LCMV) enfeksiyon modeli kullanarak, örnekleri sonraki akış sitometri analizine hazır hale getirmek için fare böbreklerinden lenfositleri izole etmek ve zenginleştirmek için intravasküler CD8+ T hücre etiketleme, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjünü gösteriyoruz.

Burada açıklanan protokol bir akış grafiğinde özetlenmiştir (Şekil 1A). 30. gün sonrası LCMV enfeksiyonunda CD8+ T hücrelerinin intravasküler etiketlemesini yaptık. 5 dakika sonra, hayvanın her iki böbrek leri kesildi, kıyıldı ve kollajenaz sindirime tabi tutuldu. Lenfositler Percoll santrifüj yoluyla sindirilmiş örneklerden daha fazla saflaştırılmış ve akış sitometri sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1B'degösterildiği gibi , yoğunluk santrifüj...

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

CD8+T hücreleri farklı dokularda farklı özellikler taşırlar, mukozal olmayan ve lenfoid olmayan dokunun kritik bir örneğidir. Doğrudan tam T-hücre biyolojisi anlamak için böbrek yerleşik hücreleri karakterize etmek esastır. Burada böbrek yerleşik CD8 + T hücreleri sonraki akış sitometri analizi barındıran izole etmek için uygun yöntemimizi gösterecektir.Bu yöntem, enfeksiyonlar dan sonra oluşturulan efektör ve bellek CD8+T hücrelerinin çalışmaları ve otoimmün yanıtlar hakkında bilgi sağlayabilir. İşlem, laboratuvarımiçin araştırma görevlisi olan Dr. Chaoyu Ma tarafından yapılacak. Biotin anti CD8 alfa antikorseyreltme ile başlayın 15 PBS başına mikrogram, her fare için 200 mikrolitre yönetmek için yeterli olduğundan emin olun.Enjeksiyondan önce, farenin kuyruk damarını bir havai ısı lambası ile 5 ila 10 dakika boyunca ısıtın. Önceden seyreltilmiş antikor karışımından 200 mikrolitreyi 28 kalibrelik bir insülin şırıngasına çekin ve pistonu yukarı aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını çıkarın. İğne ve şırınga arasında 150 derecelik bir açı oluşturmak için iğneyi bükün, böylece iğne kuyruk damarına paralel olacak şekilde yukarı doğru eğilin.Bir kemirgen dizginleyici ile fareyi di

isolation-mouse-kidney-resident-cd8-t-cells-for-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DNabT hücreleri periferal T-hücreleri arasında nadirdir; Bununla birlikte, belli olmayan lenfoid dokuda bol miktarda bulunmaktadır. Non-lenfoid doku DN T hücrelerini izole Zorluk patofizyolojik önemini kabul kapasitelerine rağmen fonksiyonel analizini engellemektedir. Bu murin böbreğinden yüksek derecede arıtılmış DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir protokol açıklar.

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

Bu protokol, fare derisinin besin açısından zengin ortamda enzimatik sindirimini ve ardından lökositleri izole etmek için gradyan ayrımını tanımlar.  Bu şekilde türetilen hücreler, çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu, doku ayrışma makinelerine ve daha sert tripsin ve dispas bazlı doku sindirim protokollerine etkili, ekonomik ve gelişmiş bir alternatiftir.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için güvenilir ve verimli teknikler, sonraki uygulamalar için gereklidir. Bu, az sayıda böbrek bağışıklık hücresinin yüzey antikoru etiketlemesini gerektirir. Burada, görünüşte bu amaca ulaşan böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için özlü bir yöntem açıklıyoruz.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, fare böbrek-resident CD8+ T hücrelerini akış sitometri analizi için izole etme yöntemini. Bu teknik, enfeksiyon sonrası efektör ve hafıza T hücre yanıtlarını incelemeye yardımcı olur.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8⁺ T hücrelerinin izolasyonu

Daha fazla video keşfet