Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Protokolümüz, dinamikleri, konumu ve yönelimi izlemek için tek parçacık kontrol analizini kullanır ve altın nanorodların hücre zarlarında difüzyonunu karakterize eder. Bu yöntem kullanılarak, altın nanorodların hem çevirisel hem de dönme dinamikleri elde edilebilir ve dinamik kapsamlı bir şekilde analiz edilebilir ve sunulabilir. Bu protokol, diğer karmaşık biyolojik sistem türlerinin incelenmesi için kullanılma potansiyeline sahiptir.

Alevin üzerine etanol batırılmış bir cam kapak kılıfı yakarak ve kapakları fenol kırmızısı olmadan iki mililitre hücre kültürü ortamı içeren 35 ila 10 milimetre hücre kültürü kabına yerleştirerek başlayın. Kapakçık üzerine 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri eşit bir şekilde dağıtmak için kabı ileri geri ve sola doğru hafifçe sallayın. Çanağa 20 mikrolitre CTAB kaplı altın nanorod eklemeden önce, hücreler% 20 ila% 40 izdiahına ulaşana kadar yaklaşık 12 saat boyunca çanağı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Nanorodları yemek boyunca eşit bir şekilde dağıtmak için hafifçe salladıktan sonra, yemeği beş dakika boyunca nemli bir atmosfere yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, tabaktan 100 mikrolitreyi yavaşça bir cam kaydırağın oluğuna aktarın ve kapak hücresi tarafını dikkatlice slayt oluğuna yerleştirin, ardından kapak kapağının kenarını oje ile kapatın ve slaydı karanlık alan mikroskop aşamasına yerleştirmeden önce ojeyi kurumaya bırakın. Darkfield mikroskopisi ile tek parçacık takibi için, yağ daldırma koyu alan kondenserine bir damla yağ yerleştirin ve kondenser cam kaydırağa temas edene kadar düğmeyi çevirin.

Kapak camının üstüne bir damla yağ yerleştirin ve 60X yağ daldırma hedefi yağa temas edene kadar odaklama düğmesini çevirin. Işık kaynağını açın ve görüntüleme düzlemini odaklamak için odaklama düğmesini hafifçe çevirin. Ardından, CMOS renkli kamerayı kullanarak örnek saçılma ışığı görüntü zaman serisini kaydetmek ve görüntüyü TIFF biçiminde kaydetmek için mikroskop yazılımındaki kamera simgesini tıklatın.

Tek bir uzun vadeli yörünge ayıklamak için görüntüyü ImageJ'de açın ve görüntüyü RGB modundan 8 bit moduna dönüştürmek için görüntüyü, yazıyı ve 8 bit'i tıklatın. Kontrastı ayarlamak için görüntüyü tıklatın, ayarlayın, parlaklık kontrastını ayarlayın ve parametreleri ayarlayın. Bir hedef parçacık seçin ve zaman serisi arka planını kesmek için Kontrol X'i kullanın.

Parçacık algılama ve parçacık bağlama penceresini açmak için eklentileri, parçacık izleyici klasiği ve parçacık izleyiciyi tıklayın ve yarıçapı altıya, kesmeyi sıfıra ve yüzdelik dilimi % 0,01'e ayarlayın Bağlantı aralığını 10'a ve yer değiştirmeyi 10'a ayarlayın ve sonuçları görmek için parçacık izleyici sonuçları penceresini açmak için Tamam'ı tıklatın. Oluşturulan yörüngeleri incelemek için tüm yörüngeleri görselleştir'i tıklatın. Yazılım oluşturulan yörünge ve altın nanorodların hareketli yörüngesi eşleşiyorsa, sonuçları kaydetmek için tam raporu kaydet'i tıklatın.

Oluşturulan yazılım yörüngesi altın nanorodların hareketli yörüngesiyle eşleşmiyorsa, algılanan parçacıkları farklı bağlantı aralığı ve yüzdebirlik parametrelerle yeniden bağlamak için parçacıkları yeniden bağlayın' ı tıklatın. XY koordinatlarına göre her karedeki altın nanorodun orta piksel koordinatını bulmak için ksycoordination kullanın. m işlevi.

Üçe üç piksel matrisini sınırlandırmak, kırmızı veya yeşil kanalların dokuz saçılma yoğunluğu değerini ayıklamak ve ortalama bir değer hesaplamak için rgextraction kullanın. m işlevi. O zaman kutup dalgasını kullan.

m işlevi çift kanallı diferansiyel yöntemini kullanarak kutup açılarını hesaplamak için. Tablodaki formülleri kullanarak dinamik parametreleri hesaplamak için iki çözümleme komut dosyasını çalıştırın. Yörüngenin görsel analizi için X koordinatını X, Y koordinatını Y ve saati Y olarak ayarlayın, sonra çizim, dağılım ve renk eşlemini tıklatın, grafik parametrelerini ayarlayın ve renk çubuğunu ekleyin.

Ortalama kare yer değiştirme zaman aralığı rakamları oluşturmak için, zaman aralığını X ve ortalama kare yer değiştirmeyi Y olarak ayarlayın.Çizim, dağılım, analiz, montaj, doğrusal olmayan eğri sığdırma ve açık diyalog olarak ayarlayın ve grafik parametrelerini ayarlayın. Çok parçacıklı istatistiksel analiz için, ilgi çekici dinamik parametreleri Y olarak ayarlayın ve çizim ve histogram'ı tıklatın. Bölme boyutunu veya bölüm sayısını ayarlamak için histogramı çift tıklatın ve Uygula'yı tıklatın.

Ardından bir sütun ekleyin ve grafik parametrelerini ayarlayın. Bir zaman serisi analizi için, saati X olarak ve zaman serisi parametrelerini Y olarak ayarlayın.Çizimi, çok bölmeli ve yığını tıklatın. Açılır pencerede satır ve Tamam'ı seçin. Ardından grafiğin parametrelerini ayarlayın.

Boyuna plazmonik maksimum 40 ile 85 nanometre CTAB kaplı altın nanorodlar yaklaşık 650 nanometre ve enine rezonans 520 nanometredir. CTAB kaplamalı altın nanorodların U87 hücre zarlarındaki saçılma yoğunluğu, bu deneyde izlenen CTAB kaplamalı altın nanorodların iyi monodispersed olduğunu gösteren cam üzerindeki CTAB kaplamalı altın nanorodlarınkiyle tutarlı dar genişliğe sahip tipik bir Gauss dağılımını göstermektedir. Gösterildiği gibi, 500'den fazla CTAB kaplamalı altın nanorod yörüngesi karanlık alan mikroskopisi ile izlenebilir ve uzun menzilli difüzyon yörüngelerine ve sınırlı difüzyon yörüngelerine ayrılabilir.

Bu temsili analizde 500 yörüngenin tüm gyration yarıçapı, ortalama 0,5 mikrometre gyrasyon yarıçapı ile küçük bir değer dağılımı gösterdi ve maksimum yer değiştirme küçük değerlerde daha fazla dağıtıldı. Bu topluluk ortalama ortalama kare yer değiştirme analizinde gösterildiği gibi, CTAB kaplamalı altın nanorodlar normalde yaklaşık bir alfa ile yayılır. Bununla birlikte, difüzyon katsayısının ve tüm yörüngelerden elde edilen alfanın yoğunluk dağılımı, altın nanorodların dinamiği süper difüzyon, Brownian ve subdiffüzyon hareketleriyle heterojen bir dağılım sergilediğini ortaya koymaktadır.

Ek olarak, tek parçacık istatistiksel analizi ve zaman serisi parametre analizi, iki temsili uzun süreli sınırlı ve hareketli yörüngeyi karakterize etmek için kullanılabilir. Genellikle yapılması zor bazı dengeler olduğu için, tek parçacık izleme analizi okumasından verilerin tek bir yeni yorumunu özetlemek ve ayıklamak gerekir.