Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

Bu protokol, sadece protein koronasının değil, aynı zamanda nanomalzemelerin metabolit koronasının karakterizasyonu için CESI-MS'yi uygulayan ilk protokoldür. CESI, yalnızca birkaç nanolitre numune kullanırken hem yüksek oranda tekrarlanabilir hem de hassas olan geleneksel LCMS yöntemlerine ortogonal bir ayrım sunar. Başlamak için, insan plazmasının iki mililitresini, biri metabolit ve protein korona için ve diğeri plazma metabolom karakterizasyonu için bir mililitre alikotlara bölün.

İnsan plazmasında mililitre başına bir miligram nanomalzemeyi 37 santigrat derecede bir saat inkübe ederken, bir termo karıştırıcıda dakikada 500 dönüşte hafifçe karıştırın. Daha sonra, nanomalzemeleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 kez G'de santrifüjleyerek peletleyin. Metabolit korona analizi için plazma süpernatantını toplayın ve protein korona karakterizasyonu için nanomalzeme protein korona kompleksini saklayın.

Peletleri bir mililitre 10X PBS tamponunda yeniden süspanse edin ve bağlanmamış proteinleri çıkarmak için iki dakika kuvvetlice girdaplayın. Nanomalzemeleri peletlemek için çözeltiyi dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 kez G'de santrifüjleyin, ardından peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peletleri bir mililitre ABC tamponunda yeniden süspanse edin ve bağlanmamış proteinleri ve bağlanmamış tuzları çıkarmak için iki dakika kuvvetlice girdaplayın.

Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve süpernatanı atın. Protein disülfür bağlarını azaltmak için peleti 10 milimolar ditiyotreitol içeren 20 mikrolitre ABC tamponunda çözün. Çözeltiyi 56 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

% 0.1 yüzey aktif madde içeren 20 mikrolitre ABC tamponuna iki mikrogram sıralama dereceli tripsin ekleyin ve sindirim çözeltisini 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 100 milimolar ABC'ye 20 mikrolitre 55 milimolar iyodoasetamid ekleyerek numuneyi alkilleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Yüzey aktif maddeyi parçalamak için 20 mikrolitre 0.1 molar hidroklorik asit ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.

Metin el yazmasında açıklandığı gibi bir C18 paketli tuz giderme pipet ucu kullanarak peptitleri zenginleştirin ve tuzdan arındırın. Daha sonra numuneyi liyofilize edin ve analize kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Nanomalzeme plazma inkübasyonundan kontrol plazmasını ve süpernatanı alın ve buzun üzerine koyun.

Her numuneden 50 mikrolitreyi ayrı şişelere ayırın ve damıtılmış su ile on kat seyreltin. Girdaplamadan sonra, bu seyreltilmiş numunenin 50 mikrolitresini yeni şişelere taşıyın. 200 mikrolitre kloroform, 250 mikrolitre metanol ve 350 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve iki dakika kuvvetlice girdap yapın.

10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20, 800 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanın 500 mikrolitresini alın ve dört santigrat derecede 10.000 kez G'de iki saat boyunca üç kilodaltonluk bir santrifüj filtreden süzün. 430 mikrolitre ultra filtratı hızlı bir vakumda kurutun ve numuneyi dondurun.

Kılcal damarları CESI cihazına takmadan önce, kılcal damarların giriş ve çıkış uçlarının sağlam olduğunu ve kılcal damarda gözle görülür bir kırılma olmadığını kontrol edin. Ardından, üretici yönergelerini izleyerek cihaza nötr kodlu yeni bir kılcal damar yerleştirin. Ayırma kılcalını ileri yönde 100 milimolar hidroklorik asitle, ardından BGE ile ve son olarak metin el yazmasında açıklanan koşulları kullanarak damıtılmış suyla yıkayın.

Daha sonra hem ayırma hem de iletken kılcal damarı BGE ile, ardından damıtılmış su, 100 milimolar hidroklorik asit, tekrar damıtılmış su ve son olarak BGE ile yıkayın. Nano sprey kaynağını ve adaptörü kullanarak CESI'yi MS'e bağlayın. Protein korona analizi için, liyofilize numuneleri pH dörtte 20 mikrolitre 50 milimolar amonyum asetat içinde yeniden süspanse edin.

Metin el yazmasında açıklandığı gibi numuneler için CESI-MS analizi yapın. 250 ile 2.000 m/z arasında kütle spektrumu verilerini toplayın, en iyi 10 veriye bağlı parçalanma edinimi ile ve numuneler arasındaki kılcal damarı durulayın. CESI cihazına yeni bir çıplak erimiş silika kılcal damar yerleştirin.

Ayırma kılcalını %100 metanol kullanarak ileri yönde yıkayın, ardından çıkış uçlarında damlacık oluşumunu sağlamak için hem ayırma hem de iletken kılcal damarı BGE ile yıkayın. Daha sonra kılcal damarı damıtılmış suyla, ardından 0.1 molar sodyum hidroksit, tekrar damıtılmış su ve son olarak BGE ile yıkayın. Nano sprey kaynağı ve adaptörü kullanarak CESI'yi SEMS'e bağlayın.

Metabolit korona analizi yapmak için, nanomalzemeye maruz kalan ve maruz kalmayan plazma örneklerini 430 mikrolitre damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve iki dakika boyunca kuvvetlice girdap yapın. Numuneleri 0,1 mikrometrelik bir membran filtreden süzün. Metin el yazmasında belirtildiği gibi, 95 mikrolitre filtrata iç standartların beş mikrolitresini ekleyin ve kuvvetlice girdap yapın.

16, 100 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi numuneler için CESI-MS analizi yapın. Proteomik ve metabolomik ayırma ve algılama için CESI-MS'nin kullanılması, her yaklaşım için her iki kılcal damarda iyi ayırma pencereleri gösterir ve biyomoleküler koronanın kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar.

Proteomik CESI-MS yöntemi, çok çeşitli nanomalzeme bileşimleri boyunca koronadaki bir dizi protein ve protein konsantrasyonları arasında ayrım yapabilir ve her nanomalzeme için benzersiz bir protein koronasını ayırt edebilir. Bu CESI-MS metabolomik yaklaşımı, metabolit koronasının kantitatif bir analizini mümkün kılar ve benzersiz parmak izlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, nanomalzeme metabolit koronasını pasif olarak karakterize etse de, izomerlerin diferansiyel absorpsiyonu gibi biyomoleküler koronadaki metabolitlerin rolüne ilişkin ilginç içgörüleri ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir.

Bu teknik, hem proteini hem de metabolit koronasını karakterize etmeyi mümkün kılar ve tam biyomoleküler koronanın hücreler tarafından nanomalzeme alımını nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.