Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Nötrofiller, lokal olarak üretilen kimyasal ligandlara yanıt olarak yaralara sızan önemli enflamatuar hücrelerdir. Bu protokol, in vivo olarak bu tür ligandlara yanıt olarak reseptör dinamiklerinin görselleştirilmesine izin verir. Kemokin reseptör raportörlerinin kullanımı, enfeksiyon ve tümör modelleri gibi diğer fizyolojik ortamlara ve diğer bağışıklık hücrelerine genişletilebilir.

Yöntem, lökositlerin kimyasal cezbedici molekülleri dokuda ne zaman ve nerede algıladığını izlemeyi mümkün kılar. Bu, bağışıklık tepkilerinin nasıl ortaya çıktığını ve çözüldüğünü daha iyi anlamayı sağlayabilir. Zebra balığı larvalarında ventral yüzgeç yaralaması yapmak, ince larva manipülasyonu gerektirir, bu nedenle deneysel amaçlar için tasarlanmamış larvalar üzerinde biraz pratik yapılması gerekir.

Döllenmeden sonraki 2,5 ila 3,5. günlerde, anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarını floresan diseksiyon kapsamı altına yerleştirin ve transgenik reseptör ekspresyonu olan larvaları seçin. Seçilen larvaları E3 besiyeri takviyeli Trikain içeren 120 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve kaudal hematopoietik doku damarlarını kesmeden önemli nötrofil alımına neden olacak kadar derin kesilmiş her larvanın ventral yüzgecini kesmek için steril bir neşter kullanın. Cam tabanlı bir tabağa 500 mikrolitre 2X Trikain ekleyin, ardından 500 mikrolitre agaroz solüsyonu ekleyin ve pipet ucuyla hafifçe karıştırarak karıştırın.

Yaralı anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarını tabağa aktarmak için bir pipet kullanın ve balığın kaudal kısmı cam tabana mümkün olduğunca yakın olacak şekilde hafifçe aşağı iterken embriyoyu yanal olarak yönlendirin. Embriyo pozisyonda olduğunda, agarozun soğumasını bekleyin. Beş ila 10 dakika sonra, katılaşmayı doğrulamak için jele küçük bir boya fırçası ile hafifçe dokunun ve plakaya mililitre Trikain başına 0.2 miligram takviye edilmiş iki mililitre E3 ortamı ekleyin.

Dönen disk konfokal mikroskop kullanarak yara bölgesini görüntüleyin. Mümkün olan en kısa sürede, agaroz sertleştikten sonra, embriyoyu konfokal görüntüleme eğirme diski platformuna aktarın ve balığın yerini belirlemek için sahne joystick'ini ve mikroskop objektifini kullanın. 30 ila 40X objektifi kullanarak yara bölgesine odaklanın ve yaranın etrafını görüntülemek için alanı seçin.

Lazeri seçin ve pozlama süresini ayarlayın, ardından istenen süre için her 30 saniyede bir timelapse ayarlayın ve görüş alanını belgelemek için bir Parlak Alan görüntüsü elde edin. Yara bölgesindeki nötrofil reseptörü içselleştirmesini ölçmek için, görüntü veri kümelerini Fiji'de açın ve her veri kümesi için temsili bir ilgi zaman çerçevesi seçmek için zaman kaydırıcısını kullanın. MATLAB'da yeni bir komut dosyası oluşturun ve görüntü okuma, açma ve ilgi noktalarının manuel olarak seçilmesi için işlevler ekleyin.

İlgilenilen çerçeveyi açmak için komut dosyasını çalıştırın ve analiz için nötrofillere tıklayın. Hem ventral yüzgeç yarasında hem de kaudal hematopoietik dokuda centroidlerinin bir tahminini kaydedin. Aktif kontur tekniğini kullanarak her karedeki nötrofilleri bölümlere ayırın ve gri seviye birlikte oluşum matrisine dayalı nötrofillerin kontrastının hesaplanması da dahil olmak üzere her nötrofil için gri seviye birlikte oluşum matrisinin hesaplamasını eklemek için komut dosyasını oluşturun.

Tüm kaudal hematopoietik doku nötrofillerinden ortalama nötrofil kontrast değerinin hesaplanması da dahil olmak üzere, ventral yüzgeçteki tek tek nötrofiller için değerleri ayrı ayrı kaydetmek için komutlar ekleyin. Yara bölgesindeki tek tek nötrofillerin kontrast değerinin normalleştirilmesini, kaudal hematopoietik doku nötrofillerinin hesaplanan ortalama kontrastına dahil edin ve kontrol yanıt vermeyen hücrelere göre tek tek yanıt veren hücreler içinde bir reseptörün görünümünün ne kadar noktalı olduğunu yansıtan normalleştirilmiş bir kontrast elde edin. Ardından komut dosyasını çalıştırmak için çalıştır'a tıklayın.

Ventral yüzgeç yaralanmasını, kaudal hematopoietik dokudan ventral yüzgecin içine hızlı nötrofil mobilizasyonu ve yaralanma indüksiyonundan sonraki 30 ila 60 dakika içinde yara kenarında kümelenme takip eder. Bu analizde, zebra balığı nötrofilleri tarafından eksprese edilen kemokin reseptörleri CXCR1 ve CXCR2, eğirme diski konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Reseptör dağılımı modeli, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını bildiren kontrast metriği kullanılarak ölçüldü.

Alternatif bir yöntem, reseptör seviyelerinin kontrollü bir membran markörünün seviyeleri üzerindeki oranını ölçmektir. Yaradaki nötrofil kümelerinde reseptör içselleştirmesini tespit etmek için kontrast metriği kullanılarak, yara bölgesindeki nötrofillerde CXCR1 ve CXCR2 trafiği arasındaki gözle görülür farklar ölçülebilir. Örneğin, bu analizde, yara bölgesinde bulunan hücrelerde floresan etiketli CXCR1 içselleştirmesi zamanla artarken, floresan etiketli CXCR2 yaradaki nötrofillerin zarlarında kaldı.

CXCR1 ve CXCR2 ligandlarının morfolino tedavisi ile baskılanması, yara bölgesinde diferansiyel floresan etiketli CXCR1 içselleştirmesi ile sonuçlanır. Ek olarak, erken embriyolarda, floresan etiketli CXCR1, reseptör ligandının birlikte eksprese edildiği embriyolarda belirgin bir şekilde içselleştirilir. Bu protokolü denerken, yaralara nötrofil alımı sırasında reseptör dinamiklerini yakalamak için yaralamadan sonra görüntülemenin mümkün olduğunca çabuk yapılması gerektiğini unutmayın.

Normal larvalarda kemokin reseptörlerinin görüntülenmesini takiben, araştırmacılar düzensiz inflamasyonu olan mutant larvalarda karşılaştırmalı görüntüleme yapabilirler.