İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu teknik, araştırmacıların hem in vitro hem de in vivo fonksiyonel karakterizasyon testlerinin performansı için meme kanseri kök hücrelerini maksimum saflık ve canlılıkta izole etmelerine olanak tanıyacaktır. İzole edilmiş meme kanseri kök hücreleri, tümörjeniteye ve metastazı kontrol eden moleküler olayların aydınlatılmasına yardımcı olmak ve bu hücreleri hedeflemek için terapötik stratejiler tasarlamak için de kullanılabilir. İlgilenilen hücre ve doku tiplerine özgü küçük modifikasyonlar ile bu yöntem diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bir hücre kültüründen tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için,% 80 birleşik meme kanseri hücre kültürünü PBS ile yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca uygun bir hücre ayrışma çözeltisi ile muamele edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, hücre ayrışma çözeltisini nötralize etmek için beş mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Saymak için peleti beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin, ardından hücreleri mililitre ALDH substrat tamponu başına 10 ila altı hücre bir kez yeniden süspanse edin. Bir doku örneğinden tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için, tümör dokusunu yaklaşık bir milimetre büyüklüğünde parçalara ayırmak için çapraz teknikte cerrahi bıçaklar kullanın. Parçaları 10 mililitre ayrışma tamponu içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede 40 dakikalık bir inkübasyon için tüpü parafilm ile kapatın ve sindirilmiş doku parçalarını santrifüjleme ile çökeltin. Peleti beş mililitrelik bir pipet kullanarak beş mililitre tripsin içinde yeniden süspanse edin ve dokuyu 37 derecelik bir su banyosunda beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, tek hücreleri serbest bırakmak için dokuyu birkaç kez kuvvetlice pipetleyin ve tüpteki toplam hacmi 25 mililitreye getirmek için yeterli DMEM / F-12 ortamı ekleyin.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın, peleti bir mililitre Displace DNAse içinde yeniden süspanse edin ve 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. Kuluçka sonunda, PBS ile toplam hacmi 10 mililitreye getirin. Hücreleri pipetleyerek karıştırın ve 40 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe geçirin.

Santrifüjlemeden sonra, hücreleri saymak için beş mililitre taze PBS'de yeniden süspanse edin. Bir koloni oluşturma testi yapmak için, sıralamadan sonra, hücreleri tam ortamda yeniden süspanse edin ve tüp başına iki mililitre ortam içeren üç tüpün her birine uygun sayıda meme kanseri kök hücresi ekleyin, bir kez 10 ila ikinci, iki kez 10 saniyeye veya ikinci hücrelere beş kez 10 olarak etiketlenir. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak için beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri altı oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin.

Düzgün hücre dağılımları elde etmek için plakayı hafifçe döndürün ve plakayı koloniler görünene kadar hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri oyuk başına bir mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri 30 saniye boyunca oyuk başına 500 mikrolitre% 0.05 kristal viyole çözeltisi ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, fazla boyayı çıkarmak için kuyucukları kuyu başına iki mililitre su ile iki kez yıkayın ve dört veya 10 kat büyütmede ışık mikroskobu ile oyuk başına toplam koloni sayısını sayın ve kaydedin.

Bir mamosfer tahlili yapmak için, sıralamadan sonra, hücreleri tam mamosfer ortamında yeniden süspanse edin ve 96 kuyulu ultra düşük bağlantılı hücre kültürü plakasında oyuk başına santimetre kare alan başına ikinci hücrelerin 10'unun beş katı bir oturma yoğunluğunda plakalayın. Işık mikroskobu ile oyuk başına mamosfer sayısını saymadan önce, plakayı beş ila 10 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir 3D kültür modeli oluşturmak için, kabarcıksız 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dikkatlice 50 mikrolitre bazal membran özü ekleyin ve çözeltinin polimerize olmasını sağlamak için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Jel tabakasının kurumasını önlemek için 10 dakika sonra 100 mikrolitre PBS ekleyin. İnkübasyonun sonunda, sıralanmış hücreleri 200 mikrolitre 3D kültür ortamı konsantrasyonu başına beş ila 50 kez 10 ila üçüncü hücreye askıya alın ve 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki PBS'yi 200 mikrolitre ortam içeren hücrelerle değiştirin. Daha sonra, kültürleri organoid oluşumu açısından değerlendirmeden önce plakayı 10 ila 14 gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Gelişmiş ALDH enzimatik aktivitesi sergileyen insan meme kanseri hücreleri, yüksek CD44 seviyelerini ve düşük ila negatif CD24 ekspresyon seviyelerini eksprese eder ve meme kanseri kök hücreleri olarak sınıflandırılabilir. Toplu popülasyon içindeki meme kanseri kök hücrelerinin oranı, hücre dizileri veya hastalar arasında değişebilir ve genellikle hastalık evresine bağlıdır, daha agresif meme kanseri tipik olarak meme kanseri kök hücrelerinin daha yüksek bir oranını gösterir. Tek bir meme kanseri hücresinin kendi kendini yenileme ve 50 hücreden oluşan koloniler oluşturma yeteneği, koloni oluşturma testleri ile değerlendirilebilir.

Meme kanseri kök hücrelerinin ankrajdan bağımsız deneysel koşullar altında kendi kendini yenileme yeteneği, mamosfer testleri ile değerlendirilebilir. Meme kanseri hücrelerinin ve bazal membran ekstraktının kültürlenmesi, meme kanseri kök hücrelerinin in vivo koşullarda özetlenen 3D yapılar oluşturmasına izin verir. Ek olarak, in vivo fare ksenogreft modelleri, meme kanseri kök hücrelerinin meme kanseri olmayan kök hücrelere veya toplu hücre popülasyonlarına kıyasla büyüme, kendini yenileme, farklılaşma ve/veya tümör başlatma yeteneğindeki farklılıkları anlamak için kullanılabilir.

Bu prosedürü takiben, izole edilen meme kanseri kök hücreleri transkriptomik, kinomik ve metabolomik çalışmalarda kullanılabilir. Bu yöntem, araştırmacılara meme kanseri kök hücrelerinin tümör başlangıcı, metastazı, nüksü ve tedavi direncindeki rolünü keşfetme fırsatı sunar.