Isothermal Mikrocalorimetri Kullanarak Yeni Doğal Ürünlerin Bakterisidal veya Bakteriyostatik Etkilerini Belirlemek Için Metabolik Profilleme

Yeni antibakteriyel bileşiklerin eylem modunu anlamak önemli ama zor bir iştir. Bu yöntem, bu tür mekanizmalar hakkında öngörüler sağlar ve uygulanması kolaydır. Bu teknik, antibakteriyel etkilerin noninvaziv bir şekilde gerçek zamanlı olarak gözlemlemesini sağlayarak daha fazla numune analizi sağlar.

Mikrobiyolojik tekniklerle pratik yapmak bir ön koşul olsa da, deneyi gerçekleştirmek kolaydır. Mikrokalorilimikrometreyi ilk kez yaparken veri analizi ile zaman ayırın çok önemlidir. Gece kültürünün optik yoğunluğunu ölçmek için 600 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak başlayın.

Kültürü 5 kez 10 ila 5. Sonra girdap tarafından hücreleri ile bileşik karıştırın. Kesici uçları hazırlamak için, her bakteri antibiyotik karışımının 120 mikrolitresini 48 kuyulu bir plakanın uygun kuyularına tek tek plastik kesici uçlara ekleyin ve titanyum şişelerin tümlerini tutuculara yerleştirmek için cımbız kullanın.

Uçları yavaşça tutucu plakadaki titanyum şişelere aktarın ve titanyum kapakları tüm şişelerin üzerine gevşek bir şekilde yerleştirin. Tüm kesici uçlar aktarıldığında, tutucuyu numune istasyonunun üzerinde belirlenen alana yerleştirin ve tüm kapakları sıkmak için 40 santimetreye ayarlanmış bir tork anahtarı kullanın. Sistem yazılımında, yeni bir deneme başlatın ve numune ekleme kolunu cihazdan geri alın.

Numune ekleme açılışına bakan sekiz numaralı sütunla bardak tutucuyu köprüye yerleştirin ve bardak tutucuyu birinci pozisyonda yavaşça aletin içine itin. Deneysel kuyuları etiketlemeden önce sistemin stabilize olması için 10 dakika bekleyin. Daha sonra, numune ekleme kolunu, bardak tutucu ikinci pozisyonda olana kadar itin.

Sistemin 20 dakika stabilize olmasına izin vererek, numune ekleme kolunu üç pozisyona itin ve numune ekleme kolunu çalışan konuma gelene kadar geri çekin. Yazılımdaki tüm kuyuları vurgulayın ve reaksiyon başlangıcını seçin, ardından ısı emisyonu okunan lar sıfıra inene kadar denemeyi çalıştırın. Çözümlemenin sonunda dur'u seçin.

Yazılım daha sonra emin olup olmadığını soracaktır. Evet'i seçin ve denemeyi veri analizi için kaydedin. Daha sonra numune ekleme kolunu tamamen aletin içine takın ve bardak tutucuyu almak için mıknatısları çalıştırın.

Verileri çözümlemek için yazılımı açın ve açık denemeyi seçin. Açılan pencerede, ilgi alanı denemesini seçin ve aç'ı tıklatın. Her konumdaki verileri normalleştirmek için tümünü seçin ve taban çizgisini tanımlayın.

Açılır pencerede, gecikme aşamasında 30 dakikadan uzun bir süre seçin. Seçimden sonra, anaçizgi termogramda yeşil olarak görünür. Temel bölüm penceresini tanımla, ardından kaydet'i tıklatın ve yazılımı kapatın.

Ardından, web tabanlı SymCel kalorimetre analizi uygulamasını açın. İlgi çekici dosyayı yüklemek ve denemeyi seçmek için göz atın'ı tıklatın. Metabolik parametreler 32 örnek için otomatik olarak hesaplanacaktır.

Isı akışı verilerini Gompertz ve/veya Richards Growth modellerine sığdırmak için büyüme işlevini tıklatın. Büyüme modelleri, akış bölümündeki ham verilerle karşılaştırma küçlükk bölümünde görüntülenir. Hesaplanan parametreleri indirmek için indirme ölçülerini tıklatın, dosya konumunu seçin ve kaydet'i tıklatın.

Dosya daha fazla analiz için bir elektronik tabloya dışa aktarılır. Burada A.baumannii DSM-30008'in seri seyreltmede siprofloksasin'e maruz bırakılarak elde edilen termogramlar görüntülenir. 0.005 ve 0.1 mikromolar arasındaki konsantrasyonlar A.baumannii büyüme ve metabolizma üzerinde minimal etkiye sahiptir.

0.5 mikromolar siprofloksasin ile hücrelerin tedavisinde, ancak, gecikme faz süresi önemli bir kayma ve daha düşük bir maksimum ısı akışı yol açar. Bu iki değişiklik birlikte zirveye kadar olan zamanı etkiler ve yaklaşık altı saatlik bir artışa neden olabilir. Bu şekilde, kümülatif serbest ısı eğim eğimi ile yansıyan her konsantrasyonetkisi ile zamana karşı çizilir.

Termogram eğiminin nicelleştirilmesi, 0.5 mikromolar siprofloksasin ile tedavi edilen hücrelerde gözlenen metabolik hızda eşlik eden bir azalma ile siprofloksasin varlığında A.baumannii maksimum metabolik hızının hesaplanmasına olanak sağlar. Rifampisin tedavisi A.baumannii DSM-30008 termogramları üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir. Metabolik aktivitede azalma ile ilişkili ısı emisyonu önemli bir azalma da görülmektedir.

Test edilen tüm konsantrasyonlar için zirveye kadar zaman artışı ve genellikle bakterisidal etkiye atfedilen tüm konsantrasyonlar için eğim azalması nedeniyle metabolik hızında azalma dikkat edin. En iyi sonuçları elde etmek için ters pipetleme kullanın ve numuneyi aktarırken kesicinin yanlarında ek sıvı oluşmasını önleyin, ayrıca kapakların düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun.