Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Biyolojik dokular, hücrelerin çeşitli mekanik ipuçlarına maruz kaldığı üç boyutlu yumuşak ortamlarda büyür. Yöntemimiz, biyomekanik tepkilerin araştırılması için hidrojellerin üç boyutlu bir şekilde gerilmesine izin verir. Bu teknik, canlı görüntüleme yapılırken hidrojellerin kalınlıkları boyunca düzgün bir şekilde gerilmesini sağlar.

Ek olarak, hidrojelin geometrisi herhangi bir boyut veya şekle göre manipüle edilebilir. Hücrelerin ve hücre dışı matriksin kuvvetlere nasıl tepki verdiğine dair bilgi sahibi olmak, dokuların nasıl geliştiğini ve hastalıkların nasıl ilerlediğini ortaya koymak için önemlidir. Bu, kanser tedavilerinin ve doku mühendisliği modellerinin potansiyel olarak geliştirilmesine yol açabilir.

Ortasında bir delik bulunan bir lastik şerit oluşturmak için bir lazer veya manuel kesici kullanarak başlayın. Silikon şeritlerden daha geniş olacak şekilde bir dikdörtgen hidrofobik film kesin ve plastik bir kabı% 70 etanol ile yıkayın. Tüy bırakmayan mendillerle kuruduktan sonra, sızdırmazlık filmini tabağa yerleştirin ve plastik sargının bir tarafından çıkarılmış olarak bir silikon şeridi her bir sızdırmazlık filmi parçasının ortasına yerleştirin.

Fibrin jel oluşumu için, her bir şeridin silikon kesimine 2,5 mikrolitre soğuk etiketli fibrinojeni eşit şekilde verin, böylece her bir kesiğin tüm çevresi fibrinojen ile temas halinde olur ve solüsyonların herhangi bir yerinde herhangi bir hava cebi veya kabarcık oluşmasına izin vermemeye dikkat edin. Hemen her bir fibrinojen çözeltisine doğrudan 2,5 mikrolitre soğutulmuş trombin ekleyin ve çözeltileri dikkatli bir pipetleme ile hızlı bir şekilde karıştırın, mümkün olduğunca homojen bir çözelti oluşturmak için ucu tüm karışımın etrafında hareket ettirin. Karıştırdıktan sonra, jel polimerizasyonu için kapalı kabı 30 dakika inkübatöre koyun.

İnkübasyonun sonunda, jel silikon yapıları daldırmak için tabağa yeterli miktarda PBS ekleyin ve her bir numuneyi tabaktan dikkatlice kaldırın, sızdırmazlık filmi tabakasının şeride yapışmış kaldığından emin olun. Silikonun bir ucundan diğer ucuna yavaşça soyularak, sızdırmazlık filmini her bir silikon parçasından dikkatlice ayırın, ardından şeridi tekrar tabağa yerleştirin ve numunenin durumunu değerlendirmek için tabağı bir ışık mikroskobu aşamasına yerleştirin. Numuneyi germe cihazına yüklemek için, banyoyu PBS ile doldurun ve numune jelini içeren silikon şeridi, şeridin uçları banyonun her iki tarafına oturacak şekilde banyonun üst kısmına yerleştirin.

Kelepçeleri ve kumaş şeritleri yerleştirin ve ardından tüm parçalar, kesik merkezde olacak şekilde tek bir düz şerit oluşturacak şekilde bağlanacak şekilde sıkın. Malzemeyi kuyuya yerleştirin ve kuyunun dibine bir kapak kayması, ardından germe cihazına bir alüminyum sıvı kuyusu yerleştirin. Kuyuyu bir ila iki mililitre PBS hücre ortamı ile doldurun ve şerit kumaş jel yapısını cihaza yerleştirin.

Kumaş şeridi, pimi aşağı doğru yerleştirip cihazdaki yerine dikkatlice yerleştirmeden ve kilitlemeden önce, jelin kesiği ortada olacak şekilde brakete sıkıştırın. Diğer kumaş tarafını mile yerleştirin ve kilitleyin ve germe cihazını ve ekli numuneyi konfokal bir mikroskop tablasına yerleştirin. Mikrodenetleyiciyi bilgisayara bağlamak için bir USB kablosu kullanın ve servo motoru mikrodenetleyiciye bağlayın.

Ardından, numuneyi görüntülemek için bilgisayardaki germe cihazı kontrol modülünü açın. Numunenin bir deney için yeterli olup olmadığını belirlemek için, tüm jeli taramak için düşük çözünürlüklü canlı görüntüleme kullanın ve kesiğin iç duvarlarına tam yapışmanın yırtılma veya kabarcık olmadan belirgin olduğu en düşük Z konumunu belirleyin. Mikroskobun Z konumunu not ettikten sonra, jelin çevresi boyunca silikona tam yapışmasını belirlemek için jelin ve silikon şeridin floresan etiketinin arayüzünü tarayın.

Taramadan sonra, jelde süreklilik kalmayana kadar sahneyi Z yönünde hareket ettirin ve Z konumunun üst sınırına dikkat edin. Ardından, numune kalınlığını hesaplamak için Z yönünün üst sınırını alt sınırdan çıkarın. Numunenin ön gerdirme konumunu belirlemek için, servo motorun sıfır konumunda olduğundan emin olmak için modül yazılımında Sıfır Servo POS'a Git'e tıklayın ve servo motoru, numuneye herhangi bir zorlama yapmamaya ve dikkat ederek germe cihazına takın.

Görüntüleme sırasında, motoru saat yönünde her seferinde bir derece hareket ettirmek için artı bir düğmeye tıklayın. Kesikin sağ tarafı hareket ettiğinde, numuneyi minimum gerilim altında tutmak için numuneyi sondan bir önceki konuma geri döndürmek için eksi bir düğmeye tıklayın. Referans konumunu ayarlamak ve işlem sonrası analiz için temel referans olarak tüm jel alanının 40 zaman büyütmeli, yüksek çözünürlüklü, tek Z dilimli döşeme görüntüsünü yakalamak için Minimum Servo Konumunu Ayarla'ya tıklayın.

Tüm görüntüler elde edildiğinde, istenen esneme büyüklüğüne ulaşılana kadar servo motoru saniyede bir derece ilerletin. Bir analizin istendiği her bir esneme büyüklüğünde, jel ve silikon arasındaki arayüzü tarayarak jelin çevresi boyunca herhangi bir noktada silikondan ayrılmadığını doğrulayın, ardından işlem sonrası analiz için tüm jel alanının yüksek çözünürlüklü bir karo Z yığını görüntü setini yakalayın. Jel gerdirme sırasında boncuk agregalarının yakınlaştırılması ve manuel olarak izlenmesi, eksenel ve dikey yönlerde yerel jel suşlarının hesaplanmasına olanak tanır.

Tipik olarak, eksenel iplikler, silikon kesme kenarından jelin merkezine nispeten doğrusal olarak yayılır ve sıkıştırıcı dikey gerilmelerden daha büyüktür. Burada, tipik bir gerilmemiş ve nispeten izotropik hidrojelin yüksek büyütmeli görüntüleri ve gerilme yönünde yüksek hizalanmış lifleri gösteren yüksek %80 kesme gerilimi altında bir hidrojenin görüntüleri gösterilmektedir. Elyaf yeniden oryantasyonunun analizi, elyaf hizalaması ile kesme üzerindeki dış gerinim arasında %40'lık suşlara kadar yaklaşık olarak doğrusal bir bağımlılık olduğunu ve %40'ın üzerindeki gerinimlerde orta derecede doygunluk olduğunu ortaya çıkardıBu lif hizalama analizinde gösterildiği gibi, kesme üzerindeki dış gerinim arttıkça, genel doğrusal olmayan bir eğriyi takip ederek lif hizalaması artar.

Gerilmeye verilen jel tepkisinin Z kalınlığı boyunca nispeten homojen olduğuna dikkat edin. 2D sürekli malzeme üzerinde gerçekleştirilen bu ön sonlu eleman simülasyonunda gösterildiği gibi, renk matı %38 ila %42 arasında değişir, bu da jel suşlarının dairesel jel alanı boyunca nispeten homojen olduğunu gösterir. Numunelerin güvenilir bir şekilde gerilmesi için yapışma ve süreklilik çok önemli olduğundan, hidrojelin geometrik oyuğun iç duvarlarına tamamen yapışmasını sağlamak önemlidir.

Silikon kesimin geometrisini değiştirerek, gerinim ve lif hizalamasındaki gradyanları programlayabiliriz, böylece hücreleri gömerken bu gradyanlara verilen yanıtı analiz edebiliriz.