Vasküler Tıbbi Cihazların Hemositokomisyonla uyumluluğunu ve Konak Hücre Aktivasyonunu Araştırmak için Bir In Vitro Hemodinamik Döngü Modeli

Bu hemodinamik döngü modeli araştırmacılar perfüzyon tüpleri veya stent gibi vasküler cihazların in-vitro hemo uyumluluğunu test etmek için izin verir. standart koşullar altında. Yani bu teknik mekanik kuvvet ile kan üzerinde herhangi bir etki yapmaz ve böylece kan bileşenlerinin içsel aktivasyonu ile yanıltıcı sonuçlar önlemek.

Bir deney denemeden önce, uygun mekanik parça montajı, mükemmel döngü kapatma sistemi yapımı ve döngülere yavaş kan yüklemeuygulanmalıdır. Döngü tertibatını hazırlamak için, düz bir yüzeyüzerinde 250 santimetre uzunluğunda, beş milimetrelik iç çaplı boru parçalarını kesmek için bir tüp kesici kullanın. Ve tüplerin açık sonları silikon tüp kısa bir parça içine bir döngü şekli oluşturmak için araştırmacı tüp dış çapı uygun takın.

Gerilim bandı konektörünün kilitleme vidasını dikkatlice sıkın ve iki bükme arasında boşluk kalmayacak şekilde kapanış kuvvetini ayarlayın. Kilitleme vidası tamamen sıkılırsa ve polikarbonat bandının gerilimi iki bükme arasındaki boşluğu kapatamayacak kadar düşük görünüyorsa, kilitleme sistemini açın ve gerilim bandının birkaç milimetresini kesin. Bir stent halkası montajı hazırlamak için, döngülerden ikisini açın ve tüpü gerilim bandı sisteminden alın.

Daha sonra üretici tarafından talimat olarak tüpün ortasına stent takın. Deney için uygun sayıda döngü oluşturulduğunda, dönüş ünitesinin döngü beşiğindeki döngüleri 37 derecelik su banyosunun dışında sabitleyin ve döngü beşiğini su banyosunun içindeki dönüş ünitesine takın. Daha sonra, 150 mikrolitre veya taze hazırlanmış heparin stok çözeltisi ile toplanacak kan her iki döngü için bir 10 mililitreşşü doldurun ve şırıngaiçine yavaşça kan toplamak için 21 gauge kelebek kullanın, aşırı vakum nedeniyle homolysis veya hücre aktivasyonu önlemek için özen.

Tüm kan toplandığında kanı cam bir kabına aktarın ve kanı ve heparini hafifçe karıştırmak için beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. Pipet ucu tam olarak tüpe takılmamış bir homojen çözelti elde edildiğinde, her döngüyü beş mililitre kanla doldurun. Her döngü doldurulduktan sonra kapatın ve döngü, gerilim bandı ve rafın düzgün şekilde sabitlendiğini onaylayın.

Sonra dakikada 30 devrimler üç saat döngüleri döndürün. Döndürmenin sonunda, konektörleri dikkatlice açmadan ve kopyalardan kanı tek tek 10 mililitrelik cam gagalara çekmeden önce, döngülerin iki dakika rafta durmasına izin verin. Tüm kan toplandığında her tüpü 10 mililitre PBS ile durulayın ve her tüpün ucundan bir santimetrelik bir örneği dikkatlice kesmek için neşter kullanın.

Örnekleri bir gecede %2 glutaraldehit ile dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından oda sıcaklığında 15 dakikalık kuluçka ve %1 osmiyum tetroksit. Osmiyum tetroksit inkübatasyonunun sonunda, artan etanol serisindeki numuneleri konsantrasyon başına 20 dakika dehidratasyon, ardından %100 etanolte 30 dakikalık bir dehidratasyon. %100 etanol inkübatasyonunun sonunda, numuneleri bir x-ışını mikro CT tarayıcısı kullanarak beş kilovoltluk bir ivme geriliminde elektron mikroskobu tarayarak görüntülemeden önce oda sıcaklığında bir gecede kurutun.

Kan örneklerinin akış sitometrik analizi için. Her numuneden 100 mikrolitre kan dokuz beş mililitreLIK FACS tüplerinin her birine aktarın ve numuneleri, ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tüp başına %4 güç formaldehitinin 100 mikrolitresini ilave edin. Yıkadıktan sonra, her peleti bir mililitre likit kırmızı kan hücresi lisis tamponu ile tekrar askıya alın, oda sıcaklığında ışıktan korunan beş dakikalık bir kuluçka için.

Kuluçka sonunda, numuneleri tüp başına bir mililitre PBS'de santrifüj le yıkayın ve numuneleri süpernatants olmadan buza yerleştirin. Tek leke kompanzasyon boncuk hazırlamak için FACS tampon bireysel bir mililitre hacimleri için pozitif ve negatif boncuk dört damla dört damla ekleyin ve homojen boncuk süspansiyonlar elde etmek için çözümler girdap. Belirtildiği gibi etiketlenmiş dört veya beş mililitreLIK FACS tüplerin her birine her çözeltiden 100 mikrolitre ekleyin ve boncukları tüp başına bir mililitre FACS tamponuyla yıkayın.

Sonraki nazik karıştırma ile her deneysel ve floresan eksi bir tüp için uygun girdap antikor kokteyl 100 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, ışıktan korunur. Kuluçka sonunda, numune başına bir mililitre taze FACS tamponu ile numuneleri yıkayın ve tüp başına 250 mikrolitre FACS tamponunda peletleri yeniden askıya alın.

Standart protokollere göre, hücre örneklerindeki boncukları akış sitometrisi ile analiz etmeden önce. Kan hücresi dağılımları mikro BT ve taramaelektron mikroskop görüntüleme spliced iki bloops tüm yüzeyi üzerinde görselleştirilebilir boşluksuz kapalı döngülerde pıhtı gözlenmez iken. Tüm kan hücresi sayısının analizi, test edilen koşullar arasında eritrosit sayılarında önemli farklılıklar göstermez, trombosit ve lökosit numaraları ancak, lateks döngü grubunda önemli ölçüde azalır ve serbest hemoglobin sayıları önemli ölçüde artar, lateks çok kötü bir biyouyumluluk gösteren.

Test edilen tüm vasküler cihazlar pıhtılaşma sistemi ve iltifat bileşeni artan bir aktivasyon neden iken. Heparin kaplı PVC döngüler polimer kaplı, PVC döngüler ile karşılaştırıldığında aktivasyon her iki tip azalmış düzeyleri için bir eğilim sergiler. Lateks döngüleri TNF IL-6 ve PMN elastaz en yüksek düzeyde sergi, lateks tarafından lökositgüçlü aktivasyonu vurgulayarak.

Lateks tüplerden elde edilen CD41 pozitif trombositler, CD62P için son derece yüksek bir median floresan yoğunluğu sergilerken, entegre ekspresyon granülositler ve lenfositlerde önemli ölçüde azalır. İlgi, integral düzeyleri lateks tüplerden monositler daha yüksek, monosit aktif trombosit etkileşimleri düşündürmektedir. Gerçekten de monosit trombosit agregaları için boyama lateks ve stent döngülerinde agregasyon eğiliminin arttığını ortaya koymaktadır.

Lateks döngüleri içinde monositlerin azaltılmış frekansına rağmen. İçsel kan bileşeni aktivasyonu önlemek için uygun bir döngü kapanmasını sağlamak ve dikkatli kan işlemek için önemlidir. Bu prosedürü takiben, allojenik proteinler veya TIR'lar ve inflamasyon veya farmasötik araştırmalarda kullanılan kan bileşenleri arasındaki etkileşimi analiz etmek mümkündür.