Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model
22 Ocak 2021
Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.
Bu yeni küresel kültürler yöntemi, farklı kanser kök hücrelerinin popülasyonlarının varlığını analiz etmek için tümörojenliği incelemek için kullanılabilir ve ayrıca yeni ilaçlar için yüksek put ekranı aracılığıyla güzel bir şekilde uygulanabilir. Bu, çok sayıda homojen boyutlu küreseloid üretmek için sağlam ve tekrarlayan bir kültürlü sistemdir. Ayrıca, bu sferoidler kanserli kök hücreleri incelemek için kullanılabilir.
Bu yöntem kronik kanser biyolojisini incelemek için ayarlanmıştır, ancak 3D kültür koşullarını değiştirerek diğer kanserleri incelemek için kolayca ayarlanabilir. Ortamdaki kabarcıklara dikkat ettiğinizden, küresel oluşum sırasında plakayı çok fazla hareket ettirmediğinizden ve küreselleri süzgeçe toplarken dikkatli olduğunuzdan emin olun. Kuyu başına 500 mikro litre Yapışma Önleyici Durulama Çözeltisi ile 24 kuyu plakasının kuyularını önceden tedavi ederek başlayın.
Birkaç saniye sonra plakayı sallanan kova rotorunda santrifüj edin ve her birini 2 mililitre sıcak Bazal ortamla durulayın. Kabarcıkların mikro kuyulardan tamamen çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Kabarcıklar gözlenmezse, her kuyuya bir mililitre sıcak DMEM bodrum membran matrisi ortamı eklemeden önce kuyuları tekrar durulayın.
Küresel oluşumu teşvik etmek için, DMEM'de %10 FBS ve %1 antibiyotik ile desteklenmiş 10 santimetrelik bir tabakta 2D mono tabaka içinde istenen Caco-2 hücrelerinin konsantrasyonunu görün. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültür için. % 80 izdiah ulaştığında, kültürü iki mililitre Tripsin-EDTA ile tedavi etmeden önce hücreleri beş mililitre PBS ile 37 santigrat derecede iki ila beş dakika yıkayın ve% 5 karbondioksit.
Hücreler ayrıldığında, Trypsin'i dört mililitre tam DMEM ile nötralize eder. Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve paleti DMEM bodrum membran matrisi ortamının uygun hacminde yeniden biriktirerek kuyu başına bir mililitre orta hücre konsantrasyonunu elde edin. Ön ödemeli 24 kuyu plakasının her kuyusuna bir mililitre hücre ekleyin, ardından her kuyuya bir mililitre DMEM bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.
Tohumlamadan sonra, plakayı hemen santrifüjlayın ve hücrelerin mikro kuyulara eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için hafif bir mikroskop kullanın. Daha sonra plakayı hücreleri rahatsız etmeden 48 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Küreselleri hasat etmek için, inkübasyonun sonunda, sferoidleri mikro kuyularından hafifçe çıkarmak için her kuyuda serolojik bir pipet ve süpernatantın yarısını kullanın.
Tüm küreseller ayrıldığında, pipeti kullanarak 3D kültürleri her kuyudan 15 mililitrelik konik tüpün üstündeki 37 mikron ters çevrilebilir süzgeçe dikkatlice aktarın. Kalan küreselleri toplamak için yıkama başına bir mililitre önceden uyarılmış Bazal ortam ile her kuyuyu üç kez yıkayın ve bu ek sferoidleri süzgeçe ekleyin. Son yıkamadan sonra, tüm küresellerin mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı kontrol edin.
Daha sonra süzgeci yeni bir 15 mililitrelik tüp üzerinde ters çevirin ve sferoidleri tüpe toplamak için süzgecin altını taze DMEM bodrum membran matrisi ortamı ile yıkayın. 500 hücreden yükselen küreseller zaman içinde en homojen boyut artışını göstermektedir. Küresel başına 500 ve 600 hücre ile iyi büyüme ve düşük değişkenlik elde edilebilirlik elde edilebilir hücre en uygun sayıda olduğunu belirleyin.
Bodrum membran matrisinin eklenmesi küresel büyümeyi ve homojenliği arttırır. Uzun vadeli kültürde, hücreler üçüncü günde yoğun çok katmanlı olarak görünür. Tek katmanlı olarak düzenlenmiş düzleştirilmiş hücreler 10.
İlginçtir ki, beşinci günden itibaren küresellerde bir lümen beliriyor. Buna ek olarak, çoğalan hücre nükleer antijen pozitif hücrelerinde 10. Şaşırtıcı bir şekilde, aktif Caspace 3 sadece üç ve beş günlerinde çok az hücrede gözlenir.
Her zaman noktasında yüksek düzeyde Beta-catenin ekspresyolü gözlenirken. Küresellerin Anterositlere farklılaşma potansiyeli, Alkali Fosfataz ve çözünen taşıyıcı ailesi 2A5 mRNA ekspresyosu ile kanıtlanır. Ek olarak, bu küreseller tipik kanser kök hücre belirteçlerini ifade eder ve kolorektal kanser hastalarına rutin olarak uygulanan kombinasyon kemoterapi tedavilerine yanıt verir.
Yani küreseller farklı hücre popülasyonlarından oluşur. Daha sonra refrakterler gibi uyaranlara verilen hücre spesifik yanıtlarını analiz etmek ve sonunda ilaç yanıtları için güzel bir şekilde kullanılabilirler.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu sferoidler üretmek için sağlam bir kültür sistemi sunmaktadır. Bu yöntem, kanser kök hücre biyolojisinin ve kemoterapiye verdikleri yanıtın incelenmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Kanser kök hücrelerini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
- 3D sferoid kültürleri, in vivo tümör ortamlarını taklit eder.
- Bu yöntem, çeşitli kanser türlerine uyarlanabilir.
- Deneysel geçerlilik için sağlamlık ve tekrarlanabilirlik esastır.
Çalışmanın Amacı
- Caco2 hücrelerinden sferoid kültürü için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Tümörjeniteyi ve kanser kök hücre popülasyonlarını araştırmak.
- Yeni ilaçlar için yüksek kapasiteli taramayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kuyucukların Anti-Adherence Rinsing Solution ile ön işlemi.
- Sferoid oluşumu sırasında hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkatli taşıma.
- Sferoidlerin bir süzgeç kullanılarak toplanması.
- Optimal büyüme için kültür koşullarının izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Homojen boyutlarda sferoidlerin başarıyla üretilmesi.
- Kanser kök hücrelerinin incelenmesinde uygulanabilirliğinin kanıtlanması.
- İlaç tarama uygulamaları için potansiyel.
- Kültür koşulları modifiye edilerek diğer kanser türlerine uyarlanabilirlik.
Sonuçlar
- Bu yöntem, kanser araştırmaları için yeni bir araç sunmaktadır.
- Kanser kök hücre dinamiklerinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, terapötik geliştirme süreçleri için bu sistemden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu 3D sferoid modeli, kolorektal kanser araştırmalarında terapötik hedeflerin ve ilaç yanıtlarının daha öngörülebilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak, tümör heterojenitesini ve kanser kök hücre (CSC) fenotiplerini yeniden oluşturan preklinik sistemlere duyulan kritik ihtiyacı karşılamaktadır. Uzun süreli CSC zenginleştirme ve kemoterapi yanıt değerlendirmesi için tekrarlanabilir bir platform sunan bu yöntem, artırılmış translasyonel güven ile erken aşama hedef doğrulaması ve öncü bileşik belirleme çalışmalarını desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Sferoidler içindeki diferansiyel proliferasyon paternleri ve lümen benzeri yapılar aracılığıyla CSC heterojenliğinin ve tümörjenik potansiyelin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yerleşik markerları eksprese eden CSC'leri zenginleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler ve terapötik hipotezlerin mekanistik risklerinin azaltılmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Belirlenmiş hücre girdilerinden homojen boyutlu sferoidler üreterek, kantitatif ilaç yanıt analizi için standartlaştırılmış bir sistem oluşturur.
- Operasyonel Değer: Dayanıklılığı, tekrarlanabilirliği ve süzgeç tabanlı yöntemlerle sferoid toplamanın kolaylığı sayesinde yüksek kapasiteli tarama iş akışlarıyla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: CSC marker ekspresyonunu ve klinik olarak ilgili kombinasyon kemoterapisine verilen yanıtı göstererek, tedavi direnci ve duyarlılığının preklinik modellemesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: CSC fenotiplerini uzun süreli kültür boyunca koruyarak, ilaç etkinliği ve tümör nüksetme mekanizmalarının boylamsal çalışmalarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem; hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle de CSC odaklı tedaviler ve direnç mekanizmaları üzerine yoğunlaşan onkoloji programlarına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: CSC nişlerini ve farklı ilaç yanıtlarını 3D bir bağlamda modelleyerek yolak açıklığa kavuşturulmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Boyut açısından homojen sferoid oluşumu aracılığıyla assay standardizasyonuna olanak tanıyarak, CSC açısından zenginleştirilmiş popülasyonlara karşı güvenilir bileşik taramasını destekler.
- Analitik: Tedavi koşullarını karşılaştırmak için CSC marker ekspresyonu, proliferasyon markerları (PCNA) ve apoptoz markerları (aktive Caspase-3) üzerinden kantitatif okumalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Kolorektal adenokarsinom heterojenliğini yansıtan hastalıkla ilgili bir sistemde kemoterapi yanıtını modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: 3D kültür koşulları modifiye edilerek diğer kanser türlerine uyarlanabilir; bu da onu onkoloji keşif programları genelinde yeniden kullanılabilir bir platform olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: 2D modellerde bulunmayan CSC kaynaklı tümör heterojenitesini ve fonksiyonel kök hücrelik özelliklerini yakalayarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış ekim, yapışma önleyici ön işlem ve süzgeç tabanlı toplama yoluyla tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik sağlayarak, sferoid üretimindeki değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: CSC hedefli bileşiklerin ve direnç mekanizmalarının erken değerlendirmesine olanak tanıyarak, geç aşama biyolojik riskini azaltır ve "devam/tamam" karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fizyolojik olarak ilgili bir modelden elde edilen CSC modülasyonu ve kemoterapi yanıt verilerine dayanarak, öncü bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Sferoid başlatma sırasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için anti-adherans yüzey işlemi ve dikkatli tutum dahil olmak üzere, 3B hücre kültürü tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Bazal membran matrisine (örneğin Matrigel) ve santrifüjler, süzgeçler (37 mikron) ile izleme için ters mikroskoplar dahil olmak üzere standart hücre kültürü ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Deneyler arasında homojenliği ve tekrarlanabilirliği sağlamak için ekim yoğunluğunun (sferoid başına 500–600 hücre) ve inkübasyon süresinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer kanser türlerine adaptasyon, hücre hattına özgü adezyon ve sferoid oluşum kinetiklerine bağlı olarak bazal membran konsantrasyonunun ve kültür süresinin optimizasyonunu gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, sferoid bozulmasını önlemek için hasat sırasında nazik tutum gerekliliği ve farklı gruplar arasında lümen oluşum zamanlamasındaki olası değişkenlikler yer alır.
