Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu
5 Kasım 2020
Pankreas suyu, insan pankreas kanseri için değerli bir biyobelirteç kaynağıdır. Burada intraoperatif toplama prosedürü için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu prosedürü murin modellerinde benimseme zorluğunun üstesinden gelmek için, alternatif bir örnek, tümör interstisyel sıvısı öneriyoruz ve burada izolasyonu için iki protokol açıklıyoruz.
Hem insanlarda hem de farelerde proksimal sıvıyı izole etmek için burada açıklanan yöntem, hastalığın yeni biyobelirteçlerini tanımlamak için pankreas kanserinin mikro çevresini incelemek için uygulanabilir. Bu basit protokolü kullanarak, mekanik çalışmalar yapmak için pankreas suyundan elde edilen klinik bulguları PDAC'ın fare modellerine çevirmek mümkündür. Pankreas suyu, ameliyat öncesi tanı ve hasta profiline yardımcı olmak için değerli biyobelirteçlerin kaynağı olarak umut vaat eden, büyük ölçüde keşfedilmemiş bir vücut sıvısıdır.
Protokolün ilk bölümünü göstereceğim ve laboratuvarımızdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Marialuisa Barbagallo protokolün ikinci bölümünü gösterecek. Görüntüleme sırasında elde edilen ölçümleri kullanarak pankreas kanalının yerini tahmin edin. Daha sonra kesin yerini belirlemek için pankreasın ön yüzeyini palpe edin.
Pankreas başını duodenumun altından tutun ve sol elinizle kaldırın, pankreas kanalının yerini ilk rakamla işaretleyin. Sağ elinizi kullanarak 25 gauge iğneli üç mililitrelik bir şırıngayı pankreasın içine, sol başparmağın hemen distaline yerleştirin. Ameliyat öncesi ölçümlere ve kanal duvarına nüfuz ettiği algısına dayanarak penetrasyon derinliğine ve iğnenin eğim derecesine karar verin.
Suyu şırınga ile geri çekin. Meyve suyunu almak mümkün değilse, pankreas kanalını kanüle etmek için iğnenin yerini değiştirin. Pankreas suyu alındıktan sonra, steril alanın dışına taşıyın ve üç mililitrelik bir EDTA vakum test tüpüne aktarın.
Numune laboratuvara aktarılana kadar tüpü dört santigrat derecede tutun. Pankreas suyunu işlemek için, hücreleri veya kalıntıları temizlemek için 400 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı geri kazanın, ayırın ve daha fazla analize kadar 80 santigrat derecede saklayın.
Tümör interstisyel sıvısını veya TIF'i santrifüjleme ile izole etmek için, tümörü ikiye bölün, iki parçayı PBS'de durulayın ve tümörden buharlaşmayı önlemek için mümkün olduğunca hızlı hareket ederek filtre kağıdına nazikçe kurulayın. Tümörü hemen 50 mililitrelik konik bir tüpe yapıştırılmış 20 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecine aktarın. Tüpü 400 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.
TIF'i tüpün altından geri kazanın, ardından alikot edin ve hemen kuru buz üzerinde dondurun. Daha fazla analize kadar 80 santigrat derecede saklayın. TIF'i elüsyon kullanarak izole etmek için, tümörü makas veya neşter ile küçük parçalara ayırın ve soğuk PBS ile dikkatlice durulayın.
Tümör parçalarını 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve analitlerin bozulmasını önlemek için bir Proteaz İnhibitörü Kokteyli ile 500 mikrolitre PBS ekleyin. Dokuyu 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. Süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve numuneden herhangi bir hücreyi çıkarmak için dört santigrat derecede bir dizi santrifüjleme adımı gerçekleştirin.
Her santrifüjlemeden sonra süpernatantın geri kazanılması ve yeni bir tüpe aktarılması. Son santrifüjlemeden sonra, TIF numunesini hemen alikotlayın ve kuru buz üzerinde dondurun. Daha fazla analize kadar 80 santigrat derecede saklayın.
Bu protokol, PDAC ve diğer iyi huylu pankreas rahatsızlıkları olan hastalardan pankreas suyu elde etmek için kullanıldı. Makromoleküllerin geniş NMR sinyallerini filtreledikten sonra, küçük moleküler ağırlıklı metabolitlerden gelen sinyaller belirgindi. Denetimli OPLS-DA analizi, pankreas suyundaki metabolik profilin, PDAC ve PDAC olmayan hastalar arasında% 82.4'lük bir doğrulukla ayrım yapabildiğini gösterdi. İlginç bir şekilde, aynı hastalardan alınan plazma örnekleri üzerinde yapılan metabolomik analiz, aynı ayırt edici gücü vermedi.
Tümör interstisyel sıvı içeriğinin tümör mikroçevresindeki değişiklikleri güvenilir bir şekilde yansıttığını göstermek için, zıt glikolitik oranlara sahip iki pankreas kanseri hücre hattı farelere deri altına enjekte edildi. Tümörler eksize edildikten sonra, glikoz ve laktat konsantrasyonları ölçüldü. Yüksek glikolitik tümörlerden elde edilen tümör interstisyel sıvısı, düşük glikolitik tümörlere kıyasla daha az glikoz ve daha fazla laktat içeriyordu.
Bu çalışmada metabolomik analiz yapıldı. Bununla birlikte, bu proksimal sıvılar, kütle spektrometresi ve mikroRNA profillemesi gibi diğer birçok alt uygulama için uygundur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, pankreas kanseri için değerli bir biyobelirteç kaynağı olan pankreas suyunun intraoperatif toplama yöntemini sunmaktadır. Ayrıca, alternatif bir örnek olan tümör interstisiyel sıvısını ve bu sıvının fare modellerinde izolasyonuna yönelik protokolleri tanıtmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Biyobelirteç keşfi
Arka Plan
- Pankreas özsuyu, biyobelirteç kaynağı olarak yeterince araştırılmamıştır.
- Ameliyat öncesi tanıya yardımcı olma potansiyeline sahiptir.
- Pankreas kanserinin mikroçevresini anlamak kritik öneme sahiptir.
- İnsan çalışmalarından elde edilen bulguların fare modellerine aktarılması araştırmaları geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Biyobelirteç tanımlaması için pankreas suyu ve tümör interstisyel sıvısını izole etmek.
- Hem insan hem de fare modellerinde uygulanabilir protokoller sağlamak.
- Pankreas kanserinin mekanistik çalışmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Ameliyat sırasında pankreas suyunun toplanması.
- Tümör interstisyel sıvısının izolasyonu.
- Pankreas kanalının yerini belirlemek için görüntüleme teknikleri.
- Kesin tanımlama için pankreasın palpasyonu.
Ana Sonuçlar
- Sıvı izolasyonu için gösterilmiş protokoller.
- Biyobelirteç kaynağı olarak pankreas sıvısının potansiyeli vurgulanmıştır.
- Klinik bulguların fare modellerine aktarılabilirliği gösterilmiştir.
- Gelecekteki mekanistik çalışmalar için bir temel sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Pankreas suyu ve tümör interstisyel sıvısı, biyobelirteç araştırmaları için gelecek vadeden kaynaklardır.
- Protokoller, pankreas kanserinin anlaşılmasını geliştirebilir.
- Bu sıvıların tüm potansiyelini araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Proksimal sıvı izolasyonu, pankreatik adenokarsinom mikroçevresinin doğrudan sorgulanmasına olanak tanıyarak, klinik gözlemler ile preklinik mekanistik çalışmalar arasında köprü kuran bir biyobelirteç keşif yolu sunar. Hem insan hem de fare sistemlerinde pankreas suyu ve tümör interstisiyel sıvısının toplanması için teknik olarak erişilebilir yöntemler sağlayarak protokol, mikroçevresel değişikliklere odaklanan hedef doğrulaması ve analiz geliştirme çalışmalarını destekler. Bu yaklaşım, stromal ve tümör hücresi etkileşimlerini yansıtan hastalıkla ilişkili sıvılar elde ederek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır ve pankreas kanseri ilaç keşif programlarındaki karar verme süreçlerini bilgilendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tümör mikroçevresi biyobelirteçlerini konsantre eden sıvıların izole edilerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Proksimal sıvı biyobelirteçlerini kullanarak fonksiyonel hedef doğrulaması için hastalığa özgü bir sistem sunar.
- Bilimsel Değer: TIF içindeki glikoz ve laktat kantifikasyonu aracılığıyla glikolitik tümör fenotiplerinin karşılaştırmalı analizi ile mekanistik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kütle spektrometrisi ve mikroRNA profilleme gibi sonraki uygulamalar için valide edilmiş biyolojik sıvılar hazırlar.
- Operasyonel Değer: Analiz ölçeklendirilebilirliğine uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir izolasyon protokolleri (santrifüjleme ve elüsyon) sunar.
- Bilimsel Değer: Ayırt edici güce sahip (OPLS-DA'da %82,4 doğruluk), taramaya hazır biyobelirteç tespitini mümkün kılan kantitatif metabolit okumaları sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnsan pankreas sıvısı bulgularını fare TIF modellerine aktararak hastalığa özgü sistem sürekliliğini sağlar.
- Operasyonel Değer: Mikroçevresel değişiklikleri yansıtan deri altı tümör modellerinden TIF izolasyonu yoluyla preklinik doğrulamayı kolaylaştırır.
- Stratejik Değer: Sıvı biyobelirteç profillerini tümör fenotipi ile ilişkilendirerek risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, erken hedeflemeden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilerek, mekanistik çalışmalara ve biyobelirteç odaklı tarama kampanyalarına temel oluşturan mikroçevresel profillemeye imkan tanır.
- Keşif Biyolojisi: PDAC'taki stromal-tümör etkileşimlerini yansıtan sıvıların izole edilmesi yoluyla hipotez testlerini ve yolklıklandırma süreçlerini destekler.
- Tarama: Kantitatif metabolit ve nükleik asit çıktıları sağlayan standartlaştırılmış TIF ve pankreas suyu izolasyonu ile analiz hazırlığına olanak tanır.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum analizi ve fenotipik tarama için ölçülebilir biyobelirteçler (glikoz, laktat, metabolitler) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Murin modellerde TIF'in tümör glikolitik durumunu yansıttığını göstererek keşif aşamasını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İnsan ve murin sistemlerinde proksimal sıvı izolasyonu için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturarak model translasyon engellerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: PDAC'da mikroçevresel biyobelirteç tespiti ve hedef doğrulaması yoluyla öngörücü güven.
- Operasyonel Değer: TIF izolasyonu için basit santrifüj ve elüsyon teknikleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Sıvı biyobelirteçleri tümör fenotipiyle ilişkilendirerek geç evre biyolojik risklerin azaltılması ve geliştirilmiş devam/durdur kararları.
- Portföy Etkisi: Biyobelirteç ayırt edici sıvı profillerine dayalı riskten arındırılmış önceliklendirme (PDAC ve non-PDAC arasında %82,4 doğruluk).
Uygulama Hususları
- Proksimal sıvı izolasyonu için cerrahi sıvı yönetimi ve tümör diseksiyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Pankreas özü ve TIF işlemleri için santrifüj ekipmanı (400 G, 4°C) ve steril sıvı yönetimi gereklidir.
- Numune bütünlüğü için cerrahi, patoloji ve analiz ekipleri arasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Doku boyutuna ve sonraki uygulamalara bağlı olarak, santrifüjasyon veya elüsyon yoluyla murine TIF izolasyonu için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Murine pankreas özü toplamadaki teknik zorluklar gibi pratik kısıtlamaları içerir ve bu durum TIF'in bir sürrogat olarak kullanılmasını gerektirir.
