Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Bu protokol, çeşitli bilimsel uygulamalarda kullanılmak üzere yatay hipokampal beyin dilimlerinin hazırlanmasını kolaylaştırır. Bu teknik, tek bir hemisfer dilimi içindeki tüm hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korur. Bu dilim protokolü, dentat girusta gelişen ve ortaya çıkan beyin patolojilerinde meydana gelen nörolojik değişiklikleri değerlendirmek için idealdir.

Bu protokolün en önemli yönü, mümkün olduğunca hızlı bir uygulama ve beyin dokusunun nazik bir şekilde ele alınması arasındaki dengeyi bulmaktır. Bir litre ACSF hazırlamak için, uygun hacimlerde magnezyum sülfat ve kalsiyum klorür yavaşça damlatmadan önce, manyetik bir karıştırma çubuğu ile sürekli karıştırarak 800 mililitre suda belirtildiği gibi tüm katı kimyasalları yavaşça karıştırın. Ardından, 305 ila 315 miliosmol arasındaki ozmolariteyi doğrulamak için bir buhar basıncı ozmolametresi kullanın ve pH'ı 7.3 ila 7.4 arasında ayarlamak için ACSF çözeltisini oda sıcaklığında karbojen ile sürekli olarak köpürtün.

250 mililitre yüksek sükroz dilim çözeltisi hazırlamak için, bileşikleri tabloda belirtildiği gibi 25 mililitre önceden dilimlenmiş çözeltiye ekleyin ve ozmolaritenin 320 ila 325 miliosmol arasında olduğunu doğrulayın. Daha sonra, pH'ı 7.3 ile 7.4 arasında ayarlamak için yüksek sükroz dilim çözeltisini 10 ila 15 dakika karbojen ile köpürtün ve yüksek sükroz dilim çözeltisini kısmen donana kadar eksi 80 santigrat derecede 20 ila 30 dakika saklayın. Diseksiyon için bir çalışma alanı hazırlamak için, bir geri kazanım odasını karbojene ACSF çözeltisi ile doldurun ve odayı 32 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin.

Vibratomu uygun kesme programına ayarlayın ve tutucuyu buzla doldurun, vibratomun üzerine monte edin ve vibratom koluna bir bıçak takın. Kısmen donmuş yüksek sükroz dilim çözeltisini heterojen bir sulu kar elde edilene kadar ezmek ve karıştırmak için bir spatula kullanın. Daha sonra çözeltiyi karbojen ile köpürtün ve çözeltiyi soğutulmuş 90 milimetrelik bir kültür kabının üzerine bir parça filtre kağıdını nemlendirmek için kullanın ve 35 milimetrelik bir kültür kabını buz üzerinde doldurun.

Beyni hasat etmek için, iki ila altı haftalık bir erkek farenin kafa derisini kesmek ve sagital sütür boyunca kalvaria'yı açmak için diseksiyon makası kullanın. Koku ampulleri de dahil olmak üzere tüm beyin görünene kadar kafatasını çıkarmak için kavisli forseps kullanın ve sağlam beyin dokusunu dikkatlice çıkarmak için bir spatula kullanın. Beyni 35 milimetrelik kültür kabına yerleştirin ve dokudaki saç veya kan parçacıklarını nazikçe çıkarmak için yüksek sükroz dilimi solüsyonu ile doldurulmuş bir Pasteur pipeti kullanın.

Temizlenmiş beyni ıslatılmış filtre kağıdına aktarmak için spatulayı kullanın ve beyni uzunlamasına ikiye kesmek için bir bıçak kullanın. Her iki yarım küreyi de yeni kesilmiş medial tarafa yerleştirin ve her bir beyin parçasının sırt bölgesini çıkarmak için her yarım kürenin dorsal tepesinde paralel bir kesim yapmak için bıçağı kullanın. Her iki yarım küreyi de beynin ventral kısmı yukarı bakacak şekilde yeni kesilmiş sırt tarafına yerleştirin ve bir numune plakasına bir damla süper yapıştırıcı yerleştirin.

Her iki doku parçasını da yerleştirmek için yapıştırıcıyı geniş bir alana yaymak için bir pipet ucu kullanın ve bir parça filtre kağıdı kayışını bir yarım kürenin ventral tarafına dokundurun. Beynin sırt tarafını dikkatlice yarı kurutmak için başka bir filtre kağıdı kayışı kullanın ve yarım küre sırt tarafını numune plakası üzerindeki yapıştırıcının üzerine yerleştirin. İkinci yarım küreyi az önce gösterildiği gibi yapıştırıcı üzerine yerleştirmek için iki ek filtre kağıdı kayışı kullanın ve numune plakasını dilimleme odasına yerleştirin.

Daha sonra hızlı ama dikkatli bir şekilde plakayı buz gibi soğuk yüksek sükroz dilim çözeltisi sulu karla örtün. Beyin dokusunun bölümlerini elde etmek için, vibratom bıçağını hemisferlerin medial tarafının önüne yerleştirin ve vibratom masasını, bıçak şimdi yukarı bakan hemisferlerin ventral tarafları ile aynı yükseklikte olacak şekilde kaldırın. Bıçağı sırt yönünde 600 mikron daha alçaltmak için vibratom kontrolünü kullanın ve ilk iki dilim iki yarım küreden tamamen ayrılana kadar dokuyu dilimleyin.

İlk iki doku dilimi elde edildiğinde, kesme yönünü tersine çevirin ve tekrar dilimlemeden önce bıçağı 300 mikron daha indirin. Hipokampus görünür hale geldiğinde, dilimleri toplamak ve su banyosundaki geri kazanım odasına aktarmak için genişletilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanın. Dilimleri ACSF dolu geri kazanım odasında bir saat bekletin, ardından doku örneklerinin elektrofizyolojik kayıtlarını yapmadan önce geri kazanım odasını 30 dakika oda sıcaklığında tutun.

Burada, sırasıyla düşük ve yüksek kaliteli dilimlerden temsili negatif ve pozitif alan uyarıcı post-sinaptik potansiyel kayıtları gözlemlenebilir. Negatif örnek izi, uyarılmış nöronal liflerin depolarizasyonu üzerine gerçek fEPSP genliğinden bile daha yüksek olan büyük bir lif voleybolu genliği sergilerken, yüksek kaliteli iz, küçük bir lif voleybolu / fEPSP oranı ve yüksek bir fEPSP genliği gösterir. Bir beyin diliminin yaşayabilirliği, fiber voleybol genliklerine karşı alan uyarıcı post-sinaptik potansiyel eğimleri çizilerek de analiz edilebilir.

Tipik olarak dilim kalitesini belirlemek için kullanılan giriş/çıkış eğrileri, beyin dilimine artan akım uyaranları uygulanarak ve sonraki fEPSP yanıtlarının izlenmesiyle elde edilebilir. Yetersiz korunmuş beyin dokusunun yetersiz iletim özellikleri nedeniyle, düşük kaliteli beyin dilimleri azaltılmış giriş/çıkış eğrileri gösterir. Uygulanabilir beyin dilimleri kararlı sinaptik iletim taban çizgilerine sahipken, kararsız bir taban çizgisine sahip beyin dilimleri, beyin devrelerinin sinaptik plastisitesini incelemek için daha fazla koşullandırma protokolü için kullanılamaz.

fEPSP temel kayıtları, sinaptik iletimin kendisi üzerindeki ilaç etkilerini izlemek için de yararlı olabilir. Ek olarak, beyin dilimleri, floresan görüntüleme kayıtları elde etmek ve farklı dilim koşulları veya tedavileri altında kalsiyum akışlarını incelemek için bir kalsiyum indikatörü ile birlikte kullanılabilir. Beyin diseksiyonunun fedakârlıktan en fazla 1,5 dakika sonra yapıldığından emin olun ve bu, beyin dokusunun sadece kısa bir süre soğutma ve oksijen kaynağı olmadan kalacağının garantisidir.

Hipokampal beyin dilimlerinin moleküler biyolojik tekniklerden elektrofizyolojiye kadar birçok farklı uygulaması vardır. Bu prosedür, hipokampal anatomi ve nörolojik süreçlerin yoğun araştırmalarını kolaylaştırır.