Name: İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Öğrenin, insan meme epitel hücrelerinde onkojenik dönüşümü in vitro değerlendirmek için hücre proliferasyonu, çapa bağımsız büyüme ve 3D kültürde soy dağılımı analiz yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AG laboratuvarı İspanya Nükleer Güvenlik Konseyi tarafından finanse edilmektedir. T.A. ve A.G. Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503) tarafından tanınan bir araştırma grubunun üyeleridir. MT Bilimsel Vakfı Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR] tarafından finanse edilen bir sözleşme tutar. G.F. sözleşmesi Cellex Vakfı'nın hibesi ile finanse edilmektedir.

Aşağıdaki deneylerde kullanılan insan örnekleri clínica Pilar Sant Jordi 'de (Barselona) standart prosedür onayı altında yapılan mammoplastilerden elde edilmiştir. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini'nde gerçekleştirilir.
1. İnsan meme epitel hücrelerinin in vitro kültür ve büyüme eğrisi arsa birikimi
<ol><li>
Meme primer epitel hücrelerinin in vitro kültürü (BPEP): hücre geçişi NOT: BPEC türetme ve hücre kültürü için Ince ve ark., 20076tarafından açıklanan talimatları izleyin.<ol>
<li>Orta hazırlık.<ol>
<li>Ek WIT bazal P veya T takviyeleri ile tanımlanan orta, üretici tarafından sağlanan, birincil veya dönüştürülmüş BPECs kültürlü olup olmadığına bağlı olarak.</li>
			<li>Takviye WIT ortamına, birincil veya dönüştürülmüş BPEC'ler için 25 ng/mL için 100 ng/mL'lik son konsantrasyona kolera toksini ekleyin. DİkKAT: Kolera toksini yutulursa ölümcüldür. Kişisel koruyucu ekipman kullanın. Çevreye salınmasından kaçının.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hücre kültürü bakımı ve geçişi. NOT: Aşağıdaki adımlar için hücrelerin bir T25 şişesinde büyüdüğünü unutmayın. Bununla birlikte, hacimler yüzey alanı açısından orantılılığı koruyan diğer hücre kültürü biçimlerine uyarlanabilir.<ol>
<li><li><li><li><li><li><li><li><li></li><li> </li><li></li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ01.jpg"> </li><li></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ02.jpg"> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li></li></ol></li><li> <ol><li><li></li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> <ol><li><li></ol></li><li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> <ol><li> </li><li></li></ol></li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ03.jpg"></li><li><ol><li></li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ04.jpg"> </li><li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li>
<li>Repullés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22European+BioImage+Analysis+Symposium%22%5BJournal%5D)">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).</li>
<li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede açıklanan deneysel protokoller in vitro kültür hücrelerinin onkojenik dönüşümünü değerlendirmek için yararlı araçlar sağlar. Her teknik dönüşüm sürecinin belirli yönlerini değerlendirir ve bu nedenle tek bir analizden sonuç çıkarken özel dikkat edilmelidir. Büyüme eğrileri birikme başka amaçlar için hücreleri biriktirme zaman zaten mevcut bilgi gerektiren bir yaklaşımdır. Bu, bu tekniği diğer hücre çoğalma tahlillerine göre daha ucuz ve daha kolay uygulanmasını sağlar. Ancak, geçerli sonuçlar elde etmek için,...

Neoplazm gelişimi için birden fazla ardışık olay gereklidir. 2011 yılında Hanahan ve Weinberg dönüştürülmüş hücrelerin büyümesini, hayatta kalmalarını ve yayılmasını sağlayan 10 yeteneği tanımladı: sözde "Kanser Damgaları"1. Burada açıklanan metodoloji, tümör hücrelerinin ayırt edici özelliklerinden bazılarına odaklanarak in vitro hücresel dönüşümü değerlendirmek için üç farklı araç derlemektedir. Bu teknikler hücre çoğalma oranını, 3Boyutlu kültüredildiğinde hücrelerin davranışlarını ve ankraj bağımsızlığı olan koloniler oluşturma kapasitelerini değerlendirir.
Hücre modelleri in in vitro hipotezi test etmek için çok önemlidir. Farklı yaklaşımlar kanser çalışması için hücresel dönüşüm deneysel modeller oluşturmak için geliştirilmiştir2,3,4. Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık görülen kanser olduğundan ve kadınlar arasında kanser ölümlerinin yaklaşık% 15 sorumludur5, meme epitel hücrelerinin uygun hücresel modeller sağlayan daha fazla araştırma için son derece önemlidir. Bu makalede, biz meme primer epitel hücreleri deneysel bir model kullanarak hücresel dönüşümü değerlendirmek için üç teknik potansiyelini resimli var (BPEPs) dönüşüm başlangıçta İnce ve meslektaşları tarafından açıklanan 20076 ve daha sonra bizimlaboratuvardauygulanan 7 . Bu deneysel model üç hedefli genin (SV40 Large T ve küçük t antijenleri burada Ttag, hTERTve HRASolarak anılacaktır) olmayan bpecs genomuna sıralı değişiklik dayanmaktadır. Ayrıca, BPEP'ler türev için kullanılan yöntem, meme bezi fizyolojik özelliklerinin bazılarını koruyan heterojen bir hücre kültürü ile sonuçlanan, luminal veya miyoepitelyal belirteçleri ile meme epitel hücrelerinin bakım yanadır.
Meme bezinde, süt üretiminden sorumlu olan luminal meme epitel hücreleri lümenin yakınında bulunurken, miyoepitelyal hücreler luminal hücrelerin etrafına atılır ve sütü nisine meme ucuna götüren kasılma hareketlerine dikkat eder. Bu hücre soyu arasında uygun organizasyonun kaybedilmesi, 3D hücre kültürlerinde farklı soy belirteçlerinin immünororesan saptanması sonrasında in vitro olarak değerlendirilebilen tümöral transformasyon8'in bir özelliğidir. Tümörhücrelerinin bir diğer önemli özelliği diğer hücrelere bağlanmadan ve hücre dışı matriks1'ebağlanmadan büyüme kapasiteleridir. Sağlıklı hücreler süspansiyon içinde büyümeye zorlandığında, anoikis \u2012 gibi mekanizmalar hücre dışı matris \u2012 ayrılmasına yanıt olarak indüklenen hücre ölümü türü9aktive edilir . Hücre ölümü kaçırma kanserin ayırt edici özelliklerinden biridir ve böylece, dönüştürülmüş hücreler anoikis inaktive ve çapa bağımsız bir şekilde hayatta yeteneğine sahiptir. Bu kapasite, yumuşak agar kullanılarak ankrajdan bağımsız bir teşp ile in vitro olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, tümöral dokuların doğal bir özelliği, sadece süspansiyon tahlillerinde değil, aynı zamanda tek katmanlı yapışık kültürlerin büyüme hızını izleyerek, zaman içinde hücre sayısının artışını ölçerek in vitro koşullarda kolayca izlenebilen sürekli proliferatif sinyalizasyon kapasitesidir.
Tümörijenik potansiyeli test etmek için en iyi model murine modellerinde tümör hücrelerinin aşılanması ve yerinde tümör gelişiminin değerlendirilmesi olmasına rağmen, deneysel işlemlerde kullanılan hayvan sayısını mümkün olduğunca en aza indirmek önemlidir. Bu nedenle, in vitro dönüşümü değerlendirmek için uygun testlere sahip olmak en önemli önceliktir. Burada, hücresel dönüşüm modelleri ile çalışan laboratuvarların çoğunda kolayca uygulanabilen kısmen ve tamamen dönüştürülmüş meme epitel hücrelerinin tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için bir dizi araç salıyoruz.

<table><tbody><tr><td>1 ml Serolojik Pipetler</td><td>Labclinics</td><td>PLC91001</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorfs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451</td><td>MTT uzun süreli saklama için koyu eppendorflar tercih edilir</td></tr><tr><td>10 & mu; l Filtresiz pipet uçları</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr><td>100 ml cam şişe</td><td></td><td></td><td>Kapaklı, otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>1000 & l Filtreli Pipet uçları</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 & mu; l Filtresiz pipet uçları</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konik tüpler</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serolojik Pipetler</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; l Filtreli pipet uçları</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serolojik Pipetler</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüpler</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>İmmünofloresan etiketlemeden önce 3D yapı fiksasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Ankraj testi için kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-Claudin 4 antikoru</td><td>Abcam</td><td>15104, RRID: AB_301650</td><td>Çalışma seyreltmesi 1:100, konakçı: tavşan</td></tr><tr><td>Anti-Sitokeratin 14 [RCK107] antikoru</td><td>Abcam</td><td>9220, RRID: AB_307087</td><td>Çalışma seyreltme 1:100, ev sahibi: fare</td></tr><tr><td>Anti-fare Siyanin Cy3 antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td><td>Çalışma seyreltmesi 1:500, ev sahibi: keçi</td></tr><tr><td>Anti-tavşan Alexa Fluor 488 antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034, RRID:AB_2576217</td><td>Çalışma seyreltmesi 1:500, ev sahibi: keçi</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü 24 oyuklu Plate</td><td>Labclinics</td><td>PLC30024</td><td>Matrigel'de 3B kültürler için kullanılır. Düz Tabanlı</td></tr><tr><td>Hücre kültürü 6 kuyulu Plaka</td><td>Laboratuvarları</td><td>PLC30006</td><td>Ankraj tahlili için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre inkübatörü (37 &gtm; C ve %5 CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisherbrand</td><td>11587522</td><td>Ağ boyutu: 40 &mu; m</td></tr><tr><td>CellSense yazılımı</td><td>Olympus</td><td></td><td>Görüntü almak için kullanılır</td></tr><tr><td>Vibrio cholerae'den Kolera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Toksini Santrifüj Sigma-Aldrich C8052 Hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır <tr><td>Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal ters çevrilmiş Mikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camları</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 X 22 mm, kalınlık 0,13 - 0,17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2- (4-amidinofenil) -1H -indol-6-karboksamidin</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td>Tripsin etkisini etkisiz hale getirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Fiji yazılımı (ImageJ)</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>Ücretsiz indirme, lisans gerekmez</td></tr><tr><td>Cam Pastör Pipetleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Fisherbrand</td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>3D yapıların immünofloresanı için kullanılır</td></tr><tr><td>Isıya Dayanıklı Eldivenler</td><td></td><td></td><td>Otoklavdan sonra agar manipülasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Isıtıcı banyosu (37 &gtm; C)</td><td></td><td></td> <td>Hücre subkültür Isıtıcı banyosundan önce çözeltileri temperlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>(42 &gtm; C)</td><td></td><td></td> <td>Agarı sıcak tutmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td></td><td></td><td>Matrigel dehidrasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Nemli oda</td><td></td><td></td><td>İmmünofloresan sırasında antikorların inkübasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Matrigel manipülasyonu sırasında kullanılan</td><td>buz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td></td><td></td><td></td></tr> kutusu <tr><td>Ters Optik Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>354234</td><td>-20 &ordm'de mağaza; C ve kullanım sırasında soğuk tutun. Bazal membran matrisi olarak adlandırılır</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>İmmünofloresan etiketlemeden önce 3D yapı fiksasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikropipet</td><td></td><td></td><td>p1000, p200 ve p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>Nüfusun iki katına çıkmasını hesaplamak ve büyüme hızı denklemi</td></tr><tr><td>MilliQ suyunu</td><td></td><td></td> <td>elde etmek için kullanılırUltra saf su olarak adlandırılır</td></tr><tr><td>Oje</td><td></td><td></td><td>Montajdan sonra numuneleri kapatmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>İnkübasyon sırasında antikor çözeltisini örtmek için kullanılır</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (kalsiyum ve magnezyum olmadan)</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>Steril. Hücre alt kültürü</td></tr><tr><td>PBS tabletleri</td> için kullanılır <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>MiliQ suda seyreltin. Sterilite gerekmez. İmmünofloresan için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipet Yardımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25 şişeleri</td><td>Corning</td><td>353808</td><td>BPEC kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>Asa Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Alternatif olarak, bir hemositometre kullanın</td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td>Pipet uçlarını ve parafilmi kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Steril filtreler 0.22 & mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>MTT çözeltisini filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>3D yapıların immünofloresansı için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA 10X</td><td>Biowest</td><td>X0930</td><td>3X çözelti elde etmek için PBS'de seyreltin</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montaj Ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>WIT-P-NC Kültür Ortamı</td><td>Stemgent</td><td>00-0051</td><td>Birincil BPEC kültürü</td></tr><tr><td>WIT-T için kullanılır Kültür Ortamı</td><td>Stemgent</td><td>00-0047</td><td>Dönüştürülmüş BPEC kültürü için kullanılır</td></tr></tbody></table>

İnsan meme epitel hücrelerinde onkojenik dönüşümün İn vitro değerlendirilmesi

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tümörigenez, hücrelerin düşmanca koşullar altında büyüme, hayatta kalma ve yayılmaya izin veren yetenekler edindiği çok aşamalı bir süreçtir. Farklı testler belirlemek ve kanserli hücrelerin bu işaretleri ölçmek için aramak; ancak, genellikle hücresel dönüşümün tek bir yönü üzerinde odaklanmak ve, aslında, birden fazla test onların uygun karakterizasyonu için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, araştırmacılara hücresel dönüşümü geniş bir perspektiften değerlendirmek için bir dizi araç sağlamak ve böylece sağlam sonuçlar elde etmeyi mümkün kılmaktır.
Sürekli proliferatif sinyal aktivasyonu tümöral dokuların en önemli özelliğidir ve zaman içinde elde edilen popülasyon sayısı nın hesaplanmasıyla in vitro koşullarda kolayca izlenebilir. Ayrıca, 3D kültürlerde hücrelerin büyüme çevreleyen hücreler ile etkileşimsağlar, in vivo oluşur ne benzer. Bu, hücresel agregasyonun değerlendirilmesini ve farklı hücresel belirteçlerin immünororesan etiketlemesi ile birlikte tümöral dönüşümün bir diğer ilgili özelliği hakkında bilgi edinmesini sağlar: uygun organizasyonun kaybı. Dönüştürülmüş hücrelerin bir diğer dikkat çekici özelliği diğer hücrelere bağlanmadan ve hücre dışı matris, hangi ankraj tsay ile değerlendirilebilir olmadan büyümek için kapasiteleridir.
Hücre büyüme hızını değerlendirmek, 3Boyutlu kültürlerde hücre soyundan belirteçlerin immünororesan etiketlemesini gerçekleştirmek ve yumuşak agarlarda ankrajdan bağımsız hücre büyümesini test etmek için ayrıntılı deneysel prosedürler sağlanmaktadır. Bu metodolojiler meme kanserinde alaka nedeniyle Meme Primer Epitel Hücreleri (BPEC) için optimize edilsin; ancak, bazı ayarlamalardan sonra diğer hücre türlerine yordamlar uygulanabilir.

BpECs üç genetik elementin tanıtımı ile hücresel dönüşüm deneysel bir model onkojenik dönüşümtemsilisonuçlar üretmek için seçildi 6,7 (Şekil 3). Dönüştürülmeyen BPEC'ler(N),İnce vemeslektaşları tarafından açıklandığı gibi hastalıksız meme dokusundan 6 ve burada belirtilen protokolü takip ederek kültürlü olarak elde edilmiştir. STASIS üstesinden geldikten sonra (stres veya anormal siny...

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Bu metodoloji, herhangi bir hücre modelinin dönüşüm derecesini değerlendirmek için farklı göstergelerin entegrasyonunu kullanır. Bu teknik, araştırmacılara in vitro hücre dönüşümünü değerlendirmek için zaman alıcı ancak kullanımı kolay bir dizi araç sağlar. Bu, yöntemin çoğu laboratuvarda kullanılmasına izin verir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Teresa Anglada ve bir mikroskopi uzmanı olan Joan Repulles olacak. Meme primer epitel hücre kültürü% 90'a ulaştığında, süpernatanı kültür şişesinden iki mililitre fetal sığır serumu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücrelere 37 santigrat derecede beş dakika boyunca bir mililitre tripsin uygulayın.Hücreler ayrıldığında, tripsini ayrılmış ortamla etkisiz hale getirin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peleti yeniden süspanse etmek için tüpü hafifçe vurun ve saymak için bir ila iki mililitre taze ortam ekleyin. Hücre konsantrasyonunu belirledikten sonra, yeni bir tüpe 300.000 hücre ekleyin ve son hacmi ilave taze kültür ortamı ile beş mililitreye getirin.Hücreleri yeni bir T25 şişesine tohumlayın ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ardından, birikmiş nüfus ikiye katlanma sayısını hesaplamak için formülü kullanın. Hücrelerin çoğalma hızını değerlendirmek için, belirli bir zaman aralığı için birikmiş popülasyon iki katına çıkma sayısını çizin.Artan bir eğim, hücre çoğalma hızının arttığını gösterir. Bir 3D hücre kültürü oluşturmak için, 1.9 santimetre kare yüzey alanına sahip kuyuları soğuk steril PBS ile durulayın ve her bir kuyunun tabanını 100 mikrolitre bazal membran matrisi ile kaplayın. Ardından, matrisin katılaşmasına izin vermek için plakayı yaklaşık 20 dakika hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Bu arada, meme hücrelerini az önce gösterildiği gibi hasat edin ve hücreleri mililitre orta konsantrasyonda 400.000 hücreye seyreltin. Hücreleri, bire bir oranda% 8 bazal membran matrisi ile desteklenmiş taze ortamla karıştırın ve katılaşmış matrisin her bir kuyusuna 500 mikrolitre hücre ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede birkaç dakika inkübe edin, ardından her oyuğa %4 bazal membran matrisi ile desteklenmiş 500 mikrolitre ortam ekleyin.Hücreleri 14 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Tohumlanan hücreler gruplanacak ve çoğalarak asini benzeri yapılar oluşturacaktır. 3D kültürlenmiş meme hücrelerinde immünofloresan protein tespiti için, bazal membran matrisini her bir oyuktan çıkarmak için bir kesme P200 pipet ucu kullanın ve her bir oyuktan yaklaşık 50 mikrolitre ayrıştırılmış matrisi ayrı ayrı cam slaytlara sürün.Numuneler tamamen kuruduğunda, hücreleri eksi 20 santigrat derecede 30 dakika boyunca bire bir metanol-aseton çözeltisi ile sabitleyin. Sabitledikten sonra, numuneleri oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke edici çözelti ile bloke edin. İnkübasyonun sonunda, ilgilenilen birincil antikor çalışma solüsyonundan 30 mikrolitre ekleyin ve slaytları nemli bir odada dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için bir laboratuvar sarma filmi şeridi ile kaplayın.Ertesi sabah, slaytları yıkama başına bir saat boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve numuneleri az önce gösterildiği gibi uygun ikincil antikor çözeltisi ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, solmaya karşı montaj ortamında seyreltilmiş DAPI ile karşı boyamadan ve her slaytı bir lamel ile kaplamadan önce, numuneleri yıkama başına iki saat boyunca PBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra konfokal bir mikroskopta her bir asinüs için floresan sinyal dağılımını analiz edin.Ankrajdan bağımsız bir tahlil yapmak için, önce altı oyuklu bir plakanın uygun sayıda oyuğunun dibini orta çözeltide 1,5 mililitre% 0,6 agar ile örtün ve agarın oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Daha sonra, gösterildiği gibi mililitrelik çözelti başına beş kez 10 ila dördüncü hücre hazırlayın ve hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten steril 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Tüpü 45 derecelik bir açıyla tutarak, tüpün duvarından aşağı orta çözelti içinde eşit hacimde% 0.6 agar ekleyin.Ve iyice karıştırdıktan sonra, önceden hazırlanmış altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna agar süspansiyonunda bir mililitre hücre katmanı. Hücrelerin agar boyunca homojen bir şekilde dağıldığını doğrulamak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Agar tamamen katılaştığında, agarı rahatsız etmeden her bir oyuğa dikkatlice bir mililitre yenileme ortamı ekleyin ve hücreleri üç hafta boyunca inkübe edin, ortamı haftada iki kez değiştirin.Koloni oluşum süresinin sonunda, hücre kültürü inkübatöründe 24 saatlik bir inkübasyon için ortamı oyuk başına mililitre MTT başına bir mililitre bir miligram ile değiştirin. Ertesi gün, MTT'yi her bir kuyucuktan çıkarın ve ters çevrilmiş mikroskopta her bir oyuğun görüntülerini alın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, görüntüleri ImageJ'de açın ve görüntüyü tıklayın, ayarlayın, eşikleyin ve orijinal görüntünün eşiklenmesi yoluyla ikili bir maske elde etmek için uygulayın.İyi sınırlandırılmış koloniler elde edildiğinde, MTT pozitif kolonileri tanımlamak için genişletilmiş partikül analizörünü başlatmak için eklentileri ve biovoxxel'i seçin. Belirli bir zaman aralığında, kısmen ve tamamen transforme olmuş hücreler, transforme edilmemiş hücrelere kıyasla daha yüksek sayıda popülasyon ikiye katlanması elde eder, bu da hücre bölünme hızının dönüşüm süreci ile arttığını gösterir. İki haftalık 3D hücre kültürü periyodu boyunca, hücreler toplanır ve çoğalır, bu da asini boyutunu arttırır.Her bir asinusun uygun polarizasyonu, konfokal mikroskopi ile üç boyutlu sinyal konumu ile birlikte protein immünofloresan tespiti kullanılarak doğru bir şekilde değerlendirilebilir. Transforme olmamış meme hücrelerinin oluşturduğu asini'nin tamamı düzgün bir şekilde organize olurken, kısmen ve tamamen transforme olmuş hücrelerin oluşturduğu asini'de polarizasyon kaybı gözlenir. Üç haftalık gömülü agar kültüründen sonra, ankrajdan bağımsız büyüme kapasitesine sahip hücreler, birden fazla hücreden oluşan kolonilere yol açar.Sadece metabolik olarak aktif hücreler tetrazolyum MTT halkasını parçalayabilir ve 24 saat sonra mor MTT formazan kristalleri ile sonuçlanır. Koloni çapının otomatik görüntü analizi ile ölçülmesi, düşük proliferatif kolonilerin veya tek tek hücrelerin filtrelenmesini sağlar. Transforme olmamış hücrelerin oluşturduğu kolonilerin sayısı, kısmen ve tamamen transforme olmuş hücrelerden elde edilenlere kıyasla ihmal edilebilir düzeydedir.Koloni büyüklüğü, farklı dönüşüm derecelerine sahip hücreler arasında ayrım yapmak için de kullanılabilir. Bu tahliller, herhangi bir aşılamadan önce hücre dizilerini taramak için kullanılabilir, çünkü yalnızca in vitro olarak pozitif test edilen hücre dizileri farelere aşılanmalıdır.

in-vitro-evaluation-oncogenic-transformation-human-mammary-epithelial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu raporda, izole etmek için bir sistem ve fare meme bezi kültür donör hücreleri göstermek ve bu hücrelerin orthotopically nakli stromal analiz etmek için alıcı farelerde meme tümör gelişimi sırasında epitelyal etkileşimler.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Odak Oluşumu Testi aday onkogen dönüşürken potansiyelini değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir.  Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Bu protokol, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine iletmek için meme ucu yoluyla viral vektörlerin intraduktal enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, insan meme epitel hücrelerinde onkojenik dönüşümü in vitro değerlendirmek için hücre proliferasyonu, çapa bağımsız büyüme ve 3D kültürde soy dağılımı analiz yöntemlerini.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet