Name: Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin, 3D eş-kültür sistemi kullanarak yumurtalık kanseri kök benzeri hücrelerin anjiyogenetik özelliklerini. Bu yöntem, tümör mikroçevresinin yeniden şekillenmesini ve metastazdaki rolünü analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Japonya Eğitim, Bilim ve Kültür Bakanlığı'ndan Bilimsel Araştırma C (K.N.'ye hibe no. 19K09834) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler insan refahı için Etik Kurul tarafından onaylanan protokol kapsamında gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalar, örneklerinin araştırma kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler ve bu çalışma için dokuların toplanması ve kullanılması, Teikyo Üniversitesi İnsan Genomu, Gen Analizi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı.
1. Yumurtalık kanseri kök hücrelerinin (OKSK) izolasyonu ve kültürü Yumurtalık kanseri ve asit hastalarından seviye 2 biyogüvenlik kabininde
<ol><li>Kanser kök hücrelerini, parasentez yoluyla elde edilen insan yumurtalık kanseri asitlerinden izole edin. Yeterli sayıda kanser kök hücresi almak için hastalardan en az 100-250 mL asit toplayın. Ek olarak, kanser kök hücre belirteçlerinin (yani, EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 ve Oct4) ve yumurtalık kanseri belirteçlerinin (pAX-8, WT-1) ekspresyon profillerini akış sitometrisi ile değerlendirin.<ol><li>İnsan yumurtalık kanseri asitlerini asit aspirasyonundan sonra 24 saat içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı çıkarın ve 2 mL OCSC ortamı ve 8 mL% 30 Histodenz / fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>OCSC ortamını hazırlayın: StemPro hESC takviyesi, L-glutamin (GlutaMAX ortamı) ile DMEM⁄F-12,% 25 BSA, 100 μM 2-merkaptoetanol, 8 ng / mL FGF BASIC, 10 μM insülin ve 20 μM Y-27632.</li>
		<li>15 mL'lik bir tüpte 1.1.2 adımında hücre çözeltisine 2 mL OCSC ortamını dikkatlice yerleştirin ve frenlemeden sallanan kova rotorunda oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>OCSC tabakasını (interfazda bozulmadan) transfer pipeti ile dikkatlice yeni bir 15 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>15 mL'ye kadar PBS ile doldurun. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.</li>
		<li>Hücre peletini OCSC ortamında yeniden askıya alın ve ultra düşük tutturmalı bir kültür kabına tohumlayın; kültürler %5 CO2 ile 37 °C'de tutulmalıdır.</li>
		<li>Ortamı her üç günde bir değiştirin. Kültür tabağını yaklaşık 1 dakika boyunca dikkatlice bekletin ve süpernatantın bir kısmını atın ve yeni ortamı ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>CSC'lerin geçişi<ol><li>OCSC'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı çıkarın, PBS ile doldurun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın, proteolitik ve kollajenolitik enzimlerden (örneğin, AccuMax) oluşan hücre ayrılma çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Pipetleme yaparak iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Hücrelerin tek bir süspansiyonda olduğundan emin olun.</li>
		<li>Pipetleme yaparak iyice karıştırın, PBS ile doldurun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatantı çıkarın ve ultra düşük ataşmanlı kültür kaplarında daha sonra tohumlama ve% 5 CO2'de 37 ° C'de bakım için OCSC ortamında hücre peletini yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HUEhT-1 endotel hücre kültürü
<ol><li>HUEhT-1 hücrelerinin geçişi<ol><li>HUEhT-1 kültür kabından besini çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın.</li>
		<li>1 mL% 0.025 tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>5 mL Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2 ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın, hücre peletini HUEhT-1 ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri kollajen kaplı kültür kaplarına tohumlayın, ardından% 5 CO2'de 37 ° C'de bakım yapın.</li>
		<li>Ortamı her üç günde bir değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. HUEhT-1 hücreleri kullanılarak tüp oluşum testi için NICO-1 Kokültür Plakasının hazırlanması
<ol><li>NICO-1'i ve kaplamayı hücre dışı matris bazlı hidrojel (Matrigel Matrix) ile birleştirin.<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek NICO-1'in bir tarafını monte edin ve buz üzerinde tutun.</li>
		<li>NICO-1'in yüzeyini 300 μL soğuk PBS ile örtün ve ardından tamponu çıkarın.</li>
		<li>300 μL soğutulmuş hücre dışı matris bazlı hidrojel ekleyin ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Dengelemek için filtreyi %100 etanol ile batırın, ardından 13 mm'lik bir ICCP Filtresini (0,6 μm) PBS ile 1 dakika yıkayın.</li>
		<li>Hem ana gövde parçaları A (sağ oda) hem de B (sol oda) dahil olmak üzere NICO-1'i, O halkası ve dengeli filtre ile birlikte monte edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. HUEhT-1 Hücrelerinin ve CSC'lerin NICO-1 sistemine tohumlanması
<ol><li>Hücre monokatmanlarını tripsinize ederek ve endotel hücre büyüme ortamındaki hücreleri% 2 fetal buzağı serumu ile yeniden askıya alarak HUEhT-1 hücre süspansiyonlarını hazırlayın.</li>
	<li>Her hücre dışı matris bazlı hidrojel kaplı kuyuya 1,2 mL hücre süspansiyonu (1,5 x 105 hücre) ekleyin.</li>
	<li>Diğer kuyuya beş gün boyunca kültürlenmiş 1,5 mL OCSC ekleyin.</li>
	<li>NICO-1'i 37 °C'de% 5 CO2'de inkübe edin; Mikroskop altında tüp oluşumu ve dal sayısı ile ölçülen hücre dışı matris bazlı hidrojel üzerinde ağ oluşumu gözlenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%2C+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+fate+in+cancer+growth%2C+progression+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+selfrenewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>Ohata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+stem-like+cell+regulator+CD44+by+Rho+kinase+inhibition+contributes+to+the+maintenance+of+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+in+vitro+model+of+ovarian+cancer+stem-like+cells+with+an+enhanced+proliferative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity.</a> Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).</li>
<li>Lizárraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413(2020).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li>
<li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration%2C+proliferation%2C+and+collagen+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+%26+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li>
<li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li>
<li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+targets+the+tumour+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A%3A+a+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Sunulan protokol, OCSC'lerin tümör mikroçevresinin in vitro bir ortamda nasıl taklit edileceğini açıklamaktadır. Yöntemin birincil bileşeni, dolaylı bir Transwell ortak kültür sistemi olan NICO-1 sistemi kullanılarak elde edilen yüksek oranda tekrarlanabilir kokültür modelini oluşturur. Şu anda mevcut olan kokültür modellerinin çoğu, doğrudan hücre-hücre temasının kokültürlenmiş hücre popülasyonları üzerindeki etkilerini incelemektedir 12,13,14,15,16,17,18.<...

Yumurtalık kanseri, dünya çapında kadınlarda sekizinci en yaygın malignitedir ve yaklaşık 300.000 yeni tanı ve yılda tahmini 180.000 ölüm1. İlk tanıda, yumurtalık kanseri sıklıkla şiddetli semptomlarla ortaya çıkar ve hastaların yaklaşık% 75'i zaten evre III-IV'tedir. Buna göre, 5 yıllık sağkalım oranı% <30'dur ve mortalite oranı jinekolojik kanserler arasında en yüksektir2, yumurtalık kanseri tedavisinin etkinliği, debulking cerrahisinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi, kemoterapiye direnç ve ilk tedaviden sonra nüks gibi klinik faktörlere büyük ölçüde bağlıdır.
Yumurtalık kanseri dokuları hiyerarşik olarak organize edilmiştir, tüm tümör bileşenleri eşit derecede torunlar üretemez. Kendi kendini yenileyebilen ve heterojen bir tümör hücresi popülasyonu üretebilen tek hücrenin kanser kök hücrelerini (CSC'ler) temsil ettiği düşünülmektedir3. CSC kendini yenileme ve tümör başlangıcına, destekleyici bir niş sağlamak amacıyla tümör mikro çevresini yeniden şekillendirmek için anjiyogenezin teşvik edilmesi eşlik eder. Bununla birlikte, önceki modeller, çoklu pasajdan sonra sferoidlerin bozulması nedeniyle klinik örneklerden türetilen CSC'lerin yetiştirilmesinin sınırlı tekrarlanabilirliği nedeniyle in vitro analizler için kullanılamamıştır. Daha yakın zamanlarda, hastalardan CSC'leri yetiştirmek için deneysel yöntemlerçeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir 4,5,6,7. Özellikle, CSC'lerin serumsuz ortama sahip ultra düşük bağlantı plakalarında sferoidler oluşturarak büyüme özelliğinden yararlanarak, ekili CSC'ler, çok soylu farklılaşma potansiyeline sahip normal tümör hücrelerinde eksprese edilmeyen bir kök hücre yüzey belirtecini ifade etmek için uyarılır 8,9.
Son veriler, peritonda yayılım olarak görselleştirilen uykudaki over (O)CSC'lerin kalıcılığının, tekrarlayan tümörler olarak rejenerasyonları ile ilişkili olduğunu göstermiştir10. OCSC'lerin moleküler ve biyolojik özelliklerinin anlaşılması, bu hücrelerin etkili bir şekilde hedeflenmesine ve eradikasyonuna izin verebilir ve bu da potansiyel tümör remisyonuna neden olabilir. Özellikle, CSC'lerin anjiyogenez11'deki rollerinin hücresel ve moleküler mekanik özellikleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, bu protokolde, klinik ortamda metastatik bölgedeki CSC'lerin ve endotel hücrelerinin tümör mikroortamını taklit edebilen ko-kültür modelini kullanarak endotel hücrelerinin anjiyojenik özelliğini araştırmak için in vitro ortamda hasta kaynaklı OCSC'ler kullandık. Nihayetinde, neovaskülarizasyon, tümör büyümesini ve metastazını desteklemek için gerekli kritik bir süreç oluşturduğundan, mekanizmasının daha iyi anlaşılması, metastatik bölgedeki OKSK'ler için yeni bir hedefleme tedavisinin geliştirilmesine izin verecektir.
Burada, CSC'leri çevreleyen neovaskülarizasyon adımını zaman çizelgesinde görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Protokolün avantajı, 3D ko-kültür sistemi NICO-1 kullanılarak tamamen tekrarlanabilir araştırmalara izin vermeyi içerir, böylece endotel hücre anjiyogenezi sırasında OKSC kaynaklı tümör başlatma yeteneğinin hastalar üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesine izin verir.

<table><tbody><tr><td>% 0.025 Tripsin&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>1250 & mikro; L Pipet ucu</td><td>QSP</td><td>T112XLRS-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>Nunc</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L Pipet ucu</td><td>QSP</td><td>T110RS-YENİ</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Termo (Gibco)</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Termo</td><td>170366N</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>AccuMAX</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojileri</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>BioCoatTM Kollajen I 60mm Çanak</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Kuyu Temizle Düz Tabanlı Ultra Düşük Eklenti Çoklu Kuyu Plakaları</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-22011 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>WAKO</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Temel</td><td>Termo (Gibco)</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>SIGMA</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>HUEhT-1 hücre</td><td>JCRB Hücre Bankası</td><td>JCRB1458</td><td></td></tr><tr><td>ICCP Filtresi 0.6 ve mikro; m</td><td>Ginrei Laboratuvarı</td><td>2525-06</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin, insan</td><td>SIGMA (Roche)</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO MX-flad</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Yokogawa</td><td>CQ-1 NICO-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ginrei Lab.</td><td>2501-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPlate-96</td><td>PerkinElmer</td><td>6005290</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>WAKO</td><td>253-00513</td><td></td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu eş-kültür sistemi kullanılarak yumurtalık kanseri kök benzeri hücrelerin anjiyogenetik Özelliklerinin değerlendirilmesi, nico-1

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Kanser kök hücreleri (CSC'ler), bitişik stromal hücrelerden, damarlardan ve hücre dışı matristen oluşan bir mikro ortam oluşturan destekleyici bir niş içinde bulunur. CSC'lerin endotel gelişimine katılma yeteneği, tümörigenez ve tümör metastazı mekanizmalarının genel olarak anlaşılmasına doğrudan katkıda bulunan önemli bir özellik oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yumurtalık kanseri kök hücrelerinin (OKSK) tümör başlatma yeteneğini araştırmak için tekrarlanabilir bir metodoloji oluşturmaktır. Bu çalışmada, endotel hücreleri ve OKSK'ler arasındaki neovaskülarizasyon mekanizması ve endotel hücrelerinin morfolojik değişiklikleri in vitro ko-kültür modeli NICO-1 kullanılarak incelenmiştir. Bu protokol, OKSK'leri çevreleyen neovaskülarizasyon adımının zaman içinde görüntülenmesini sağlar. Bu teknik, tümör metastazında OKSK'lerin anjiyogenetik özellikleri hakkında fikir verebilir.

Cerrahi veya parasentez sırasında ilerlemiş yumurtalık kanseri olan hastalardan elde edilen asit sıvılarını, sferoidler için uzun süreli stabil bir kültür gerçekleştirmek amacıyla topladık. Burada, CSC1 ve CSC2 olarak adlandırılan yumurtalık CSC'lerinin uzun süreli sferoid kültürü vakalarını sunuyoruz. Her iki hücre hattı da aynı tanı ve histolojik profilleri taşır. OKSK'leri çevreleyen endotel hücrelerinin neovaskülarizasyonunu indüklemek için gerekli olan endotel hücreleri ile etkileşim...

Yumurtalık kanseri kök hücreleri (OKSK) kanserin başlamasından, nüksetmesinden, terapötik direncinden ve metastazından sorumludur. OCSC vasküler nişinin, OKSC'lerin kendi kendini yenilemesini teşvik ettiği ve kemorezistansa yol açtığı düşünülmektedir. Bu protokol, in vitro olarak tekrarlanabilir bir OCSC vasküler niş model oluşturmak için temel sağlar.

Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Over kanseri, jinekolojik maligniteler arasında yüksek mortalite oranına sahiptir. Yumurtalık kanseri kök hücreleri ve vasküler nişleri, tümör mikroçevresini yeniden şekillendirebilir. Bununla birlikte, önceki yumurtalık kanseri kök hücre modelleri, sınırlı tekrarlanabilirlikleri nedeniyle ayrıntılı analize izin vermemiştir.Protokolümüzün avantajı, anjiyogenez sırasında hastada yumurtalık kanseri kök hücrelerinden türetilen tümör başlatma yeteneklerinin etkilerinin incelenmesini kolaylaştıran 3D ko-kültür sisteminin tekrarlanabilirliğini içerir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Yuko Miyagawa olacak. Parasentez yoluyla elde edilen insan yumurtalık kanseri asitlerinden kanser kök hücrelerini izole etmek için, 100 ila 250 mililitre hasta asidi toplayın ve numuneyi alındıktan sonraki 24 saat içinde santrifüjleyin.Peletleri iki mililitre OCSC ortamında yeniden süspanse edin ve her numuneye PBS'de sekiz mililitre %30 iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 15 mililitrelik tüplere aktarın ve her tüpteki hücre çözeltisine iki mililitre ek OCSC ortamını dikkatlice katman. Hücreleri yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile ayırın ve interfazdaki OCSC'yi dikkatlice yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.Toplanan hücreleri tam hacimde PBS ile yıkayın ve peletleri taze OCSC ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri ultra düşük bağlantılı kültür kaplarına tohumlayın ve kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Beş günlük kültürden sonra, hücreleri santrifüjleme ile plaka başına 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.PBS'de ikinci bir santrifüjlemeden sonra, hücreleri bir mililitre proteolitik ve kollajenolitik enzim hücre ayırma çözeltisinde 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin. İnkübasyonun sonunda, pipetleyerek iyice karıştırın ve hücreleri beş dakika daha 37'ye geri döndürün. İnkübasyonun sonunda, hücreleri pipetleme ile tekrar karıştırın ve santrifüjleme ile yıkamak için tüpü PBS ile doldurun.Ardından, peleti OCSC ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni ultra düşük bağlantılı kültür kaplarına tohumlayın. Bir HUEhT-1 endotel hücre kültürü oluşturmak için, HUEhT-1 hücrelerini PBS ile yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca% 0.025 tripsin ile muamele edin. Hücreler ayrıldığında, beş mililitre endotel hücre büyüme ortamı iki ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüjleme için 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.Daha sonra, peleti HUEhT-1 ortamında 1.5 x 10 ila beşinci konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve hücreleri kollajen kaplı kültür kapları üzerine tohumlayın. Bir tüp oluşturma testi için etkileşimli bir ko-kültür plakası oluşturmak için, NICO-1 cihazını üreticinin talimatlarına göre monte edin ve sistemi buz üzerine yerleştirin. 37 santigrat derecede 60 dakikalık bir inkübasyon için cihaza 300 mikrolitre soğutulmuş hücre dışı matris bazlı hidrojel eklemeden önce düzeneği 300 mikrolitre soğuk PBS ile yıkayın.İnkübasyonun sonunda, steril bir 13 milimetre filtreyi% 100 etanole batırın ve ardından PBS'ye bir dakika daldırın. İnkübasyonun sonunda, bir O-ring ve dengelenmiş filtreyi tertibatın gövdesindeki uygun odalara yerleştirin. Cihaz monte edildiğinde, HUEhT-1 hücrelerini,% 2 fetal buzağı serum konsantrasyonu ile desteklenmiş endotel hücre büyüme ortamının mililitresi başına 1.25 x 10 ila beşinci hücrede yeniden süspanse edin ve her bir hücre dışı matris bazlı hidrojel kaplı kuyuya 1.2 mililitre hücre ekleyin.Daha sonra, bir oyuğa 1.5 mililitre beş günlük kültürlenmiş OCSC ekleyin ve NICO-1 sistemini hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Tüp oluşumu ışık mikroskobu ile gözlemlenebilir ve hücre dışı matris bazlı hidrojel üzerindeki hücre ağlarının oluşumu, zaman içinde ko-kültür içinde oluşan dalların sayısının ölçülmesiyle ölçülebilir. Burada, iki farklı CSC tarafından indüklenen tüp oluşum aktivitesinin bir karşılaştırması gözlemlenebilir.Bu analizde, oluşan vasküler tüplerin sayısı, ikinci CSC popülasyonu ile ko-kültür sırasında zaman içinde önemli ölçüde artmıştır. Bu görüntülerde, CSC2 ko-kültürü olmadan vasküler endotelyal büyüme faktörü tedavisi sonrası HUEhT-1'in anjiyojenik özelliği pozitif bir kontrol olarak gözlenebilir. NICO-1 sistemini kullanan bu OSCS endotel hücre ko-kültür modelinde, HUEhT-1 hücreleri 20 saat boyunca CSC2 ile birlikte kültürlendi.Hızlandırılmış video görüntüleme ile gözlemlendiği gibi, HUEhT-1 hücreleri, 20 saatlik CSC ko-kültürü boyunca vasküler tüpler oluşturdu. Son keşifler, homolog rekombinasyon onarımında kusurlu olan over kanseri için PARP inhibitörlerinin yanı sıra anti-anjiyojenik bevacizumabın klinik kullanımına yol açmıştır. 3 boyutlu ko-kültür sistemini kullanan protokolümüz, tümör metastazında yumurtalık kanseri kök hücrelerinin anjiyojenik özelliği hakkında bilgi sağlayabilir.

evaluating-angiogenetic-properties-ovarian-cancer-stem-like-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Üç boyutlu bağlamında normal hücreleri Kültür, hücresel dönüşüm ve tümörogenez için gerekli erken olayları incelemek için alternatif bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, normal yumurtalık ve yumurtalık kanseri oluşumu erken olayları incelemek için oviductal hücreleri büyümek için kullanılır.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

İn vitro küre testleri, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Burada tek ve çok hücreli küre tahlillerini karşılaştırıyoruz. Daha zahmetli tek hücre bazlı tahliller veya metilselüloz takviyesi daha doğru sonuçlar verirken, sıvı ortamda gerçekleştirilen çok hücreli bazlı tahliller hücre yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilir.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Tümör başlatıcı hücreler (TIC'ler), oldukça tekrarlayan ve ölümcül bir hastalık olan yumurtalık kanserinin tedavisi için uygun bir terapötik hedef olabilir. Bu yüksek derecede tümörjenik hücre popülasyonu için zenginleştiren kültür koşulları için bir protokol sunuyoruz.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Burada, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için bir araç olarak, birincil insan mezotelyal hücreleri ve hücre dışı matris ile katmanlanmış fibroblastlardan oluşan periton boşluğunun astarının üç boyutlu bir in vitro modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

fizyolojik olarak ilgili model yumurtalık tümör progresyonunu incelemek için, çok hücreli küreler simüle sıvı akışı altında microdevice kültürlenmiştir. Bu dinamik 3D modeli yumurtalık kanseri metastazı meydana hücresel ve mekanik bileşenleri ile intraperitoneal ortamı benzetilmiştir.

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Burada, prelabelled Mezenkimal hücrelerin sıçan aort kaynaklı endotel ağları ile birlikte kültürlü nerede aort yüzük testin yeni bir uygulama mevcut. Bu roman yöntemi görselleştirme Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) posta ve endotel ağları ile entegrasyon, miktar ağ özellikleri ve MSC immunophenotypes ve gen ifade değerlendirme sağlar.

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Üç boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Co-kültür sheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, ECFCs ve MSCs oluşur ve kollajen jel gömülü. Yeni sistem anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkilidir ve in vivo çalışmaya daha uygun bilgiler sağlar.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Kemik iliği vasküler nişinin in vitro bir modeli, mezenkimal ve endotel hücrelerinin önceden dökülmüş 3D PEG hidrojelleri üzerine tohumlanmasıyla oluşturulur. Nişlerin endotel ağları, ECM bileşenleri ve ALP aktivitesi kullanılan büyüme faktörüne bağlı olarak değişir. Platform, gelişmiş kanser modelleri için kullanılabilir.

Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Fare yumurtalık somatik hücrelerinin stroma ile zenginleştirilmiş bir yumurtalık fraksiyonundan izole edilmesi ve iskelesiz bir yaklaşımla fare yumurtalık somatik organoidleri üretme yöntemlerini açıklıyoruz.

Yumurtalık Mikro Ortamını İnceltmek: Fare Yumurtalık Somatik Hücrelerinin İzolasyon, 2D Kültür ve Organoid Kültürü Yöntemleri

Keşfedin, 3D eş-kültür sistemi kullanarak yumurtalık kanseri kök benzeri hücrelerin anjiyogenetik özelliklerini. Bu yöntem, tümör mikroçevresinin yeniden şekillenmesini ve metastazdaki rolünü analiz eder.

Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1 (Video) | JoVE Journal

Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1

Daha fazla video keşfet