Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Burada açıklanan protokollerin, nöro dejenerasyonun patogenezinde oligodendroglial defektler üzerine gelecekteki çalışmaları kolaylaştırması beklenmektedir. Bu, sadece üç ila dört hafta içinde fonksiyonel insan oligodendrosit soy hücreleri oluşturmak ve nöron oligodendrosit bağlantılarını modellemek için bir ko-kültür sistemi oluşturmak için kullanılabilecek gelişmiş bir yöntemdir. Protokol sadece Alzheimer hastalığını değil, nöron oligodendrosit etkileşimlerinin diğer hastalıklarla ilişkili yönlerini incelemek için de kullanılabilir.

Başlamak için, %40 birleşme elde etmek için her bir T75 şişesinde yaklaşık bir milyon HEK293T hücre plakalayın, ardından bunları üç yardımcı plazmit ile birlikte tetrasiklin ile indüklenebilir NGN2 ve puromisine dirençli tetrasiklin transaktivatör genini eksprese eden plazmitlerle transfekte edin. Transfeksiyon için PEI kullanın. Medyayı 16 saat sonra değiştirin.

Her gün kültür ortamını toplayarak ve üç gün boyunca taze ortamla değiştirerek salınan viral parçacıkları hasat edin. Toplanan ortamı saflaştırma için bir araya getirin, daha sonra virüsü 0.22 mikrometrelik bir filtreden süzün ve 90 dakika boyunca 49.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, peleti uygun hacimde PBS glikozunda yeniden süspanse edin.

Nöron indüksiyonunu gerçekleştirmek için ticari olarak temin edilebilen H1 insan ES hücrelerini kullanın. Hücreleri, ESL bakım ortamı ile hücre dışı matris çözeltisi kaplı 6 oyuklu plakalar üzerinde kültürleyin ve plakaları% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Farklılaşma indüksiyonundan iki gün önce, bir mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek ES hücrelerini ayırın.

Hücreleri bir tüpe aktarın, ardından kuyuyu iki mililitre ortamla yıkayın ve aynı tüpe ekleyin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra peleti ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri, oyuk başına bir kez 10 ila beşinci hücre oturma yoğunluğunda matris kaplı 6 oyuklu plakalara yerleştirin.

Ertesi gün, NGN2 artı puro eksprese eden lentivirüsler ekleyin. R ve tetrasiklin transaktivatörü, taze ES hücre bakım ortamında polibren ile birlikte. Sıfırıncı günde, N2 ile takviye edilmiş ve morfojen içermeyen DMEM / F-12 ortamında mililitre doksisiklin başına iki mikrogram ekleyin.

Birinci günde, taze DMEM / F-12'de puromisin, ayrıca N2 ve doksisiklini mililitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyona ekleyin. En az 24 saat boyunca puromisin içindeki transdüksiyon hücrelerini seçin. İkinci günde, farklılaşan nöronları hücre ayırma solüsyonu ile ayırın ve bunları matris solüsyonu ile kaplanmış 24 oyuklu plakalara yeniden plakalayın.

Bunları doksisiklin içermeyen MBA B27 ortamında tutun. Hücre dışı matris bazlı çözeltilerle kaplanmış plakalar üzerinde saf indüklenmiş nöronları kültürleyin. Nöral progenitör hücre üretimini gerçekleştirmek için, H1 insan ES hücrelerini kültürleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi bunları nöral progenitör hücrelere transdiferansiyel hale getirin.

Negatif birinci günde, büyüme faktörü indirgenmiş matris çözeltisi ile kaplanmış 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ES hücre bakım ortamındaki 0.5 ila bir milyon hücreyi tohumlayın. Sıfırıncı günde, hücreleri 24 saat boyunca% 2 DMSO ile desteklenmiş ES hücre bakım ortamı ile tedavi edin. Bir ila altıncı günlerde, tam medyayı ticari bir kitten bazı ilave inhibitörler içeren sıcak nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin.

Yedinci günde, hücre ayırma solüsyonu kullanarak NPC'leri geçin ve bunları 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına bir ila iki kez 10 ila beşinci hücre oturma yoğunluğunda plakalayın. Pluripotentlik belirtecinin yokluğu ve NPC belirteçlerinin varlığı için immünohistokimyasal boyama ile farklılaşma etkinliğini test edin. Oligodendrosit öncü hücrelerini oluşturmak için, NPC'leri ticari bir kitten bazı ilave inhibitörlerle ılık nöral indüksiyon ortamında kaplayın.

Sekizinci günde, OPC farklılaşma ortamında% 1'lik bir DMSO çözeltisi hazırlayın ve kaplanmış NPC'leri 24 saat boyunca tedavi edin. Dokuzuncu günde, ortamı DMSO içermeyen taze OPC farklılaşma ortamı ile değiştirin, ardından hücreleri 15. güne kadar her gün besleyin. Hücreler 15. günden önce birleşirse, onları kuyucuk başına bir ila iki kez 10 ila beşinci hücreler arasındaki oturma yoğunluğuna geçirin.

14. günde, OPC farklılaşma ortamındaki plaka OPC'leri, 24 oyuklu bir plakada, oyuk başına bir ila iki kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda yapılır. Hücreleri, IHC boyama veya qPCR ile OPC'ye özgü belirteçlerin varlığı ve NPC belirteçlerinin yokluğu açısından test edin. 15. günde, ortamı OL olgunlaşma ortamı ile değiştirin.

Ortamı her gün veya her gün değiştirin. Hücreler %90 birleşmeye ulaştığında, bunları iki geçişe kadar veya hücre bölünmesi önemli ölçüde yavaşlayana kadar bir ila üç oranında bölün. OPC'ler çok hızlı bölünür ve üç günden daha kısa bir sürede birleşirse, Ara-C'yi bir ila üç gün boyunca iki ila beş mikromolar konsantrasyonda ekleyin.

14. günde, IOPC'leri OPC farklılaşma ortamında 24 oyuklu bir plakada oyuk başına bir çarpı 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda plakalayın. Ertesi gün, indüklenen insan nöronlarını hücre ayırma çözeltisi ile ayırın. Kültürlenmiş OPC'lerin üzerine nöronlar ekleyin, oyuk başına iki kez 10 ila beşinci hücre oturma yoğunluğunda kaplayın.

Nörobazal A ortamı,% 2 B27 takviyesi ve mililitre T3 triiyodotironin başına 100 nanogram içeren ko-kültür ortamı kullanın. Ortamı ertesi gün ve ardından her gün değiştirin. OPC'ler çok hızlı çoğalır ve üç günden daha kısa sürede birleşirse, iki ila beş mikromolar Ara-C ekleyin.

Başlangıç insan pluripotent kök hücrelerinin, indüklenmiş nöronların veya OPC'lerin ve oligodendrositlerin başarılı bir şekilde üretilmesi için yüksek derecede pluripotentlik sergilemesi önemlidir. Bu nedenle, indüksiyon protokollerinden herhangi birine başlamadan önce hücreler OCT-4 ve SOX2 gibi spesifik belirteçler için boyanmalıdır. İnsan H1 hücreleri, indüklenmiş uyarıcı ön beyin nöronları elde etmek için kullanıldı.

Kültürdeki saf nöronlar, 14 ila 16. günlerde birinde sinaps ifade etmeye başladı. GİB'ler iki hafta içinde ve olgun oligodendrositler dört ila beş hafta içinde üretildi. DMSO tedavisi, daha iyi sinyalizasyon Entegrasyonu için erken G1 fazındaki hücre sayısını zenginleştirdi.

Spesifik OPC belirteçleri, ES H1 hücrelerinin kaplanmasından iki hafta sonra tespit edildi. İki haftalık IOPC popülasyonu oldukça homojendi, hücrelerin %95'inden fazlası 04 boyama için pozitifti ve diğer belirteçler için yüksek düzeyde immünoreaktivite vardı. Oligodendrosit olgunlaşmasının başlamasından sonra, 28. günden itibaren spesifik oligodendrosit belirteçleri tespit edildi.

İndüklenmiş nöronlar ve IOPC'ler için ideal kaplama yoğunluklarının, uygun farklılaşmayı elde etmek için bir dizi hücre sayısı titrasyonu ile belirlenmesi gerekir. Dört hafta sonra, ko-kültürlerde, IOPC'ler, MBP gibi spesifik belirteçler için pozitif olan oligodendrositlere yeterince farklılaştırılmalıdır. Bu ko-kültür sistemi, sinaps sayısını sağlam bir şekilde artırabilir, bu da IOPC'lerin fiziksel temas veya trofik faktörlerin salınması yoluyla nöronal bir destek sağladığını gösterir.

Açıklanan bu prosedür, farklı beyin hücresi tipleri eklenerek daha da karmaşık hale getirilebilir. Örneğin, kök hücreler, sağlık ve hastalıktaki nöron glial etkileşimlerinin yeni yönlerini modellemek için insan astrositlerini türetti.