Name: Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Keşfedin canlı görüntüleme yöntemiyle zebra balığı nötrofillerinde kemokin reseptör dinamiklerini analiz etmeyi. Bu protokol, yaralanma yanıtları sırasında reseptör içselleşmesini niceliksel olarak değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Christine Holt ve Bill Harris'e konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Floresan zamanlayıcı omurga yapıları için Darren Gilmour'a ve Tol2-Lyz omurga vektörü için Anna Huttenlocher'e teşekkür ederiz. Steve Renshaw'a Tg(mpx:GFP)i114 serisi için teşekkür ederiz. Bu çalışma MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] ve bir Isaac Newton Trust hibesi 19.23(n). C.C., MRC DTP öğrenciliği ve kısmen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] tarafından desteklendi; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe. H.W. MRC DTP Studentship tarafından desteklendi. H.P., Wellcome Trust doktora hibesi (105391 / Z / 14 / Z) ve kısmen bir Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z] tarafından desteklenmiştir; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe ve MRC (MR/L019523/1).

<ol><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense%3A+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li>
<li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li>
<li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).</li>
<li>Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnon%2C+TI+%22Science%22">Science</a>. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li>
<li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387(2015).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Donà, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li>
<li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+dynamics+of+an+endogenous%2C+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li>
<li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+receptor+internalization%2C+signaling+level%2C+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).</li>
<li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , Elsevier. Burlington. (2004).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li>
<li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Textural+features+for+image+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+infection%3A+From+pathogenesis+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae%3A+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).</li>
<li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li>
<li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Zebrafish+and+CRISPR%2FCas9%3A+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler

Tarif edilen yöntem, doku hasarına inflamatuar yanıt sırasında endojen ligandlara in situ yanıt olarak reseptör dinamiklerinin canlı görüntülenmesini sağlar. Cxcr1 / Cxcr2 nötrofil muhabirlerinin kullanımı, enfeksiyon, tümör modelleri veya diğer doku hasarı türleri gibi diğer fizyolojik ortamlara genişletilebilir 14,25,26,27. Ek olarak, endojen reseptörün eksojen bir mutant reseptör tarafından bastırıldığı ve kurtarıldığı transgenik kurtarma hatları, immün yanıtlarda spesifik nötrofil migrasyon paternlerinin önemini incelemek için yararlı araçlar sağlayabilir. Örneğin, duyarsızlaştırmayı bozan Cxcr1 reseptör mutantları, enflamatuar bölgelerde daha belirgin nötrofil kümelenmesine neden olur14. Bu fonksiyon kazancı fenotipi, nötrofil cemaatinin farklı fizyolojik süreçlerdeki rolünü anlamak için kullanılabilir, örneğin, yara onarımı, bulaşıcı hastalık veya tümör evrimi ve kompleman reseptör nakavt / nakavt deneyleri. Metodoloji ayrıca mevcut muhabirlerin aralığını genişletmek için bir temel sağlar. Floresan muhabir seçimi dikkate alınması önemlidir ve biyolojik soruya bağlıdır. Nötrofillerdeki bu kemokin reseptörlerinin kurucu döngüsünün, epitel hücrelerine kıyasla yüksek olduğunu ve hızlı olgunlaşması olan muhabirlerin (örneğin, sfGFP) membran seviyelerini kararlı durumda bildirmeleri ve nötrofil stimülasyonuüzerindeki farklılıkları çözmeleri gerektiğini bulduk8,14. Bu nedenle, sfGFP / tagRFP'nin membran oranları, bu hücre tipinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi ölçmek için geçerli değildir, ancak tagRFP paterni, bazı çalışmalarda yararlı olabilecek reseptörün hücre içi kaderlerinin izlenmesine izin verir. Ayrıca, tagRFP'nin daha konsantre hücre içi sinyalinin bireysel larvaları taramak için yararlı olduğunu bulduk. Plazma zarındaki reseptör seviyelerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, nötrofillerdeki bir floresan membran belirtecini aynı transgen9'da veya bağımsız bir transgen14'te birlikte eksprese etmek olacaktır. Önceki senaryoda, transgen balığın taranması için ek bir araç sağlayacak ve ekspresyon seviyeleri belirteç ve reseptör arasında karşılaştırılabilir olacaktır. İkinci yaklaşım daha modüler olacaktır, çünkü bir reseptör muhabiri olan bir zebra balığı çizgisi farklı muhabir hatlarıyla birleştirilebilir. Her iki durumda da, kümelenmiş nötrofillerde reseptör seviyelerinin membran nicelleştirilmesinin zor olduğunu belirtmek gerekir (aşağıya bakınız). Son olarak, bu protokolün olası bir uzantısının, daha ayrıntılı lokalizasyon analizleri için canlı görüntülemeyi immünohistokimya ile takip etmek olacağını not ediyoruz.
Tol2 transgenez sistemi iyi kurulmuş7'dir ve lizozim C promotörü nötrofil ekspresyonu11,15 için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, transgenez yaklaşımı nispeten basittir ve bu promotör ile elde edilen ekspresyon seviyesi, reseptör dinamiklerinin analizi için yeterli kontrast sağlayacak kadar yüksektir. Olası bir sınırlama, ekspresyon seviyesinin endojen reseptör ekspresyon seviyelerini özetlememesidir. Yeni CRISPR teknolojileri, özellikle ilgi çekici reseptörler için zincirleme hatlar oluşturmak üzere konuşlandırılabilir28. Bu teknolojiler hala hantaldır ve hücre altı görüntüleme için gerekli ekspresyon seviyelerini garanti etmeyebilir, ancak başarılı gelişimleri endojen sinyal dinamiklerini anlamak için önemli bir atılım olacaktır. Fonksiyonel doğrulamalar, transgenik reseptör yapıları ile verilerin yorumlanması için önemlidir. Örneğin, floresan füzyon proteininin işlevsel olduğunu belirlemek için ligand tanıma testleri kullanılabilir ve transgenik nötrofil ekspresyon seviyelerinin işlevsellik14 ile uyumlu olduğunu belirlemek için nakavt fenotiplerinin kurtarılması kullanılabilir. Son olarak, reseptör füzyonunu doğrulamanın daha doğrudan bir yolu, etiketlenmemiş versiyonlar14'ün yanı sıra etiketli reseptörlü in vitro fonksiyonel bir tahlil kullanmak olacaktır.
Niceleme yaklaşımı, nötrofillerde in vivo olarak doğru membran segmentasyonundaki spesifik zorlukları ele almaktadır. Epitel niteliğindeki hücrelerde, membran reseptör seviyelerinin normalleştirilmesi, membran reseptör seviyelerinin bir kontrol belirtecine normalleştirilmesiyle otomatik olarak gerçekleştirilebilir, bu da tandem veya ayrı ayrı ifade edilebilir9. Gerçekten de, gastrulating embriyolarında ligand tanıma testini kullanırken böyle bir yaklaşım uyguladık14. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo hücre şeklinde karmaşık, hızlı değişikliklere uğrar ve membran segmentasyonunu hem 2D hem de 3D14'te zorlaştırır. Bu, birçok fizyolojik ortamda meydana gelen nötrofiller kümelendiğinde daha da zordur29. Kontrast metrik, membran segmentasyonu gerektirmediği, bunun yerine hücredeki reseptör dağılımının genel durumunu yansıttığı için bu sınırlamanın üstesinden gelir (membranöz / pürüzsüz vs veziküler / noktalı). Kontrast metriğinin görüntünün genel kontrastından etkilenebileceğine dikkat etmek önemlidir, bu nedenle farklı embriyolarda / örneklerde sinyalin değişkenliğini hesaba katmak için bireysel hücre değerlerinin dahili bir referansa normalleştirilmesi gerekir. Örneğin, CHT'deki yanıt vermeyen nötrofillerin ortalama hücre kontrast değerini kullandık (yani, sabit kalan ve ventral yüzgecine göç etmeyen nötrofiller)14. Ek bir olasılık, aynı hücredeki bir kontrol işaretçisinin kontrast değerleriyle normalleştirmek olacaktır. Bu, yanıt vermeyen hücrelerin dahili bir referansı mevcut olmadığında bir çözüm sağlayacaktır ve muhtemelen farklı koşullar arasındaki reseptör dinamiklerindeki daha ince nicel farklılıkları çözebilir.
Görüntülemenin yeri dikkate alınması gereken başka bir değişkendir. Burada ventral yüzgeç yarasının seçilmesinin nedeni, daha yaygın olarak kullanılan kuyruk yüzgeci yara modeli16,30'un aksine, yaralama yerinin nötrofil ikametgahı / göçmen kökenli bölgeye yakın olmasıdır. Bu, nötrofillerin gelmesi nispeten az zaman aldığı için tahlilin zaman çizelgesini hızlandırır. Ek olarak, hem göç kaynağında (CHT) hem de ilgilenilen hedef konumda (yara) hücre davranışını yakalama fırsatı sağlar. Bu burada önemlidir, çünkü hücre altı görüntüleme için gereken uzamsal ve zamansal çözünürlüğün geniş bir görüş alanı veya çok konumlu tarama ile birleştirilmesi zordur. Bu nedenle, ventral yüzgeç yara testi, göç orijininden göç yanıtının evriminin izlenmesine ve yanıt vermeyen hücrelerdeki spesifik olmayan reseptör dalgalanmalarının eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi, ikincisi, spesifik olmayan dinamikler için dahili bir referans sağladığı için niceleme amaçları için yararlıdır. Diğer sistemlerde, böyle bir iç referansa sahip olmak mümkün olmayabilir, bu durumda birlikte ifade edilen bir membran işaretleyicisinin kontrast değerleri alternatif bir kontrol sağlayacaktır.
Özetle, metodolojinin diğer sistemlere uygulanabilir olduğunu ve çeşitli amaçlar için konuşlandırılabileceğini öngörüyoruz. Örneğin, aynı muhabirler enfeksiyon ayarları veya diğer hastalık modelleri gibi diğer enflamatuar ortamlarda kullanılabilir. Zebra balığı reseptör raporlayıcı hatlarının repertuarı, sinyal mekanizmalarını anlamak veya ligand dinamiklerini in vivo olarak bildirmek için diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir. Yaklaşım, gözlemlenen dinamiklerin mekanik temelini sorgulamak için nakavt / nakavt teknikleriyle birleştirilebilir. Örneğin, ligand ekspresyonunun pertürbasyonu, gözlemlenen reseptör dinamikleri için ligand bağımlılığını gösterebilir. Gelecekte, sistemin muhabirlerin zincirleme olarak yerleştirilmesini içerecek şekilde daha da rafine edilebileceğini öngörüyoruz. Nihayetinde, bu metodolojiyi kullanan bulgular, memelilerde bu sinyal reseptörlerinin korunması ve bu çalışmaların daha büyük organizmalarda yürütülmesinin göreceli zorluğu göz önüne alındığında, zebra balığı topluluğunun ötesinde değerli yeni bilgiler sağlayacaktır.

Lökosit göçü immün yanıtlar için büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık hücreleri, dokuları ve kan damarlarını geçebilen ve mikroplara veya diğer önemli konakçı hücrelere doğru yönlü olarak göç etmek için bir dizi kimyasal rehberlik ipucunu algılayabilen prototipik göçmen hücrelerdir. Doğru rehberlik, kemokinlerin en belirgin kategori1'i temsil ettiği kemoattractantların tanınmasına dayanır. Kemokinler, oldukça spesifik yedi transmembran G protein eşleşmiş reseptörleri tarafından tanınır. Kemokin bağlanması üzerine, kemokin reseptörleri, ilişkili trimerik G proteinlerinin aktivasyonuna ve bunların sitoiskelet değişikliklerini ve yönlendirilmiş migrasyonunu destekleyen fonksiyonel sinyal alt birimlerine ayrışmasına yol açan konformasyonu değiştirir1. İkincil olarak, kemokin reseptörleri fosforile edilir ve bu modifikasyon, cezbedici için duyarsızlaştırmaya yol açar, bunu hızlı yeniden duyarlılaştırma / geri dönüşüm veya hücre içi bozunma ve hücre yüzeyinden aşağı regülasyonizleyebilir 2. Bu reseptör dinamikleri, hücreler tarafından alınan sinyallemenin süresini ve dozunu etkiler, ancak lökosit migrasyon davranışını nasıl etkilediklerini in vivo olarak aydınlatmak zor olmuştur.
Geleneksel memeli sistemlerinde canlı lökositlerdeki reseptör dinamiklerinin izlenmesi çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Canlı çalışmalar için, floresan proteinlerle reseptör füzyonları hücrelerde eksprese edilmelidir. Bu, birincil lökositlerde, özellikle nötrofillerde zordur ve şimdiye kadar yapılan çalışmalar, kemokin reseptörlerini 3,4 eksprese etmek için vekil nötrofil hücre hatlarını kullanmıştır. Lökositlerin bilgilendirici kaçakçılık kusurları5,6 olan bir floresan reseptörü veya mutant reseptörleri eksprese ettiği transgenik fare modellerinin oluşturulması, önemli miktarda zaman ve kaynak yatırımı gerektirir. Bu durumlarda bile, canlı hayvanda görüntüleme reseptör dinamikleri için görüntüleme çözünürlüğü ve kontrastı sınırlı olabilir ve çalışmalar sabit doku kesitleri5'te immünohistokimyayı kullanmıştır. Bu teknik zorluklar göz önüne alındığında, kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı bir doku ortamında hücre davranışını nasıl etkilediğine dair anlayışımız şu anda sınırlıdır.
Burada, zebra balığı nötrofillerinde reseptör kaçakçılığını izlemek için bir metodoloji sunuyoruz. Zebra balığı, fareler gibi genetik olarak izlenebilir, ancak transgenez, verimli transpozon sistemleri ve doğrudan zigot manipülasyonu7 kullanılarak nispeten daha basittir. Şeffaf larva ideal olarak görüntülemeye uygundur. Kemokin reseptör dinamikleri, primordiyan germ hücrelerinde ve lateral line primordiumda, floresan muhabirler 8,9,10 ile karşılık gelen füzyonların ekspresyonu ile görselleştirilmiştir. Zebra balığı larvaları, memeli nötrofillerine göre oldukça korunmuş genetik ve hücresel özelliklere sahip olgun nötrofiller ile donatılmıştır. Sitoiskelet dinamiği ve polarite düzenleyicileri gibi hücre altı sinyal dinamikleri, bu hücrelerde karşılık gelen transgenik çizgilerin üretilmesiyle görselleştirilmiştir11,12,13. Son zamanlarda, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerdeki kemokin reseptör dinamiklerini görselleştirdik ve fonksiyonel olarak analiz ettik14. Burada, nötrofillerde kemokin sinyalizasyonu için transgenik muhabir hatlarının üretimini, canlı görüntüleme için embriyoların hazırlanmasını, nötrofil sinyallemesini incelemek için bir yara tahlili ve görüntülerin elde edilmesi ve analizi için protokolü açıklıyoruz. Ayrıca, aday ligandlara kemokin reseptör yanıtlarını test etmek için bir yan protokol sağlıyoruz, bu da karakterize edilmemiş reseptörlerde ligand tanıma paternleri oluşturmaya çalışırken yararlıdır. Bu teknikler, endojen kemokin ekspresyonunun inhibisyonu veya değiştirilmiş ligand kaynaklı kaçakçılık ile mutant reseptörlerin üretilmesi gibi daha ileri genetik manipülasyonlarla kombinasyon halinde, spesifik sinyal dinamiklerinin lökosit davranışını in vivo olarak nasıl etkilediğini sorgulamak için kullanılabilir. Floresan etiketli kemokin reseptörlerini ifade eden transgenik çizgiler, doğrudan antikor boyama ile tespit edilmesi zor olan endojen kemokin gradyanları için muhabir olarak da kullanılabilir. Açıklanan metodoloji, muhabirlerin üretimini diğer immüno-sinyal reseptörlerine genişletmek için kapsam sağlar.

<table><tbody><tr><td>1-fenil-2-tiyoüre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Santrifüj Tüpü</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark kılcal cam</td><td>Harvard Aparatı</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline İnce Çamaşır Suyu</td><td>Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon kapsamı</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Blok ısıtıcı</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps, Kuyumcular Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı mikro kuyu tabakları</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Cam pastör pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon sistemi</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Enstrüman Şirketi</td><td>Alevli/Kahverengi P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>Termo-Bilimsel</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer İplik Diski UltraVIEW ERS, Olympus IX81 eğirme diski konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) Atık Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prizma GraphPad</td><td>Yazılımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük boya fırçası</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektral Uygulamalı Araştırma LMM5 lazer modülü</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Neşter Bıçağı No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity yazılımı</td><td></td><td></td><td></td>Yok</tr><tr><td>Yokogawa CSU10 eğirme diski konfokal tarayıcı</td><td>Yokogawa</td><td>Yok</td><td></td></tr></tbody></table>

yara yanıtları sırasında zebra balığı nötrofillerdeki kemokin reseptörlerinin canlı görüntülenmesi

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Kimyasal gradyanlar tarafından lökosit rehberliği, immün yanıtlar için gereklidir. Nötrofiller, önemli antimikrobiyal işlevleri yerine getirdikleri doku hasarı bölgelerine alınan ilk hücrelerdir. Bu lokuslara yapılan kaçakçılık, kemokinler de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuar kemoattractantlar tarafından düzenlenmektedir. Moleküler düzeyde, kemoattractant sinyalleme, karşılık gelen reseptörlerin hücre içi trafiği ile düzenlenir. Bununla birlikte, kemokin reseptörlerindeki hücre altı değişikliklerin hücre ve doku düzeyinde lökosit migrasyon dinamiklerini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Burada, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerde kemokin reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu araçlar, zebra balığı nötrofillerinde diferansiyel kemokin reseptörü kaçakçılığının, doku hasarı bölgelerinde nötrofil kümelenmesini ve dağılmasını koordine ettiğini ortaya koymuştur. Bunun, enflamatuar yanıtların kendi kendine nasıl çözüldüğünü anlamamız için etkileri vardır. Tarif edilen araçlar, çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda nötrofil göç paternlerini anlamak için kullanılabilir ve metodoloji diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir.

Ventral yüzgeç yaralanmasını KHT'den ventral yüzgece hızlı nötrofil mobilizasyonu ve 30-60 dakika içinde yara kenarında kümelenme izler (Şekil 1). Zebra balığı nötrofilleri 24 tarafından eksprese edilen ve eğirme diski konfokal mikroskopisi kullanarak Cxcl8a ve Cxcl8b14'ü tanıyan iki kemokin reseptörünün, Cxcr1 ve Cxcr2'nin dağılımını görselleştirdik. Nötrofillerin reseptörün floresan zamanlayıcı (FT) yapısını ifade ettiği, yani sfGFP ve tagRFP tandemiyle bir füzyon olan Tg (lyz: Cxcr1-FT) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) olmak üzere iki karşılık gelen transgenik çizgi ürettik (Şekil 2 ve referans14). İki floroforun kullanımı, çok çeşitli reseptör kaderlerinin izlenmesine izin vermek ve plazma zarında protein devir süresi tahminleri sağlamak için tasarlandı, çünkü yeni sentezlenen reseptörler yeşil renkte floresan olacak ve 8,14 yaşlarında giderek kırmızı hale gelecektir. Bununla birlikte, bu reseptörlerin nötrofil plazma membranında hızlı kurucu ciroya sahip olduğu ve ikamet süresinin tagRFP'nin olgunlaşma süresinden daha kısa olduğu, sfGFP'nin membran lokalizasyonunu gösterdiği ve tagRFP'nin kararlı durumda veziküler lokalizasyonu gösterdiği bulunmuştur (Ek Video 1 ve ref14). Bu nedenle, doku hasarı bölgelerinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi izlemek için sfGFP'nin dağılımına odaklandık. Reseptör dağılımının paterni, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını bildiren kontrast metriği kullanılarak ölçüldü. Gerekçe, reseptör dağılımı membranöz ve pürüzsüz olduğunda, kontrast değerinin düşük olmasıdır. Reseptör dağılımı veziküler ve daha fazla noktasal olduğunda, kontrast değeri yüksektir (Şekil 3).
Alternatif bir yöntem, reseptör seviyelerinin (sfGFP yoğunluğu) bir kontrol membranı belirtecinin seviyelerine oranını ölçmektir, örneğin membran CFP (mCFP) (Şekil 3). Her iki yöntem de, hücrede küresel olarak daha fazla veziküler reseptör dağılım paterni (daha yüksek kontrast değeri) veya membrandaki daha düşük reseptör seviyeleri (daha düşük sfGFP / mCFP oranı) ile belirtildiği gibi reseptör içselleştirmesini tespit edebilir. Bununla birlikte, kontrast metriği, membran segmentasyonunun daha az doğru olduğu ve uygulanamadığı yaradaki nötrofil kümelerinde reseptör içselleştirmesini de tespit edebilir (Şekil 3). Bu metriği kullanarak, yaralardaki nötrofillerde Cxcr1 ve Cxcr2 kaçakçılığı arasındaki gözle görülür farklılıkları ölçebildik (Şekil 4 ve Ek Video 2). Cxcr1-FT yarada bulunan hücrelerde içselleştirilirken, Cxcr2-FT yaradaki nötrofillerde membranöz kalmıştır (Şekil 4A-C, Ek Video 2 ve Ek Video 3). Morfolino tedavisi ile Cxcl8a ve Cxcl8b'nin baskılanması, yaralarda Cxcr1-FT içselleştirmesini farklı şekilde etkilemiştir (Şekil 4C,D). Cxcr1-FT'nin Cxcl8a'ya yanıt verdiğini daha da doğrulamak için, erken embriyolarda kemokin yanıt testleri yaptık. Cxcr1-FT'nin, Cxcl8a'nın birlikte eksprese edildiği embriyolarda belirgin bir şekilde içselleştirildiğini bulduk(Şekil 5). Tüm bu sonuçlar, nötrofillerde kemokin kaynaklı reseptör içselleştirmesini ölçmek ve bu etkilere aracılık eden ligandın kimliğini belirlemek için tarif edilen yöntemlerin uygulanabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Şekil 1: Ventral yüzgeç yaralarına nötrofil göçü. (A) (Solda) Kaudal hematopoetik dokunun (CHT), venüs dolaşımının (VC, mavi), ventral yüzgecin (VF) ve yara yerinin yerini gösteren 3 dpf larva karikatürü. (Sağda) Nötrofillerin CHT'den harekete geçirilmesi ve yarada kümelenmesiyle yaranın (W) alanını gösteren karikatür. CHT dokusunun kaudal ven pleksusu (CVP) mavi renkte çizilir. (B) Ventral yüzgeç yarasını ve Tg (mpx: GFP) larvalarındaki nötrofillerin dağılımını gösteren parlak alan görüntüsü (solda) ve konfokal projeksiyon (sağda) yaralama sonrası 2 saatte. Kesikli çizgiler VF ve CHT anahatlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiş karikatür ve floresan görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Şekil 2: Nötrofillerde kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi. (A) Cxcr1-FT (Floresan Zamanlayıcı) ve Cxcr2-FT'nin nötrofil-spesifik transgenik ekspresyonu için kullanılan yapılar 3 dpf transgenik larva (Tg(lyz:Cxcr1-FT), üstteki nötrofillerin konfokal projeksiyonları; Tg (lyz:Cxcr2-FT), alt) tRFP (macenta) ve sfGFP (yeşil) kanallarını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Şekil 1A'daki gibi 3 dpf larvanın anatomik şeması. Larvaların altında, yaranın (W) alanını gösteren şemalar, nötrofillerin CHT'den (üstte) mobilize edilmesi veya ventral yüzgece (alt) girdikten sonra kemotaksis yapılması ile tasvir edilir. Kesikli kare, sağdaki anlık görüntülerde görüntülenen alanı gösterir. (C) Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvalarındaki nötrofiller (sfGFP gösterilmiştir) CHT'den (üst paneller) veya kemotaksisten yaraya (alt paneller) doğru mobilizasyon üzerine. Oklar zaman içinde aynı hücreleri gösterir. Sağdaki görüntüdeki zaman noktaları, soldaki görüntüden sonra geçen dakikalardır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi için deneysel yaklaşımın şematik gösterimi. Paneller A-C ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Şekil 3: Reseptör dinamiklerinin nicelleştirme örnekleri. Yaralardaki tek (mavi) veya kümelenmiş nötrofiller (yeşil) veya CHT'deki (kırmızı, turuncu) mobilize edilmemiş nötrofiller, sonuçları karşılaştırmak için farklı yöntemlerle bölümlere ayrıldı ve analiz edildi. Gösterilen aynı örnek hücreler, görüntüde görülenleri çıkarılan değer aralığıyla ilişkilendirmek için iki yöntemle analiz edilmiştir. (A) Seçilen, örnek hücrelerin yüzeyi, sfGFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. (B) Kontrast, A'da gösterilen örnek hücrelerden hesaplandı. (C) Seçilen, örnek hücrelerin zarı, CFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. Bunu sfGFP/CFP'nin oranmetrik analizi izledi. (D) SfGFP / CFP oranı, C'de gösterilen örnek hücreler üzerinde hesaplanmıştır. hata çubukları, tek tek hücrelerden S.E.M.'yi temsil eder, n&gt;1 durumunda, buradaki değerler istatistiksel analiz için değil, yalnızca farklı niceleme yöntemleriyle elde edilen ölçümleri örneklemek için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Şekil 4: Yaralanmaya yanıt olarak Cxcr1 ve Cxcr2'nin diferansiyel dinamikleri. (A) Tg(lyz:Cxcr1-FT) veya Tg(lyz:Cxcr2-FT) larvalarındaki nötrofillerin yara sonrası 80 dakikada konfokal projeksiyonu (sfGFP kanalı gösterilmiştir). Ölçek çubuğu = 10 μm.  (B) Yarada büyütülmüş Cxcr1-FT nötrofil (solda) ve Cxcr2-FT (sağda). Yeşil reseptör gri renkte gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Normalleştirilmiş kontrast (CHT'deki mobilize edilmemiş hücrelerin ortalama kontrastına normalleştirilmiş bireysel nötrofil başına kontrast). cxcl8a, cxcl8a için çeviri bloke edici bir morfolino ile birlikte bir ekleme blokajının enjeksiyonunu ifade eder. cxcl8b, cxcl8b için ekleme bloke edici bir morfolino ile enjeksiyonu ifade eder. Tg (lyz: Cxcr1-FT için: n = 24 hücre (CHT), n = 8 larvadan 47 hücre (yara). Morfolinolu Tg (lyz: Cxcr1-FT) için: 5 larvadan n = 28 hücre (Cxcl8a-MO), 5 larvadan n = 16 hücre (Cxcl8b-MO). Tg (lyz: Cxcr2-FT için): n = 10 hücre (CHT) ve n = 20 hücre (yara) 3 larvadan. Veriler 1-5 görüntüleme seansında elde edilen bağımsız larvalardan toplandı. Kruskal-Wallis, Dunn'ın Tg (lyz: Cxcr1-FT) için çoklu karşılaştırma testi, Tg (lyz: Cxcr2-FT) için iki kuyruklu eşleşmemiş Mann-Whitney testi ile test edildi. (D) Cxcl8a morfolinosu (MO) (solda) ve cxcl8b MO (sağda) ile tedavi edilen Tg (lyz: Cxcr1-FT) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına (yeşil renkte gösterilen sfGFP kanalı) yanıt veren nötrofillerin konfokal projeksiyonu. Eşdeğer nötrofil birikiminin zaman noktalarında çekilen anlık görüntü (sol görüntüde 85 dakika yaralama sonrası ve sağ görüntüde 45 dakika yaralama sonrası). Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Şekil 5: Erken embriyolarda kemokin yanıt testi. Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA'nın ekspresyonunu ve dağılımını gösteren gastrulating embriyolarının lazer taramalı konfokal dilimleri, 150 pg Cxcl8a mRNA'lı veya Cxcl8a mRNA'sız bir hücre aşaması yumurtasına enjekte edildi. Yeşil ve kırmızı reseptörler ayrı kanallarda gösterilir. Kontrol membranı CFP işaretleyicisi (mCFP) camgöbeği kanalında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Film 1: 3 dpf'de bir Tg (lyz: Cxcr1-FT) (solda) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) (sağda) larvalarının kafasındaki transgenik nötrofiller. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 5 fps'dir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Film 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT) (solda) ve Tg(lyz:Cxcr2-FT) (sağda) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına yanıt veren nötrofiller. Film yaralama sonrası 10 dakika içinde başlar ve 60 dakika sürer. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 10 fps'dir. CHT = kaudal hematopoetik doku. VF = ventral yüzgeç. Ölçek çubuğu = 25 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Film 3. Yaralı bir Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgenik larvadan (Video 2'de gösterilenden farklı larva) nötrofillerin ek örnekleri, daha yüksek çözünürlükte elde edilir, CHT'de mobilizasyon üzerine veya girişte reseptör içselleşmesini (yeşil renkle gösterilen sfGFP kanalı) gösterir ve ventral yüzgeçte kemotaksis. Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 2 fps'dir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Nötrofiller, lokal olarak üretilen kimyasal ligandlara yanıt olarak yaralara sızan önemli enflamatuar hücrelerdir. Bu protokol, in vivo olarak bu tür ligandlara yanıt olarak reseptör dinamiklerinin görselleştirilmesine izin verir. Kemokin reseptör raportörlerinin kullanımı, enfeksiyon ve tümör modelleri gibi diğer fizyolojik ortamlara ve diğer bağışıklık hücrelerine genişletilebilir.Yöntem, lökositlerin kimyasal cezbedici molekülleri dokuda ne zaman ve nerede algıladığını izlemeyi mümkün kılar. Bu, bağışıklık tepkilerinin nasıl ortaya çıktığını ve çözüldüğünü daha iyi anlamayı sağlayabilir. Zebra balığı larvalarında ventral yüzgeç yaralaması yapmak, ince larva manipülasyonu gerektirir, bu nedenle deneysel amaçlar için tasarlanmamış larvalar üzerinde biraz pratik yapılması gerekir.Döllenmeden sonraki 2,5 ila 3,5. günlerde, anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarını floresan diseksiyon kapsamı altına yerleştirin ve transgenik reseptör ekspresyonu olan larvaları seçin. Seçilen larvaları E3 besiyeri takviyeli Trikain içeren 120 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve kaudal hematopoietik doku damarlarını kesmeden önemli nötrofil alımına neden olacak kadar derin kesilmiş her larvanın ventral yüzgecini kesmek için steril bir neşter kullanın. Cam tabanlı bir tabağa 500 mikrolitre 2X Trikain ekleyin, ardından 500 mikrolitre agaroz solüsyonu ekleyin ve pipet ucuyla hafifçe karıştırarak karıştırın.Yaralı anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarını tabağa aktarmak için bir pipet kullanın ve balığın kaudal kısmı cam tabana mümkün olduğunca yakın olacak şekilde hafifçe aşağı iterken embriyoyu yanal olarak yönlendirin. Embriyo pozisyonda olduğunda, agarozun soğumasını bekleyin. Beş ila 10 dakika sonra, katılaşmayı doğrulamak için jele küçük bir boya fırçası ile hafifçe dokunun ve plakaya mililitre Trikain başına 0.2 miligram takviye edilmiş iki mililitre E3 ortamı ekleyin.Dönen disk konfokal mikroskop kullanarak yara bölgesini görüntüleyin. Mümkün olan en kısa sürede, agaroz sertleştikten sonra, embriyoyu konfokal görüntüleme eğirme diski platformuna aktarın ve balığın yerini belirlemek için sahne joystick'ini ve mikroskop objektifini kullanın. 30 ila 40X objektifi kullanarak yara bölgesine odaklanın ve yaranın etrafını görüntülemek için alanı seçin.Lazeri seçin ve pozlama süresini ayarlayın, ardından istenen süre için her 30 saniyede bir timelapse ayarlayın ve görüş alanını belgelemek için bir Parlak Alan görüntüsü elde edin. Yara bölgesindeki nötrofil reseptörü içselleştirmesini ölçmek için, görüntü veri kümelerini Fiji'de açın ve her veri kümesi için temsili bir ilgi zaman çerçevesi seçmek için zaman kaydırıcısını kullanın. MATLAB'da yeni bir komut dosyası oluşturun ve görüntü okuma, açma ve ilgi noktalarının manuel olarak seçilmesi için işlevler ekleyin.İlgilenilen çerçeveyi açmak için komut dosyasını çalıştırın ve analiz için nötrofillere tıklayın. Hem ventral yüzgeç yarasında hem de kaudal hematopoietik dokuda centroidlerinin bir tahminini kaydedin. Aktif kontur tekniğini kullanarak her karedeki nötrofilleri bölümlere ayırın ve gri seviye birlikte oluşum matrisine dayalı nötrofillerin kontrastının hesaplanması da dahil olmak üzere her nötrofil için gri seviye birlikte oluşum matrisinin hesaplamasını eklemek için komut dosyasını oluşturun.Tüm kaudal hematopoietik doku nötrofillerinden ortalama nötrofil kontrast değerinin hesaplanması da dahil olmak üzere, ventral yüzgeçteki tek tek nötrofiller için değerleri ayrı ayrı kaydetmek için komutlar ekleyin. Yara bölgesindeki tek tek nötrofillerin kontrast değerinin normalleştirilmesini, kaudal hematopoietik doku nötrofillerinin hesaplanan ortalama kontrastına dahil edin ve kontrol yanıt vermeyen hücrelere göre tek tek yanıt veren hücreler içinde bir reseptörün görünümünün ne kadar noktalı olduğunu yansıtan normalleştirilmiş bir kontrast elde edin. Ardından komut dosyasını çalıştırmak için çalıştır'a tıklayın.Ventral yüzgeç yaralanmasını, kaudal hematopoietik dokudan ventral yüzgecin içine hızlı nötrofil mobilizasyonu ve yaralanma indüksiyonundan sonraki 30 ila 60 dakika içinde yara kenarında kümelenme takip eder. Bu analizde, zebra balığı nötrofilleri tarafından eksprese edilen kemokin reseptörleri CXCR1 ve CXCR2, eğirme diski konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Reseptör dağılımı modeli, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını bildiren kontrast metriği kullanılarak ölçüldü.Alternatif bir yöntem, reseptör seviyelerinin kontrollü bir membran markörünün seviyeleri üzerindeki oranını ölçmektir. Yaradaki nötrofil kümelerinde reseptör içselleştirmesini tespit etmek için kontrast metriği kullanılarak, yara bölgesindeki nötrofillerde CXCR1 ve CXCR2 trafiği arasındaki gözle görülür farklar ölçülebilir. Örneğin, bu analizde, yara bölgesinde bulunan hücrelerde floresan etiketli CXCR1 içselleştirmesi zamanla artarken, floresan etiketli CXCR2 yaradaki nötrofillerin zarlarında kaldı.CXCR1 ve CXCR2 ligandlarının morfolino tedavisi ile baskılanması, yara bölgesinde diferansiyel floresan etiketli CXCR1 içselleştirmesi ile sonuçlanır. Ek olarak, erken embriyolarda, floresan etiketli CXCR1, reseptör ligandının birlikte eksprese edildiği embriyolarda belirgin bir şekilde içselleştirilir. Bu protokolü denerken, yaralara nötrofil alımı sırasında reseptör dinamiklerini yakalamak için yaralamadan sonra görüntülemenin mümkün olduğunca çabuk yapılması gerektiğini unutmayın.Normal larvalarda kemokin reseptörlerinin görüntülenmesini takiben, araştırmacılar düzensiz inflamasyonu olan mutant larvalarda karşılaştırmalı görüntüleme yapabilirler.

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Bu video, fotokonvertibl yeşil floresan proteini eksprese eden transgenik zebra balığı larvaları kullanılarak lökosit alımının izlenmesini göstermektedir. Kırmızı floresan boya etiketli bakterilerin otik veziküle önceden enjekte edilmesi ve fotokonversiyonun indüklenmesi, lökositlerin göçünün, fagositozunun ve vücut boyunca dağılmasının gözlemlenmesini sağlayarak bağışıklık tepkisi dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Bakteriyel Enfekte Transgenik Zebra Balıklarında Fotokonversiyon Tabanlı Lökosit Takibi

Video, zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş mantar patojen enfeksiyonunu gözlemlemek için bir zebra balığı yaralama ve tuzak cihazı tekniğini göstermektedir. İlk enfeksiyon makrofajları çeker ve enfeksiyon devam ettikçe enjeksiyon bölgesinde nötrofil alımı ilerler.

Mantar Patojeni ile Enfekte Zebra Balığı Larvalarını Görselleştirmek için Bir zWEDGI Tekniği

Preneoplastik hücre ilerlemesi ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim erken olayları incelenmesi anlamak ve kanser tedavisinde çok önemlidir. Burada şartlı epitel hücre dönüşümleri ve HRAS G12V zebra balığı larvası deri hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşiminin daha sonra canlı görüntüleme uyarılması için bir yöntem tarif eder.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Burada, zebra balığı otik vezikülünde lokalize bir bakteriyel enfeksiyonun oluşturulması ve görüntülenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Reaktif elektrofilleri ve oksidanları (Z-REX) hedefleyen zebra balığı, reaktif küçük moleküllü sinyalizasyonun araştırılması için kimyasal biyoloji tabanlı bir yöntemdir. Bu teknik, farklı gelişim aşamalarındaki canlı balıklara uygulanabilir. Burada, zebra balığındaki standart tahlilleri sinyal yolu analizi için Z-REX ile birleştiriyoruz.

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Keşfedin canlı görüntüleme yöntemiyle zebra balığı nötrofillerinde kemokin reseptör dinamiklerini analiz etmeyi. Bu protokol, yaralanma yanıtları sırasında reseptör içselleşmesini niceliksel olarak değerlendirmeyi sağlar.

Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet