Name: Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Keşfedin, Caenorhabditis elegans kullanarak EGFR ve RAS inhibitörlerini nasıl tanımlayacağınızı öğrenin. Bu maliyet etkin yöntem, kanser tedavileri için erken aşama ilaç keşfinde kolay görselleştirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Swathi Arur'a (MD Anderson Kanser Merkezi) let-60(n1046)sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. David Reiner'a (Houston'daki Texas A&M Sağlık Bilimleri Merkezi Biyobilimler ve Teknoloji Enstitüsü) lin-1 suşu için teşekkür ederiz. Son olarak, Dr. Danielle Garsin'e ve laboratuvarına (Teksas Üniversitesi, McGovern Tıp Fakültesi) bazı reaktifleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu Araştırma, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT) tarafından JF Hancock'a RP200047 hibesi ile desteklendi.

1. Nematod büyüme ortamı (NGM) plaka hazırlama
<ol><li>2 L Erlenmeyer şişesinde bulunan 970 mL deiyonize suya 2,5 g pepton ve 3 g NaCl ekleyin. İçeriği manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın. Daha sonra, şişeye 20 g agar ekleyin. Şişenin içeriğini 121 °C'de ve 15 lb/in2 basınçta 30 dakika boyunca otoklavlayın. Sterilizasyondan sonra, şişeyi bir karıştırma plakasına yerleştirin ve sıcaklığın 50 ° C'ye ulaşana kadar ortamın soğumasını bekleyin.</li>
	<li>NGM plakalarını hazırlamak için soğutulmuş ortama aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 25 mL 1 M potasyum fosfat tamponu (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL (%95 etanolde 5 mg/mL) kolesterol, 1 mL (etanolde% 10 v / w) nystatin ve 1 mL 25 mg / mL streptomisin.</li>
	<li>Laminer bir akış altında, soğutulmuş ortamı 60 mm x 15 mm steril Petri kaplarına dökün. Plakaların 2 saat katılaşmasını bırakın. Bu plakalar 4 °C'de 1 ay saklanabilir.</li>
</ol>2. C. eleganların yayılması
<ol><li>Her NGM plakasının ortasına 100 μL gece yetiştirilen E. coli OP50'yi tespit edin ve plakaların laminar bir başlıkta 24 saat kurumasını bekleyin. Daha sonra, plakalar polistiren kapta saklanabilir. NOT: E. coli OP50 kültürü, plakaların tohumlanması öncesinde Luria-Bertani (LB) medyasında 37 °C media'da yetiştirilir. Kültür 1-2 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir ve plakaların periyodik tohumlama için kullanılabilir.</li>
	<li>Steril bir solucan toplama kullanarak, daha önce yetiştirilen bir tabaktan 10-12 gravid yetişkin solucanı bir diseksiyon mikroskobu altında toplayın. Bu solucanları E. coli OP50 ile tohumlanmış taze bir NGM plakasına aktarın ve plakayı 20 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>24 saat sonra, steril bir solucan toplama kullanarak yetişkin solucanları plakalardan çıkarın. Plakaları ~ 3 gün boyunca 20 ° C'de kuluçkaya yatırın. Embriyolar gravid yetişkin solucanlara dönüşecek.</li>
</ol>3. Senkron C. elegans kültürünün hazırlanması
<ol><li>Gravid yetişkin solucanlarını M9W ile 2-4 tabak yıkayarak 15 mL konik bir tüpe toplayın.<ol>
<li>M9W'ın hazırlanması: 5 g NaCl, 6 g Na 2 HPO 4ve 3 g KH2PO4'ü iyonize suda 1 L'lik son hacme kadar çözün. Soğutulmuş çözeltiye 1 mL 1 M MgSO4 ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj ederek solucanları peletin. Solucan peletini bozmadan süpernatantı dekant.</li>
	<li>%8,25 sodyum hipoklorit (ev tipi çamaşır suyu) ve 5 N NaOH'un 100 μL'sini birleştirerek solucan lizis çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi solucan peleti ekleyin ve tüpün içeriğini karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Solucanların lizizini bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek tüpteki embriyoların aşırı etkilenmesini önleyin.</li>
	<li>Yetişkin solucanların% 70'i lize olduğunda lizis karışımını seyreltmek için konik tüpe 10 mL M9W ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj edin. Süpernatant'ı 10 mL M9W ile değiştirin.</li>
	<li>3,5 adımlarını iki kez yineleyin.</li>
	<li>Yıkama adımlarını tamamladıktan sonra, yumurta peletini yeniden çıkarmak için 3-5 mL M9W ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında (RT) bir tüp rotator üzerinde 18 rpm hızında gece boyunca döndürün.</li>
	<li>Gece kuluçkadan sonra, tüpü rotatordan çıkarın, tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj ederek L1 larvalarını peletin. M9W'ı tüpte 250 μL kalana kadar aspire edin.</li>
	<li>Larvaları yeniden çıkarmak için tüpü sallayın. Bir Petri kabı kapağına larvaları içeren üç 5 μL damla ekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her damladaki solucan sayısını sayın ve 1 μL'deki solucan sayısını belirleyin.</li>
</ol>4. İlaç testlerinin hazırlanması
NOT: Bu testteki adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>150 rpm'de bir yörünge çalkalayıcıda bir gecede 37 °C'de 50 mL konik tüpte 30 mL E. coli OP50 yetiştirin.</li>
	<li>Hücreleri peletmek için 10 dakika boyunca 4.000 x g'da bir gecede yetiştirilen E. coli OP50 kültürünü döndürün. Süpernatant çıkarın ve kültürü konsantre etmek için peletin 3 mL M9W'ta yeniden süzülür.</li>
	<li>İlaç tahlil için çalışma çözümlerini hazırlamadan önce, 100 mL ML M9W'a 0,1 mL (%95 etanolde 5 mg/mL) kolesterol ekleyin.</li>
	<li>Her ilaç artı aracı seyrelterek her deneysel ilacın çalışma çözümlerini hazırlayın (dimetil süloksit; DMSO) 4.8 mL M9W uygun konsantrasyonları elde etmek için kolesterol ile desteklenmiştir. Araç kontrolünü hazırlamak için DMSO'yu kolesterolle desteklenmiş 4,8 mL M9W'da çözün.</li>
	<li>Karıştırıldıklarından emin olmak için araç kontrolünü veya uyuşturucu ve girdap tüplerini içeren her tüpe 200 μL konsantre E. coli OP50 kültürü ekleyin.</li>
	<li>Deneyi gerçekleştirmek için, her kuyuya 12 kuyu doku kültürü plakasında her bir ilaç çözeltisinin veya araç kontrolünün 2 mL'sini ekleyin. Her uyuşturucu konsantrasyonu ve araç kontrolünü kopya olarak test edin.</li>
	<li>Steril bir mikropipette kullanarak kuyu başına ~100 L1 larva ekleyin (bkz. senkron C. elegans kültür adımları). Solucanların hacmini 10 μL ile sınırlandırın.</li>
	<li>Plakaları 20 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Gerekirse tahlilin 3. gününde 50 μL 10x konsantre E. coli OP50 ile takviye kuyuları.</li>
</ol>5. Mikroskopi için agarose ped hazırlığı
<ol><li>5 mL deiyonize suda 0,1 g agarose eriterek% 2 w / v agarose çözeltisi hazırlayın. Agarose'un çözünmesi için içindekileri mikrodalga fırında ısıtın. 5 mL agarose çözeltisinden 20 slayt hazırlanabilir.</li>
	<li>laboratuvar bandı şeritlerini iki cam slayt boyunca yerleştirin. Bant, agarose pedlerinin kalınlığını sınırlayan aralayıcılar olarak hareket edecektir. Daha sonra, bantlanmış slaytların arasına üçüncü bir temiz cam slayt yerleştirin.</li>
	<li>Bir agarose ped yapmak için, temiz slaytın ortasına 100 μL erimiş agarose bulun. Agarose boyunca ve üstüne başka bir temiz cam slayt yerleştirin ve bir ped oluşturmak için hafifçe bastırın. Ped katılaştırıldığında üst slaydı çıkarın.</li>
</ol>6. Muv fenotipinin let-60, let-23 ve lin-1 suşlarında gözlemlenmesi
NOT: Sadece let-23 ve let-60 suşlarındaki Muv fenotiplerini baskılayan aday ilaçlar, inhibisyonun RAS veya EGFR düzeyinde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için lin-1 suşu kullanılarak test edilecektir.
<ol><li>Yaşam döngüsünün uygun aşamasına ulaşıldığında (let-60 ve let-23 suşları için 3 gün, lin-1 suşu için 5 gün), plakaları inkübatörden çıkarın. ve solucanları bir pipet kullanarak 15 mL konik tüplerde toplayın.</li>
	<li>Tüpleri 450 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>6.2 adımlarını iki kez yineleyin.</li>
	<li>Solucan peletini bozmadan, kalan tüm M9W'yi aspirasyonla çıkarın. Daha sonra, 500 μL 2 mM sodyum azit veya 2 mM tetramisol hidroklorür ekleyin. Tüplerin RT'de 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin, 2 mM sodyum azit veya 2 mM tetramisol hidroklorür görüntüleme için solucanları uyuşturacaktır. DİkKAT: Sodyum azid kullanırken kişisel koruyucu ekipman (KKD) giydiğinden emin olun. Çözelti kimyasal bir başlık altında hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Bir agarose pedinin ortasına 10 μL anestezi solucan süspansiyonu ekleyin. Solucan süspansiyonu üzerine hafifçe #1,5 kapak zarı yerleştirin. Gerekirse, kurumasını önlemek için kapak kapağını biraz oje ile sabitleyin.</li>
	<li>Let-60(n1046), let-23(sa62) ve lin-1(sy254) suşlarını gözlemlemek için bir DIC mikroskobu kullanın. Solucanları 10x ve 20x büyütmelerde görüntüleyin.</li>
	<li>Let-60(n1046) ve let-23(sa62) için, Muv fenotipinin varlığına veya yokluğuna göre yetişkin solucanları puanlama. Lin-1 suşu için, yüksek çözünürlüklü bir DIC mikroskobu kullanarak L4 larvalarının ventral tarafında 1° veya 2 ° hücre kaderlerini benimseyen VPC sayısını sayın.</li>
	<li>Her suş ve ilaç tedavisi için mikro grafikleri puanlama yaptıktan sonra, tedaviler arasındaki istatistiksel farklılıkları belirlemek için Öğrenci t-testini gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Marshall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Ras+and+Raf%3A+key+regulatory+proteins+in+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).</li>
<li>Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+the+Ras-ERK%2FMAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Grandis, J. R., Tweardy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+messenger+RNA+are+early+markers+of+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).</li>
<li>Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+molecular+pathobiology+in+oral+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review.</a> International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).</li>
<li>Stransky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutational+landscape+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).</li>
<li>Bos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ras+oncogenes+in+human+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ras oncogenes in human cancer: a review.</a> Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).</li>
<li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+survey+of+Ras+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.</a> Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).</li>
<li>Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins%3A+different+signals+from+different+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ras proteins: different signals from different locations.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).</li>
<li>Hancock, J. F., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+plasma+membrane+signalling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ras plasma membrane signalling platforms.</a> Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).</li>
<li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fendiline+inhibits+K-Ras+plasma+membrane+localization+and+blocks+K-Ras+signal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).</li>
<li>Moghal, N., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+system+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).</li>
<li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTK%2FRas%2FMAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">RTK/Ras/MAPK signaling.</a> WormBook. , 1-19 (2006).</li>
<li>Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+22+genes+that+affect+the+vulval+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).</li>
<li>Katz, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+extracellular+domain+activates+LET-23%2C+the+Caenorhabditis+elegans+epidermal+growth+factor+receptor+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).</li>
<li>Hara, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+farnesyltransferase+inhibitors+suppress+the+phenotype+resulting+from+an+activated+ras+mutation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).</li>
<li>Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+to+evaluate+inhibitors+of+Ras+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo.</a> Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).</li>
<li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+Metabolism+Is+a+Regulator+of+K-Ras+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function.</a> Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).</li>
<li>Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+lin-1+encodes+an+ETS-domain+protein+and+defines+a+branch+of+the+vulval+induction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway.</a> Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+diet+mediates+pathogen+and+stress+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 15 (3), 1008011(2019).</li>
<li>Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+microbiome+drug+metabolism+by+gut+bacteria+and+their+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes.</a> Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).</li>
<li>Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+EGF+receptor-mediated+vulva+development+by+the+heterotrimeric+G-protein+G-alpha+q+and+excitable+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans.</a> Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Solucanı kullanarak tarif ettiğimiz tahliller, EGFR ve RAS fonksiyonunun inhibitörlerini tanımlamak için basit ve ucuzdur. C. elegans ilaç keşfi için çekici bir modeldir, çünkü kısa yaşam döngüsü (20 ° C'de 3 gün) ve çok sayıda larva üretme yeteneği nedeniyle laboratuvarda büyümek kolaydır. Daha da önemlisi, EGFR-RAS-ERK MAPK yolu, EGFR ve RAS inhibitörlerinin etkilerini analiz etmek için genetik olarak çekişli bir sistem sağlayan memeliler ile evrimsel ve işlevsel olarak korunur. Ayrıca, solucanların şeffaf doğ...

Organizmalar içindeki gelişimsel olayları düzenleyen hücresel yollar tüm metazoanlar arasında oldukça korunmuştır. Bu yollardan biri EGFR-RAS-ERK mitojen aktive protein kinaz (MAPK) hücre çoğalması, farklılaşma, göç ve sağkalım1,2yöneten kritik bir yol olan çağlayan sinyaldir. Bu sinyal yollarındaki kusurlar patolojik veya kanser gibi hastalık durumlarına yol açabilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), oral skuamöz hücreli karsinomların % 50'si de dahil olmak üzere insan tümörlerinde yüksek oranda eksprese edildiğini ve malign tümörlerin gelişimine katkıda bulunduğunu göstermiştir3,4,5. Üç RAS izoformu H-, K ve N-RAS'daki mutasyonlar birden fazla insan kanserinde kötü huylu dönüşümün başlıca iticileridir. Bu üç RAS izoformu arasında, K-RAS'daki onkojenik mutasyonlar en yaygın6,7,8 'dir. EGFR ve RAS'ın çalışması için plazma membranını (PM) lokalize etmeleri gerekir. Bu moleküllerin PM'ye lokalizasyonunu önlemek, bu sinyal yolu9,10'unbiyolojik aktivitesini tamamen yok edebilir. Bu nedenle, bu proteinlerin PM'ye lokalizasyonunun inhibisyonu, aşağı akış sinyalini ve ortaya çıkan olumsuz sonuçları engellemek için terapötik bir stratejidir. Yüksek içerikli bir tarama tahlilleri kullanılarak, L tipi kalsiyum kanal bloker olan fendiline, K-RAS aktivitesinin inhibitörü olarak tanımlanmıştır11. K-RAS'ın PM'nin iç broşürüne nanokütlesi, fendilin varlığında önemli ölçüde azalır. Ayrıca, K-RAS plazma zarından endoplazmik retikülüse (ER), Golgi aparatına, endozomlara ve sitozollere yeniden dağıtılır. Daha da önemlisi, onkojenik mutant K-RAS'ı ifade eden pankreas, kolon, akciğer ve endometriyal kanser hücre hatlarının çoğalması, fendiline11ile aşağı akış sinyalinin inhibisyonu ile engellenir. Bu veriler, fendiline'in RAS proteininin PM'ye yanlış lokalizasyonuna neden olan belirli bir K-RAS antikanser terapötik olarak işlev gösterdiğini göstermektedir.
Nematod Caenorhabditis elegans gelişim bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Solucandaki gelişimi yöneten sinyal yollarının çoğu evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş. Örneğin, RAS'ın EGFR aracılı aktivasyonu ve erk MAPK sinyal basamaklamanın daha sonra etkinleştirilmesi solucan12'de korunur. Basamak aşağıdaki proteinlerle temsil edilir: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 RAS için homolog, LET-23 ise EGFR için homologdur. Solucanda, bu yol vulva gelişimini düzenler13. Vulva, solucanın ventral vücut duvarında döllenmiş yumurtaların döşenmesini sağlayan epitel bir diyaframdır. Solucandaki vulva oluşumu, vulval öncül hücrelerin (VPC) EGFR-RAS-MAPK sinyal basamaklanmasının aktivasyonuna maruz kalmasına bağlıdır. Normal gelişim sırasında, proksimal VPC'ler, fonksiyonel birvulva12'ye yol açan 1° ve 2 ° hücre kaderlerine farklılaşmak için gonadal çapa hücrelerinden güçlü sinyaller alır. Distal VPC'ler hipodermal senkryuma kaynaşan ve tükenmiş sinyaller nedeniyle vulva oluşturmayan 3° hücre kaderlerine farklılık sağlar. Sinyalizasyonun yokluğunda, tüm VPC'ler 3 ° hücre kaderlerine farklılaşarak vulva oluşumuna neden olur. Bununla birlikte, konsitülatif sinyalleme, tüm VPC'lerin 1° ve 2° hücre kaderlerini üstlenme indüksiyonu nedeniyle bir veya daha fazla işlevsel olmayan vulva oluşumuna yol açar.
Bu yolu temsil eden proteinleri kodlayan genlerin birçoğu için kusurlu veya aşırı vulval indüksiyona neden olan mutasyonlar tanımlanmıştır. Kusurlu vulval indüksiyon vulvasız (Vul) bir fenotiple sonuçlanırken, aşırı vulval indüksiyon ventral vücut duvarı boyunca çok sayıda işlevsiz ektopik psödoovulvanın gelişmesiyle temsil edilen multivulva (Muv) fenotip ile sonuçlanır. Let-60(n1046) suşu tarafından ifade edilen Muv fenotipi RAS'daki fonksiyon mutasyonunun kazanıcılığından kaynaklanırken, let-23(sa62) suşunda EGFR14,15'te aktive edici bir mutasyondan kaynaklanmaktadır. Bu mutant suşlarındaki güçlü Muv fenotipinin, let-60(n1046) solucanlarının MEK-1 inhibitörü U0126 16 ,17ile tedavisinde gösterildiği gibi farmakolojik müdahalelerle pertüre olduğu gösterilmiştir. İlginçtir ki, sphingomyelin metabolizmasını etkileyen R-fendilin ve inhibitörlerin solucandaki Muv fenotipini baskıladığını gösterdik18. Bu inhibitörlerin RAS seviyesinde let-60 sinyalini engellediğini göstermek için lin-1 boş suşukullanılmıştır 17. Lin-1, vulva19'ungelişiminde bir baskılayıcı olarak işlev gösteren Ets benzeri bir inhibitör transkripsiyon faktörüdür. Let-60(n1046) solucanlarında Muv fenotipinin güçlü bir şekilde geri çevrilmesi ve lin-1 null solucanlar üzerinde hiçbir etkisi olmaması, bu inhibisyonların RAS düzeyinde gerçekleştiğini göstermektedir.
Bu protokolde, RAS ve EGFR proteinlerinin inhibitörlerini tanımlamak için C. elegans'ın bir model olarak kullanıldığını gösteriyoruz. Sıvı bazlı bir tahlil kullanarak, C. elegans'ın let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant suşlarındaki Muv fenotiplerini bastırarak R-fendilin inhibitör etkilerini gösteriyoruz. Bu test, antikanser terapötikler için ilaç keşfinin ilk aşamasında C. elegans'ın bir araç olarak kullanılmasını doğrulamaz.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Medya ve kimyasallar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroz&nbsp;</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB Et Suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Acros organikleri</td><td></td><td></td>AC455500050</tr><tr><td>Potasyum Fosfat Dibazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum pFosfat Monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>R-Fendiline</td><td></td><td></td><td>Ticari Olarak Sentezlenmiş (Farmasötik sınıf)</td></tr> <tr><td>Sodyum Azid</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>%8.25 Sodyum Hipoklorit&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Çamaşır</td></tr><tr><td>Suyu Sodyum Fosfat Dibazik&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin Sülfat&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>(&eksi;)-Tetramizol Hidroklorür</td><td>Millipor Sigma&nbsp;</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UO126 (MEK inhibitörü)</td> <td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>19-147</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sarf malzemeleri&nbsp; < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>50mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Polistiren Serolojik Pipetler 10mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Polistiren Serolojik Pipetler 25mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>No. 1.5&nbsp; 18 mm X 18 mm Kapak Astarları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Kapaklı Petri Kabı (60 x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Kapaklı Petri Kabı (100X15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Düz Cam Mikroskop Slaytları (75 x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>12- Kuyu Doku Kültürü Plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4804</td><td></td></tr><tr><td>Software&nbsp; < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Prizma</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Bakteriyel Suşlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td> E. coli OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Solucan Suşları < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Suş< / güçlü ></td> <td>< güçlü >Genotip< / güçlü> </td><td>Transgene</td><td>Source</strong</td></tr><tr><td>>MT2124 &nbsp;</td><td>let-60(n1046) IV.</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>MT7567</td><td>lin-1(sy254) IV.</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>PS1839</td><td>let-23(sa62) II.</td><td></td><td>CGC</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans kullanılarak egfr ve ras inhibitörlerinin tanımlanması

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve aşağı akış efektörü RAS'ın plazma membran lokalizasyonundaki değişiklikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karışmıştır. Serbest yaşayan nematod C. elegans, vulvanın gelişimi için merkezi olan evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş bir EGFR-RAS-ERK MAP sinyal kaskadına sahiptir. RAS homolog LET-60 ve EGFR homolog LET-23'te fonksiyon mutasyonlarının kazanılması, bu solucanların ventral vücut duvarı boyunca görünür işlevsiz ektopik psödoovulva üretimine neden olur. Daha önce, bu solucanlardaki multivulval (Muv) fenotipinin küçük kimyasal moleküller tarafından inhibe edildiği gösterilmiştir. Burada, EGFR ve RAS proteinlerinin faaliyetlerini kaldıran inhibitörleri tanımlamak için solucanı sıvı bazlı bir testte kullanma protokolünü açıklıyoruz. Bu tahlilleri kullanarak, K-RAS'ın dolaylı bir inhibitörü olan R-fendiline'in let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant solucanlarında ifade edilen Muv fenotipini baskıladığını gösteriyoruz. Test basit, ucuz, kurulum için zaman alıcı değildir ve antikanser terapötiklerin keşfi için bir başlangıç platformu olarak kullanılabilir.

İlk olarak R-fendiline'in let-60(n1046) mutant suşundaki Muv fenotipini DMSO tarafından tedavi edilen solucanlara kıyasla bastırabildiğini gösteriyoruz. Verilerimiz, R-fendiline'in let-60(n1046) 'daki Muv fenotipini doza bağımlı bir şekilde engelleyebildiğini göstermektedir (Şekil 2A,B). Bununla birlikte, artan R-fendiline konsantrasyonlarına yanıt olarak lin-1 boş mutant suşunda Muv fenotipinin tersine çevrilmemesi gözlenmiştir (<strong class="xfi...

Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Bu protokol, EGFR ve RAS proteinlerinin aktivitelerini ortadan kaldıran inhibitörleri tanımlamak için ilaç keşfinin ilk aşamasında kullanılabilir. Bu testin en önemli avantajı, anti-EGFR ve anti-RAS terapötiklerinin inhibitör etkilerinin C.egelans'ta kolayca görüntülenebilmesidir. Her bir NGM plakasının ortasına 100 mikrolitre gece boyunca yetiştirilen E.coli OP50'yi tespit ederek başlayın.Plakaların laminer bir başlıkta 24 saat kurumasını bekleyin, ardından polistiren bir kapta saklayın. Steril bir solucan kazması kullanarak, daha önce yetiştirilmiş bir plakadan 10 ila 12 gravid yetişkin solucan toplayın ve bunları E.coli OP50 ile tohumlanmış taze bir NGM plakasına aktarın. Plakayı 20 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.24 saat sonra, yetişkin solucanları plakalardan çıkarmak için steril bir solucan penası kullanın. Embriyoların gravid yetişkin solucanlara dönüşmesine izin vermek için plakaları yaklaşık üç gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. M9W ile iki ila dört plaka yıkayarak gravid yetişkin solucanları 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın.Tüpü bir dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyerek solucanları peletleyin, ardından solucan peletini bozmadan süpernatanı

identification-of-egfr-and-ras-inhibitors-using-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Neurexins ve neuroligins sinaptik farklılaşma ve iletiminde önemli rolleri yerine membran nöron yapışma proteinleri. Neuroligin, eksik...

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını...

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Keşfedin, Caenorhabditis elegans kullanarak EGFR ve RAS inhibitörlerini nasıl tanımlayacağınızı öğrenin. Bu maliyet etkin yöntem, kanser tedavileri için erken aşama ilaç keşfinde kolay görselleştirme sağlar.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

Daha fazla video keşfet