CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Bu protokol önemlidir, çünkü CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi için sivrisinek embriyolarının nasıl hazırlanacağı ve enjekte edileceği hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Bu mikro enjeksiyon tekniğinin temel avantajları, sivrisinek sağkalım oranının yüksek olması ve araştırmacıların bir genin işlevini belirlemesine izin vermesidir. Bu protokol, Culex cinsine ait sivrisinekleri enjekte etmek için özel olarak tasarlanmıştır.

Bu sivrisinekler, Batı Nil ateşi ve St.Louis ensefalitine neden olan virüslerin yanı sıra köpek kalp kurdu ve fil hastalığına neden olan filaryal nematodlar da dahil olmak üzere çeşitli patojenleri iletir. Bu nedenle, CRISPR-Cas9 genom düzenleme gibi araçlara sahip olmak, bu önemli hastalık faktörlerini daha iyi anlamamızı ve kontrol etmemizi sağlayacaktır. Taze bırakılmış böcek embriyolarını enjekte etmek ve daha yüksek bir hayatta kalma oranı elde etmek çok zaman, pratik ve sabır gerektirir.

Bu nedenle, bir mutasyon oluşturmak için pahalı materyalleri enjekte etmeden önce birkaç embriyoya renkli bir salin solüsyonu enjekte etmenizi öneririz. Enjeksiyon iğnelerini enjeksiyon karışımıyla geri doldurarak başlayın. Seçilen enjeksiyon iğnesinin arka ucuna kolayca sığacak bir iğne dolgusu veya jel yükleme ucu seçin.

İğne dolgusunun ucu ile enjeksiyon iğnesi arasında biraz boşluk olduğundan emin olun. Dikkatlice aspire edin, enjeksiyon karışımının tek bir küçük damlası, incelmeye başladığı noktanın yakınındaki enjeksiyon iğnesine yerleştirin. Ardından enjeksiyon iğnesini mikro enjektöre takın.

Embriyoları içeren slaytı mikroskobun sahnesine yerleştirin. İğneyi açmak için, yaklaşık 30 Psi'lik bir başlangıç enjeksiyon basıncı kullanın ve uygun hacimde enjeksiyon karışımı sağlamak için gerektiği gibi ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu altında, iğneyi sivrisinek embriyosunun üzerine yerleştirin ve iğneyi embriyonun üzerine indirmek için mikromanipülatörü dikkatlice kullanın.

İğne embriyoya zar zor dokunduğunda, embriyoyu iğnenin uzun eksenine dik olarak hızlı bir şekilde hareket ettirin. İğnenin başarılı bir şekilde açılıp açılmadığını belirlemek için enjeksiyon tetiğine basın ve iğneden herhangi bir kabarcık veya enjeksiyon karışımı çıkıp çıkmadığına bakın. Değilse, sivrisinek embriyosunu açık olana kadar iğneye karşı hareket ettirmeyi tekrarlayın ve tetiğe basıldığında enjeksiyon karışımı kaçar.

İlk sivrisinek embriyosunu görüş merkezine yerleştirin, odakta olduğundan emin olun ve iğneyi ilk yumurtanın üzerine yerleştirin. Mikroskoptaki büyütmeyi kademeli olarak artırın, iğneyi ilk embriyonun hemen üzerinde tutmak için dikkatlice indirin. Mikroskop en yüksek büyütme oranına ulaşana ve hem embriyoya hem de iğneye odaklanana kadar devam edin.

Embriyoyu hafifçe sola doğru hareket ettirin ve iğneyi embriyo ile aynı görüş düzleminde olacak şekilde indirin. Embriyoyu iğnenin ucuna hafifçe dokunmak için mikroskop aşamasını kullanın. Sivrisinek embriyosunun dar arka ucu hafifçe sapmalıdır.

Mikroskop aşamasını kullanarak, embriyonun arka ucunu iğnenin üzerine getirin ve iğnenin sivrisinek yumurtasının koryonuna nüfuz ettiğini gözlemleyin. İğne sadece zara ve embriyo içindeki kutup hücrelerinin yaklaşık konumuna nüfuz etmelidir. Enjeksiyon karışımının bu bölgeye yerleştirilmesi, mutasyonların meydana gelme ve germ hattında kalıtılma olasılığını artırır.

Enjeksiyon karışımını embriyoya çekmek için enjeksiyon tetiğini bir ila üç kez çekin. Embriyo plazmasında küçük bir açıklık tespit edilebilecek kadar az miktarda enjeksiyon karışımı verin. Embriyoyu iğnenin ucundan sağa, uzağa ve uzağa hareket ettirmek için sahneyi kullanın.

Enjeksiyon iyi giderse, embriyodan çok az sıvı sızmalı veya hiç sızmamalıdır. Bir sonraki embriyo iğnenin önüne gelecek şekilde sahneyi aşağı doğru hareket ettirin. Ve enjeksiyonu tekrarlayın.

Enjeksiyon karışımı dışarı çıkmıyor gibi görünüyorsa veya iğne çıkarıldıktan sonra embriyodan büyük miktarda sıvı kaçarsa, enjeksiyon iğnesini değiştirin ve yeniden başlayın. Enjekte edilmemiş veya hasar görmüş yumurtaları yok edin. Slayttaki tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, bir fışkırtma şişesi ile ters ozmoz suyu uygulayarak Halokarbon yağını yıkayın.

Su akışını, enjekte edilen embriyoların üzerindeki cam kapak kaymasının üstüne yönlendirin ve suyun örtü kızağından aşağı akmasına izin verin, akışı embriyoların üzerine yönlendirmediğinizden emin olun. Slaytı 150 mikrolitre su ile örtün ve kare bir Petri kabının içindeki ıslak filtre kağıdına yerleştirin. Petri kabını, uzun günlük bir fotoperiyot ile 25 ila 27 santigrat derece ve% 70 ila 80 bağıl neme ayarlanmış bir çevre odasında inkübe edin.

Bu protokol, kuzey ev sivrisineği Culex pipiens'in embriyolarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için kullanıldı, sivrisinek embriyosunun ön ucunun tıbbi pansuman şeridinin ötesine uzanmasını, larva sağkalımını büyük ölçüde artırmasını ve yetişkinliğe kadar gelişebilen ve üreyebilen yüksek kaliteli yavrularla sonuçlanmasını sağladı. Dizileme, taranan sivrisineklerin yaklaşık% 10'unun, ilk kılavuz RNA'nın Cas9 kesim bölgesinin yakınında küçük bir ekleme veya silme gösterdiğini ortaya koydu, bu da kutup hücrelerinin mikro enjeksiyonlar sırasında başarılı bir şekilde hedeflendiğini düşündürdü. F1 bireyleri başarılı bir şekilde çiftleşti ve bazıları mutasyonu da içeren canlı yavrular üretti.

Böcek embriyolarını mikro enjekte ederken, çoğu insan başlangıçta iğneyi açmak ve embriyoyu iğnenin üzerine taşımakla mücadele eder. Bu becerileri geliştirmenin zaman ve pratik gerektirdiğini unutmayın. Bu protokol, diğer sivrisineklerin ve hatta diğer böcek türlerinin embriyolarını enjekte etmek için değiştirilebilir veya uyarlanabilir.

Hedeflenen CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi ile genleri nakavt etmek için bu protokolü kullanmanın ötesinde, aynı teknikler, genleri nakavt etmek veya rastgele mutasyonlar oluşturmak için plazmitleri veya transpozonları enjekte etmek için kullanılabilir. Laboratuvarım şu anda sivrisineklerin günlük olarak nasıl ölçtüğünü daha iyi anlamak ve mevsimsel tepkilerini düzenlemek için bu tekniği kullanıyor. Bununla birlikte, biz araştırmacıların birkaç organizmanın biyolojisini daha iyi anlamak için CRISPR-Cas9 genom düzenlemesini nasıl kullandıkları.