Name: Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Öğrenin T ve B hücre reseptörü immün repertuar analizi için yeni nesil dizileme yöntemini. Kan ve intestinal biyopsi örneklerinden DNA izolasyonu ve klon takibi ile bağışıklık dinamiklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sheba Tıp Merkezi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve tüm katılımcı konulardan yazılı onay alınmıştır.
1. DNA izolasyonu ve nicelleştirme
<ol><li>Bağırsak biyopsilerinin sindirimi ve hücre lizisi<ol>
<li>Yeni toplanan veya -20 °C veya -80 °C'de depolanan bağırsak biyopsilerini alın. Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün.</li>
		<li>Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mL mikro santrifüj tüpüne 600 μL çekirdek liziz çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Biyopsiyi lizis çözeltili bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 65 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>17,5 μL 20 mg/mL proteinaz K ekleyin ve hafifçe sallanarak 55 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>1.3. basamağa geçmeden önce numunenin oda sıcaklığına 5 dakika soğumasını bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tam kanın hücre lizisi<ol>
<li>EDTA, heparin veya sitrat içeren tüpte 3 mL tam kan elde edin.</li>
		<li>Tüpü iyice karışana kadar hafifçe sallayın ve kanı 9 mL hücre liziz çözeltisi içeren steril 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka süresi boyunca birkaç kez ters çevirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjlayın ve ardından görünür beyaz peletin rahatsız edilmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Yaklaşık 50-100 μL artık sıvı kalacaktır.</li>
		<li>Vortex tüpü tamamen yeniden dirilene kadar 15 sn boyunca kuvvetlice. Birkaç kez 3 mL çekirdek liziz çözeltisi ve pipet ekleyin. Çözelti viskoz hale gelmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein yağışı<ol>
<li>Dokuya 200 μL protein çökeltme tamponu veya kana 1 mL ekleyin. Vortex 20 s için kuvvetlice ve 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslanın. Girdaplamadan sonra küçük protein kümeleri görülebilir.</li>
		<li>4 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Çökemiş proteinler içeren sıkı bir pelet oluşturmalıdır.</li>
		<li>Peletin rahatsız etmeden süpernatant'ı yeni bir 1,7 mL tüpe dikkatlice aktarın. NOT: Pelet sıkı değilse, 4 dakika boyunca 16.000 x g'da başka bir santrifüj düşünün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA çökeltma ve rehidrasyon<ol>
<li>Üst kısmı içeren tüpe 1 mL 2 propanol ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. DNA beyaz yüzen madde olarak görünür hale gelmelidir.</li>
		<li>1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Bir pipet kullanarak süpernatant tamamen çıkarın.</li>
		<li>1 mL taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Üstnatant dikkatlice atın.</li>
		<li>1.4.3.</li>
		<li>Açık tüpü 10-15 dakika boyunca temiz emici kağıda ters yerleştirin. Tüpü yeniden ters çevirin ve tam hidrasyonunu onaylayın. Gerekirse, 10-15 dakika daha havayla kurumaya bırakın. NOT: Peletin tamamen kurumasını sağlamak çok önemlidir.</li>
		<li>50 μL ultra saf su (UPW) ekleyin. Gerekirse, DNA nicelleştirmeden sonra daha fazla seyreltilebilir.</li>
		<li>DNA rehidrasyonu için 65 °C'de ısı bloğunda 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA nicelemesi NOT: DNA, malzeme tablosunda belirtildiği gibi bir florometre ve belirlenmiş reaktifler kullanılarak ölçüldü.<ol>
<li>Standartları oda sıcaklığına getirin ve 0,5 mL belirlenmiş tüpler de dahil olmak üzere kiti hazırlayın.</li>
		<li>Numune sayısına göre 15 mL'lik bir tüpte tampon ve boya karışımı hazırlayın. Numune başına 200 μL tampon ve 1 μL boya ekleyin. Standartlar için 2 örnek ekleyin. Arabelleğin yeterli olmayacağından kaçınmak için ek bir örnek hesaplamanız önerilir.<ol>
<li>2 standart için, yukarıda hazırlanan karışımın 190 μL'yi 0,5 mL tüpe yerleştirin. Standardın 10 μL'sini ekleyin.</li>
			<li>Her numune için, yukarıda hazırlanan karışımın 199 μL'lik kısmını 0,5 mL'lik tüpe yerleştirin. DNA'nın 1 μL'sini ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnekleri oku. Sonuç, numunenin DNA konsantrasyonuna işaret eder.</li>
		<li>Örnekler sınırın üzerindeyse, DNA 1:10'ı UPW ile seyreltin ve okumayı tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kütüphane hazırlığı
NOT: Mevcut protokol, NGS sıralayıcılarıyla uyumlu çok katlı, PCR tabanlı bir test kiti kullanır. Kit, V β veJ β bölgelerindeki korunmuş bölgeleri hedefleyen her biri 24 farklı endeks içerir. Bu, tek adımlı pcr reaksiyon ve farklı örneklerin birikmesini sağlar. Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.
<ol><li>DNA örnekleri hazırlayın. 150 ng DNA elde edin ve toplam 5 μL için UPW ekleyin. NOT: Kütüphane hazırlığı için en az 10 ng/μL konsantrasyonda 150 ng'den az DNA kullanmak mümkündür.</li>
	<li>Artık DNA'yı parçalamak için pipetleri ve uçları 15 dakika boyunca UV ışıklı davlumbaz içine yerleştirin. Bu arada, farklı indeks tüplerinin (kütüphane hazırlığı için) ve DNA polimerazlarının buz üzerinde çözülmesine izin verin.</li>
	<li>Biyolojik bir başlıkta, PCR tüplerine farklı indeks tüplerinden 45 μL ekleyin. Takip etmek için, PCR tüplerine 0,2 μL DNA polimerazını ve 2,1 adımda hazırlanan 5 μL DNA'yı ekleyin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre önceden ayarlanmış bir program kullanarak PCR reaksiyonlarını çalıştırın.</li>
</ol>3. Amplicon saflaştırma ve nicelleştirme
<ol><li>Fazla astarların, nükleotitlerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanın.<ol>
<li>Boncukları oda sıcaklığına en az 30 dakika ısıtın. Numune başına 400 μL için yeterli taze % 80 etanol hazırlayın.</li>
		<li>Her PCR tüpüne boncukların 50 μL (IGH) veya 35 μL 'sini (TCRβ) ekleyin ve 10 kez pipetleme yaparak karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Karışık numuneyi manyetik standa 5 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Berrak sıvının 95 μL (IGH) veya 80 μL (TCRβ) aspiratını çıkarın ve atın. Kalan sıvıyı 10 μL uç kullanarak aspire edin.</li>
		<li>Her numuneye 200 μL% 80 etanol ekleyin. 30 sn kuluçkaya yatır. 195 μL etanol epirat ve atın. Kalan sıvıyı 10 μL uç kullanarak aspire edin.</li>
		<li>3.1.5 adımlarını yineleyin. Tüplerin kapaklarını açın ve havanın 5 dakika kurumasına izin verin.</li>
		<li>5 dakikadan hemen sonra manyetik standdan çıkarın ve 25 μL elution tamponu ekleyin (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Homojen olana kadar pipetleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Tüpleri manyetik standa 5 dakika yerleştirin. 22 μL'yi yeni bir PCR tüpüne aktarın. DNA konsantrasyonu ölçün (adım 1.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplicon nicelleştirme NOT: Mevcut protokol, DNA konsantrasyonunun, boyutunun ve bütünlüğünün kalite kontrolü için otomatik bir elektroforezi makinesi kullanır. Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.<ol>
<li>Reaktifleri ve ekran kaydını oda sıcaklığına en az 30 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Yeni bir 1,7 mL mikro santrifüj tüpünde, toplam en az 3 μL hacim için UPW ile 3,1,8 adımda ölçülen DNA örneklerinin 1 ng/μL seyreltilmesini yapın.</li>
		<li>Vortex kullanmadan önce DNA'yı seyreltmiş. Önceden etiketlenmiş özel PCR şeritlerine (kitte verilen) 2 μL seyreltilmiş DNA ile birlikte 2 μL tampon yerleştirin ve kapakları yerleştirin. Çalkalayıcıya 1 dakika yerleştirin, ardından PCR şeritlerinin aşağı doğru dönmesi. NOT: Tamponun viskozitesi nedeniyle, numune tüplerine aktarılmadan önce fazla tamponun uçtan çıkarıldığından emin olun.</li>
		<li>Kapaklar olmadan makineye, ekran kaydına ve PCR şeritlerine yerleştirin. Makinenin içindeki uç kutusunun kapağını açın. Pozisyonu uygun etiketlerle atayın. Makineyi çalıştırın. NOT: Çıkış histogramı, ampliconların istenen boyutunda tek bir tepe noktası olmalıdır (Şekil 1A). Düşük kalite örneklerinde, zayıf boncuk temizleme veya astar dimer oluşumunu gösteren ek tepeler gözlenecektir (Şekil 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Yeni nesil sıralama
<ol><li>Kütüphanenin nicelleştirilmesi ve havuzalenmesi<ol>
<li>3.1.8 adımındaki DNA değerini ve elektroforez makinesi sonuçlarından elde edilen ürünün zirvesinin temel çiftlerindeki (bp) boyutu kullanarak nM'deki nihai DNA konsantrasyonu hesaplamak (bkz. Şekil 1).</li>
		<li>Her örnek için, 10-20 μL elütion tamponunun son hacminde 4 nM'lik son konsantrasyon için alacak DNA hacmini hesaplayın.</li>
		<li>Her numune için yeni bir seyreltme karışımı hazırlayın ve ondan yeni bir havuz karışımına 2 μL alın. NOT: 4 nM'den az olan numuneler için mümkün olan en fazla numune miktarını ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NGS kütüphane çalışması NOT: Geçerli protokol bir tezgah üstü sıralayıcı platformu kullanır. Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.<ol>
<li>0.2 N NaOH taze bir çözelti hazırlayın. Adım 4.1.3'te hazırlanan seyreltilmiş kütüphaneye 10 μL 0.2 N NaOH ekleyin. Tüp ve girdaplara kısaca% 5 PhiX ekleyin. Tüm çözeltinin tüpün dibine yerleştiğinden emin olmak için tüpü aşağı çevirin.</li>
		<li>Çift iplikli DNA'yı denatüre etmek için oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Kısaca DNA ve girdap içeren tüpe kitten 980 μL önceden soğutulmuş tampon ekleyin.</li>
		<li>Seyreltilmiş kütüphaneyi buza yerleştirin ve kütüphaneyi aşağıdaki gibi hazırlayın. 17 pM'lik bir karışım için, 4.2.2 ve 575 μL tampon adımından 425 μL DNA ekleyin. Kütüphaneyi birkaç kez ters çevirin ve aşağı dönün. Son kütüphanenin 600 μL'lik kısmını belirlenen kartuşa yükleyin ve numuneleri makineye yerleştirin.</li>
		<li>Yazılım yönergelerini izleyerek çalıştırmayı başlatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Sıralama analizi
<ol><li>Sıralayıcıdan sıralama ölçümlerini indirin ve sıralama verilerinin aşağıdaki aralıklarda olduğunu doğrulayın (geçerli protokolde kullanılan kit için özel). Bu ölçütleri karşılamayan örnekler yinele çalıştırmaya tabidir: Küme Yoğunluğu (Yoğunluk (K/mm2)): 945K – 1800K Okuma geçiş filtresi yüzdesi (Kümeler PF (%):%>90 Kalite puanları (%>=Q30): >85% PhiX hizalaması (Hizalanmış %): %1,5 - %10 PhiX Hata Oranı (%): <1.0%</li>
</ol>

<ol><li>Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+and+regulation+of+chromosomal+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination.</a> Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).</li>
<li>Roth, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+Recombination%3A+Mechanism%2C+Errors%2C+and+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity.</a> Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).</li>
<li>Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+the+T-cell+receptor+repertoire%3A+pitfalls+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities.</a> Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).</li>
<li>Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+questions%2C+new+tools%3A+does+next-generation+sequencing+hold+the+key+to+unraveling+intestinal+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses.</a> Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+analysis+in+polygenic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases.</a> Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+and+B+cell+repertoire+diversity+in+patients+with+RAG+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency.</a> Science Immunology. 1 (6), (2016).</li>
<li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+T+and+B+Cell+Receptor+Repertoires+Patterns+in+Patients+With+IL10+Signaling+Defects+and+History+of+Infantile-Onset+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD.</a> Frontiers Immunology. 11, 109(2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+receptor+repertoires+in+pediatric+and+adult+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia.</a> Genome Medicine. 11 (1), 73(2019).</li>
<li>Chapman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T-cell+Receptor+Repertoire+in+Inflamed+Tissues+of+Patients+with+Crohn%27s+Disease+Through+Deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).</li>
<li>Werner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+receptor+beta+repertoire+patterns+in+pediatric+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Bashford-Rogers, R. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+B+cell+receptor+repertoire+in+six+immune-mediated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases.</a> Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+TCRbeta+CDR3+clonotypes+distinguish+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients.</a> Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).</li>
<li>Rosati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+disease-associated+traits+and+clonotypes+in+the+T-cell+receptor+repertoire+of+monozygotic+twins+affected+by+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journam+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases.</a> Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).</li>
<li>Allez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+clonal+expansions+in+ileal+Crohn%27s+disease+are+associated+with+smoking+behaviour+and+postoperative+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence.</a> Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2FHighV+QUEST+paradigm+for+T+cell+receptor+IMGT+clonotype+diversity+and+next+generation+repertoire+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling.</a> Nature Communications. 4, 2333(2013).</li>
<li>H, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+B-cell+receptor+repertoire+analysis+in+primary+immunodeficiencies%3A+from+severe+combined+immunodeficiency+to+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency.</a> Frontiers Immunology. 6, 157(2015).</li>
<li>Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+receptor+repertoire+sequencing+in+patients+with+primary+immunodeficiency%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review.</a> Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).</li>
<li>Zhuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+immune+repertoire+sequencing+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy.</a> International Immunopharmacology. 74, 105688(2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+beta+repertoires+as+novel+diagnostic+markers+for+systemic+lupus+erythematosus+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.</a> Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).</li>
<li>Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+dysregulation+in+immunodeficiency+disorders%3A+The+role+of+T-cell+receptor+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing.</a> Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).</li>
<li>Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+towards+personalized+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+System+Biology+and+Applications%22%5BJournal%5D)">A roadmap towards personalized immunology.</a> NPJ System Biology and Applications. 4, 9(2018).</li>
<li>Laubli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+repertoire+in+tumors+overlaps+with+pulmonary+inflammatory+lesions+in+patients+treated+with+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1386962(2018).</li>
<li>Hogan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Blood+TCR+Repertoire+Profiling+May+Facilitate+Patient+Stratification+for+Immunotherapy+against+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).</li>
<li>Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+T-Cell+Repertoire+Analysis+as+Source+of+Prognostic+and+Predictive+Biomarkers+for+Checkpoint+Blockade+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).</li>
<li>Hirsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+prognostic+value+of+clone-specific+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).</li>
<li>De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+T+Cell+Receptor+Sequencing%3A+Techniques+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges.</a> Frontiers Immunology. 9, 1638(2018).</li>
<li>Zemmour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+reveals+a+landscape+of+regulatory+T+cell+phenotypes+shaped+by+the+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR.</a> Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Infiltrating+T+Cells+in+Liver+Cancer+Revealed+by+Single-Cell+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing.</a> Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).</li>
</ol>

Tüm yazarların açıklayacak bir şeyi yoktur.

B ve T lenfositlerinin bolluğunda ve işlevinde değişikliklere genellikle farklı malignitelerde rastlanır18, kronik inflamatuar bozukluklar (örneğin, ülseratif kolit ve romatoid artrit)10,19ve çeşitli immün yetmezliklerde17,20. Mevcut yöntem, TCR ve BCR repertuarlarının derinlemesine görünümünü kolaylaştırmak için NGS'yi kullanır, T ve B hücre klonalitesinde ince değişikliklerin tes...

T ve B lenfositlerden oluşan adaptif bağışıklık sistemi, daha önce karşılaşılan bir antijeni tanımak ve hızlı bir yanıt başlatmak için immünolojik hafızayı kullanır. Lenfositler kemik iliğinde üretilir ve timusta (T hücreleri) veya kemik iliğinde (B hücreleri) olgunlaşır. Hem T hücre reseptörü (TCR) hem de B hücre reseptörü (BCR), belirli antijenlerin tanınmasını sağlayan benzersiz konfigürasyonlar görüntüler. Homeostazda, T ve B hücreleri antijen sunan hücrelerde sunulan trilyonlarca farklı peptidi sürekli dolaşıma sokar ve inceler. Yüksek benzeşimli belirli bir antijenin TCR veya BCR ligasyonu, uygun ko-stimülasyon ile birlikte hücre aktivasyonuna yol açar ve B hücreleri durumunda sitokin salgılanması, klonal genişleme ve antikorların üretilmesine neden olur.
Farklı T veya B hücrelerinin muazzam dizisi, sayısız farklı epitopun tanınmasını sağlayan toplu olarak bağışıklık repertuarı olarak adlandırılmıştır. Böylesine geniş bir repertuar oluşturmak için, farklı gen segmentlerinin rastgele montajının karmaşık bir süreci gerçekleşir ve benzersiz antijenleri bağlayabilen reseptörlerin neredeyse sonsuz kombinasyonları oluşturulur1. V(D)J rekombinasyonu olarak adlandırılan bu işlem, kavşaklarda rastgele silmeler ve nükleotid eklemeleri eşliğinde farklı değişken (V), çeşitlilik (D) ve birleştirme (J) genlerinin yeniden düzenlenmesini içerir2.
Adaptif bağışıklık sisteminin mimarisi, bilim insanlarını uzun yıllardır farklı alanlarda ilgilendirmektedir. Geçmişte, Sanger dizilimi, tamamlayıcı belirleyici bölge 3 (CDR3) spektratilleme ve akış sitometrisi bağışıklık repertuarını karakterize etmek için kullanıldı, ancak düşük çözünürlük sağladı. Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) yöntemlerindeki gelişmeler, bireyin TCR ve BCR repertuarlarının özellikleri ve kompozisyonu hakkında derinlemesine içgörü sağladı3,4. Bu yüksek verimli sistemler (HTS) milyonlarca yeniden düzenlenmiş TCR veya BCR ürününü aynı anda sıralar ve işler ve nükleotid veya amino asit seviyesindeki belirli T ve B hücrelerinin yüksek çözünürlüklü analizine izin verir. NGS, hem sağlık hem de hastalıkta bağışıklık repertuarını incelemek için yeni bir strateji sağlar. HTS kullanılarak yapılan çalışmalarda otoimmün hastalıklar5,primer immün yetmezlikler6,7ve akut miyeloid lösemi8gibi malignitelerde değişen TCR ve BCR repertuarları gösterilmiştir. NGS kullanarak, biz ve diğerleri, ülseratifkolit ve Crohn hastalığı 9 , 10 , 11, 12,13,14dahil olmak üzere enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) olan hastalarda spesifik T ve B hücre klonlarının oligoklonal genişlemesini gösterdik. Genel olarak, farklı alanlardan yapılan çalışmalar, repertuardaki değişikliklerin bağışıklık aracılı bozuklukların patogenezinde çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir.
Mevcut protokol, DNA'nın bağırsak biyopsilerinden ve kanından izole edilmesini, NGS için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretilmesini ve sıralama çalışmasının performansını açıklar. Ayrıca bağışıklık repertuar veri analizinde temel adımlar sağlıyoruz. Bu protokol TCRα, TCRφ ve IGL kitaplıklarının üretimi için de uygulanabilir. Yöntem, dokuya özgü sindirim protokolleri kullanıldığı sürece diğer organlarla (örneğin lenf düğümleri, tümörler, sinovyal sıvı, yağ dokusu vb.) uyumludur.

<table><tbody><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL mikro santrifüj tüpleri</td><td>Axygen</td><td>8187631104051</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Greiner</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Merck</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Altın</td><td>Termo Balıkçı</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Boncuk</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>Bioer</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 Numune Tamponu</td><td>Agilent</td><td>5067-5603</td><td>Tapestation için</td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>Tapestation için. Tüpler ayrı olarak satılır</td></tr><tr><td>Lymphotrack Test kiti</td><td>Invivoscribe</td><td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td><td>Her biri 24 indeks içerir</td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v2 (500 döngü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>Standart akış hücresi tipini ve gerekli tüm reaktifleri içerir</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PCR şeritleri</td><td>4titude</td><td>4ti-0792</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Invitrogen</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Florometre</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>Tampon, boya, standartlar ve özel tüpler içerir</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Biosan</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>ultra saf su</td><td>Bio-lab</td><td>7501</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbaz DNA izolasyon kiti</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Hücre lizis solüsyonu, çekirdek lizis solüsyonu ve protein çökeltme tamponu içerir</td></tr></tbody></table>

yeni nesil dizileme kullanılarak t ve b hücre reseptörü İmmün repertuar analizi

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

Adaptif bağışıklığın ayırt edici özelliği olan immünolojik hafıza, T ve B lenfositleri tarafından düzenlenmiştir. Dolaşımda ve farklı organlarda milyarlarca benzersiz T ve B hücre klonu vardır ve her biri belirli bir antijeni bağlayarak çoğalmaya, farklılaşmaya ve/veya sitokin salgılanmasına yol açabilir. T ve B hücrelerindeki geniş heterojenlik, farklı genetik segmentlerin rastgele rekombinasyonu ile oluşur. Son on yılda geliştirilen yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri, T ve B hücre reseptör immün repertuarının eşi görülmemiş bir derinlemesine görünümünü sağlıyor. Çeşitli inflamatuar durumlar, immün yetmezlikler, enfeksiyonlar ve malignitelerde yapılan çalışmalar, bağışıklık repertuarının klonalite, gen kullanımı ve biyofiziksel özelliklerinde belirgin değişiklikler göstererek, adaptif immün yanıtların farklı bozukluklardaki rolü hakkında önemli bilgiler sağlamıştır.
Burada, kan ve dokudan T ve B hücrelerinin bağışıklık repertuarının NGS için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kütüphane hazırlığı, NGS sıralayıcı üzerinde sıralama ve temel analizlerle biten DNA izolasyonundan başlayarak bir boru hattı sunuyoruz. Bu yöntem, nükleotid veya amino-asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı hastalıklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Bu teknik yavaş yavaş klinik uygulamaya giriyor ve yeni biyobelirteçlerin tanımlanması, risk tabakalaşması ve hassas tıp potansiyeline sahip.

Burada, bağırsak dokusu ve kandan DNA izolasyonu, NGS için kütüphanelerin hazırlanması ve bağışıklık repertuar dizilimi için bir sıralama çalışmasının temel adımları için bir yöntem açıklıyoruz. Çalıştırma, uluslararası ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST platformunda kullanılmak üzere fasta dosyalarına daha fazla dönüştürülebilen fastq dosyaları oluşturacaktır. Bu HTS, nükleotid seviyesi15'teon binlerce yeniden düzenlenmiş TCRβ ve IGH dizisinin birçok analizini gerçekleştirir ve yönetir. IMGT/HighV...

Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

Bu yöntem, nükleotid veya amino asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı bozukluklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Yeni nesil dizilemenin avantajı, benzersiz T veya B hücre klonlarını tanımlama ve farklı anatomik bölgelerde veya farklı bireylerde izleme yeteneğidir. Bu, çeşitli hastalıklarda yeni biyobelirteçlerin tanımlanması potansiyeline sahiptir.Bu prosedürü gösteren Naomi Salamon, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı. Bağırsak biyopsilerinin sindirimini ve hücre lizizini yaparak başlayın. Bağırsak biyopsilerini taze toplanmış veya negatif 20 veya negatif 80 santigrat derecede depolanmış olarak alın.Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün. Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 600 mikrolitre çekirdek liziz çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpe bir biyopsi yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Mililitre başına 20 miligram proteinaz K'den oluşan 17,5 mikrolitre ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak 55 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, numunenin beş dakika boyunca oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Kandan DNA izolasyonu için, tüpü iyice karışana kadar hafifçe sallayın.Daha sonra kanı dokuz mililitre hücre liziz çözeltisi içeren steril 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka süresi boyunca tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600g'de santrifüj.Ardından, görünür beyaz peletin rahatsız edilmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Tüpü tamamen yeniden depolanıncaya kadar 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteks edin. Üç mililitre çekirdek liziz çözeltisi ve pipet birkaç kez ekleyerek çözeltinin viskoz hale gelmesine neden olun.Numuneye protein çökeltme tamponu ekleyin. Sonra 20 saniye boyunca güçlü bir şekilde girdaplayın ve beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Çökemiş proteinleri içeren sıkı bir pelet oluşturmak için dört dakika boyunca 16.000g'de santrifüj.Peletin rahatsız edilmeden süpernatant'ı yeni bir 1,7 mililitrelik tüpe dikkatlice aktarın. Süpernatant içeren tüpe bir mililitre 2 propanol ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. DNA beyaz yüzen bir madde olarak görünür hale gelmelidir.Bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj ve süpernatantı tamamen çıkarın. Bir mililitre taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca 16.000g'de santrifüj edin.Sonra süpernatant dikkatlice atın. Etanol yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra DNA peletini 10 ila 15 dakika boyunca havayla kurumaya bırakın.DNA'ya 50 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi DNA nicelemesi gerçekleştirin. Kütüphaneyi sıralamaya hazırlamak için 150 nanogram DNA kullanın. Artık DNA'yı parçalamak için 15 dakika boyunca UV ışıklı kaputun içine pipetler ve uçlar yerleştirin.Bu arada, farklı indeks tüplerinin ve DNA polimerazlarının buzda çözülmesine izin verin. Biyolojik bir başlıkta, çapraz kontaminasyonu önlemeye dikkat ederek, farklı indeks tüplerinden PCR tüplerine 45 mikrolitre ekleyin. Daha sonra PCR tüplerine 0,2 mikrolitre DNA polimeraz ve hazırlanan DNA'nın beş mikrolitresini ekleyin.PCR'yi üreticinin talimatlarına göre önceden ayarlanmış bir program kullanarak çalıştırın. Fazla astarların, nükleotitlerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanın. Boncukları oda sıcaklığına en az 30 dakika ısıtın ve numune başına 400 mikrolitre için yeterli taze% 80 etanol hazırlayın.Boncukları her PCR tüpüne ekleyin ve 10 kez pipetleme yaparak karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Karışık numuneyi beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin.Sonra berrak sıvıyı epire edin ve atın. Kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak emiş edin. Her numuneye %80 etanolden oluşan 200 mikrolitre ekleyin ve 30 saniye kuluçkaya yatırın.195 mikrolitre etanol epire edin ve atın. Daha sonra kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak aspire edin. Etanol yıkamayı tekrarlayın.Sonra tüplerin kapaklarını açın ve beş dakika boyunca havayla kurumasına izin verin. Beş dakika sonra, örnekleri manyetik standdan çıkarın ve 25 mikrolitre elution tamponu ekleyin. Homojen olana kadar pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın.Tüpleri beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Daha sonra 22 mikrolitreyi yeni bir PCR tüpüne aktarın ve DNA konsantrasyonu ölçün. Metin el yazmasında açıklandığı gibi amplicon'un ölçülmesi.Son DNA konsantrasyonunu ve ürünün zirvesinin taban çiftlerindeki boyutu hesaplandıktan sonra, her örnek için yeni bir seyreltme karışımı hazırlayın ve iki mikrolitresini yeni bir havuz karışımına aktarın. 0,2 normal sodyum hidroksit taze bir çözelti hazırlayın ve seyreltilmiş kütüphaneye 10 mikrolitre ekleyin. Çift iplikli DNA'yı yok etmek için oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatır.Daha sonra kitten DNA içeren tüpe 980 mikrolitre önceden soğutulmuş tampon ekleyin ve kısaca girdap ekleyin. Son kütüphanenin 600 mikrolitresini belirlenen kartuşa yükleyin ve numuneleri makineye yerleştirin. Sıralama çözümlemesi yapmak için sıralayıcıdan sıralama ölçümlerini indirin ve verilerin uygun aralıklarda olduğunu doğrulayın.Ölçütlere uymayan örnekler için çalıştırmayı yineleyin. Bu protokol, IL10 reseptör eksikliği ve şiddetli infantil başlangıçlı IBD öyküsü olan bir hastanın temsili otolog kan ve rektal örneklerinin temel analizini yapmak için kullanılmıştır. Örnekler hem TCR-beta hem de IGH repertuarı için test edildi.Tüm klonlar nükleotid veya amino asit seviyesindeki benzersiz dizileriyle tanımlanabilir. Bu diziler, paylaşılan klon arayışındaki farklı hastalar arasında veya aynı hastada farklı anatomik bölgeler arasında karşılaştırılabilir. Her örnek için en sık kullanılan beş klon burada gösterilmiştir.TreeMap görüntüleri, repertuara geniş bir genel bakış için oluşturulmuştu. Her renkli kare farklı bir klonu temsil eder ve boyut sıklığıyla ilişkilidir. Bu TreeMap görüntüleri bağırsak IGH repertuarında klonal genişleme göstermektedir.Buna karşılık, TCR-beta repertuarında, otolog bağırsağı ile karşılaştırıldığında kanda belirgin klonal genişleme gözlenir. Gen düzeyinde NGS, gen, aile veya alele düzeyinde V, D ve J kullanımı hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, TCR-beta ve IGH repertuarlarının verilerinden belirli VDJ kombinasyonları çıkarılabilir ve çeşitli koşullarda diferansiyel gen kullanım kalıpları ortaya çıkarılabilir.Bu protokol hem DNA hem de RNA'da uygulanabilir ve TCR-alfa, TCR-gama ve IGL repertuarları oluşturmak için kullanılabilir. Hafif sindirim modifikasyonlarından sonra diğer organlarla da uyumludur.

t-b-cell-receptor-immune-repertoire-analysis-using-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, lenfomaların rekombine immünoglobulin ağır zincirli VDJ bölgelerini derin dizileme ile sorgulamak ve tek tek tümörün klonal mimarisini tanımlamak için VDJ yeniden düzenlemesini ve somatik hipermutasyon durumunu geri almak için bir yaklaşımı tanımlar. Eşleştirilmiş tanı ve nüks örnekleri arasındaki klonal mimarinin karşılaştırılması, lenfoma nüks klonal evrim modlarını ortaya çıkarır.

VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Burada, klasik Hodgkin lenfoma (HRS) hücrelerinden Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) hücrelerinden yüksek kaliteli, tamamen exome veri üretmek üzere tasarlanmış, kombine bir akış sitometrik hücre sıralama ve düşük girişli, yeni nesil kütüphane yapılandırma protokolünü açıklıyoruz.

Klasik Hodgkin Lenfomalı Reed-Sternberg Hücrelerinin Akış-Sıralama ve Ekstraksiyon Sıralaması

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Burada, analiz ve görselleştirme yapısı ve bütün antikor kapsayacağını Anayasası için iletişim kuralları açıklar. Bu büyük yeni nesil sıralama kullanarak antikor RNA dizisi edinimi içerir.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Solid tümör dokularının kantitatif immün profillerini belirlemek ve immün-onkoloji biyomarker keşfi için klinik kohortlardan yararlanmak için RNA tabanlı bir yaklaşımın kullanımı moleküler ve enformatik protokollerle açıklanmıştır.

Solid Tümörlerin Prediktif İmmün Modellemesi

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Öğrenin T ve B hücre reseptörü immün repertuar analizi için yeni nesil dizileme yöntemini. Kan ve intestinal biyopsi örneklerinden DNA izolasyonu ve klon takibi ile bağışıklık dinamiklerini keşfedin.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Daha fazla video keşfet