Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi
12 Ocak 2021
Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Bu yöntem, nükleotid veya amino asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı bozukluklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Yeni nesil dizilemenin avantajı, benzersiz T veya B hücre klonlarını tanımlama ve farklı anatomik bölgelerde veya farklı bireylerde izleme yeteneğidir. Bu, çeşitli hastalıklarda yeni biyobelirteçlerin tanımlanması potansiyeline sahiptir.
Bu prosedürü gösteren Naomi Salamon, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı. Bağırsak biyopsilerinin sindirimini ve hücre lizizini yaparak başlayın. Bağırsak biyopsilerini taze toplanmış veya negatif 20 veya negatif 80 santigrat derecede depolanmış olarak alın.
Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün. Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 600 mikrolitre çekirdek liziz çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpe bir biyopsi yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Mililitre başına 20 miligram proteinaz K'den oluşan 17,5 mikrolitre ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak 55 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, numunenin beş dakika boyunca oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Kandan DNA izolasyonu için, tüpü iyice karışana kadar hafifçe sallayın.
Daha sonra kanı dokuz mililitre hücre liziz çözeltisi içeren steril 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka süresi boyunca tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600g'de santrifüj.
Ardından, görünür beyaz peletin rahatsız edilmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Tüpü tamamen yeniden depolanıncaya kadar 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteks edin. Üç mililitre çekirdek liziz çözeltisi ve pipet birkaç kez ekleyerek çözeltinin viskoz hale gelmesine neden olun.
Numuneye protein çökeltme tamponu ekleyin. Sonra 20 saniye boyunca güçlü bir şekilde girdaplayın ve beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Çökemiş proteinleri içeren sıkı bir pelet oluşturmak için dört dakika boyunca 16.000g'de santrifüj.
Peletin rahatsız edilmeden süpernatant'ı yeni bir 1,7 mililitrelik tüpe dikkatlice aktarın. Süpernatant içeren tüpe bir mililitre 2 propanol ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. DNA beyaz yüzen bir madde olarak görünür hale gelmelidir.
Bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj ve süpernatantı tamamen çıkarın. Bir mililitre taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca 16.000g'de santrifüj edin.
Sonra süpernatant dikkatlice atın. Etanol yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra DNA peletini 10 ila 15 dakika boyunca havayla kurumaya bırakın.
DNA'ya 50 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi DNA nicelemesi gerçekleştirin. Kütüphaneyi sıralamaya hazırlamak için 150 nanogram DNA kullanın. Artık DNA'yı parçalamak için 15 dakika boyunca UV ışıklı kaputun içine pipetler ve uçlar yerleştirin.
Bu arada, farklı indeks tüplerinin ve DNA polimerazlarının buzda çözülmesine izin verin. Biyolojik bir başlıkta, çapraz kontaminasyonu önlemeye dikkat ederek, farklı indeks tüplerinden PCR tüplerine 45 mikrolitre ekleyin. Daha sonra PCR tüplerine 0,2 mikrolitre DNA polimeraz ve hazırlanan DNA'nın beş mikrolitresini ekleyin.
PCR'yi üreticinin talimatlarına göre önceden ayarlanmış bir program kullanarak çalıştırın. Fazla astarların, nükleotitlerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanın. Boncukları oda sıcaklığına en az 30 dakika ısıtın ve numune başına 400 mikrolitre için yeterli taze% 80 etanol hazırlayın.
Boncukları her PCR tüpüne ekleyin ve 10 kez pipetleme yaparak karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Karışık numuneyi beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin.
Sonra berrak sıvıyı epire edin ve atın. Kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak emiş edin. Her numuneye %80 etanolden oluşan 200 mikrolitre ekleyin ve 30 saniye kuluçkaya yatırın.
195 mikrolitre etanol epire edin ve atın. Daha sonra kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak aspire edin. Etanol yıkamayı tekrarlayın.
Sonra tüplerin kapaklarını açın ve beş dakika boyunca havayla kurumasına izin verin. Beş dakika sonra, örnekleri manyetik standdan çıkarın ve 25 mikrolitre elution tamponu ekleyin. Homojen olana kadar pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın.
Tüpleri beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Daha sonra 22 mikrolitreyi yeni bir PCR tüpüne aktarın ve DNA konsantrasyonu ölçün. Metin el yazmasında açıklandığı gibi amplicon'un ölçülmesi.
Son DNA konsantrasyonunu ve ürünün zirvesinin taban çiftlerindeki boyutu hesaplandıktan sonra, her örnek için yeni bir seyreltme karışımı hazırlayın ve iki mikrolitresini yeni bir havuz karışımına aktarın. 0,2 normal sodyum hidroksit taze bir çözelti hazırlayın ve seyreltilmiş kütüphaneye 10 mikrolitre ekleyin. Çift iplikli DNA'yı yok etmek için oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatır.
Daha sonra kitten DNA içeren tüpe 980 mikrolitre önceden soğutulmuş tampon ekleyin ve kısaca girdap ekleyin. Son kütüphanenin 600 mikrolitresini belirlenen kartuşa yükleyin ve numuneleri makineye yerleştirin. Sıralama çözümlemesi yapmak için sıralayıcıdan sıralama ölçümlerini indirin ve verilerin uygun aralıklarda olduğunu doğrulayın.
Ölçütlere uymayan örnekler için çalıştırmayı yineleyin. Bu protokol, IL10 reseptör eksikliği ve şiddetli infantil başlangıçlı IBD öyküsü olan bir hastanın temsili otolog kan ve rektal örneklerinin temel analizini yapmak için kullanılmıştır. Örnekler hem TCR-beta hem de IGH repertuarı için test edildi.
Tüm klonlar nükleotid veya amino asit seviyesindeki benzersiz dizileriyle tanımlanabilir. Bu diziler, paylaşılan klon arayışındaki farklı hastalar arasında veya aynı hastada farklı anatomik bölgeler arasında karşılaştırılabilir. Her örnek için en sık kullanılan beş klon burada gösterilmiştir.
TreeMap görüntüleri, repertuara geniş bir genel bakış için oluşturulmuştu. Her renkli kare farklı bir klonu temsil eder ve boyut sıklığıyla ilişkilidir. Bu TreeMap görüntüleri bağırsak IGH repertuarında klonal genişleme göstermektedir.
Buna karşılık, TCR-beta repertuarında, otolog bağırsağı ile karşılaştırıldığında kanda belirgin klonal genişleme gözlenir. Gen düzeyinde NGS, gen, aile veya alele düzeyinde V, D ve J kullanımı hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, TCR-beta ve IGH repertuarlarının verilerinden belirli VDJ kombinasyonları çıkarılabilir ve çeşitli koşullarda diferansiyel gen kullanım kalıpları ortaya çıkarılabilir.
Bu protokol hem DNA hem de RNA'da uygulanabilir ve TCR-alfa, TCR-gama ve IGL repertuarları oluşturmak için kullanılabilir. Hafif sindirim modifikasyonlarından sonra diğer organlarla da uyumludur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kan örneklerinden ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu yapılmasına, yeni nesil dizileme (NGS) için TCR ve IGH PCR kütüphanelerinin oluşturulmasına ve temel veri analizlerinin gerçekleştirilmesine yönelik bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nükleotid veya amino asit düzeyinde T ve B hücresi dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanıyarak, farklı anatomik bölgelerdeki benzersiz klonların tanımlanmasını kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Genomik
- Yeni Nesil Dizileme
Arka Plan
- Yeni nesil dizileme, lenfosit popülasyonlarının ayrıntılı analizine olanak tanır.
- Bu yöntem, çeşitli bozukluklarda bağışıklık yanıtlarındaki dinamik değişiklikleri ortaya çıkarabilir.
- Benzersiz T veya B hücresi klonlarının tanımlanması, yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesini sağlayabilir.
- Prosedür, laboratuvarda bir araştırma asistanı tarafından gösterilmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Sıralama amacıyla biyolojik örneklerden DNA izole etmek.
- Farklı hastalıklardaki T ve B hücresi çeşitliliğini analiz etmek.
- Çeşitli anatomik bölgelerdeki bağışıklık hücresi klonlarını takip etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kan ve intestinal biyopsilerden DNA izolasyonu.
- TCR ve IGH PCR kütüphanelerinin oluşturulması.
- Yeni nesil dizileme (NGS) işlemlerinin yürütülmesi.
- Dizileme sonuçlarının temel veri analizi.
Ana Sonuçlar
- Örneklerden DNA'nın başarılı bir şekilde izolasyonu.
- NGS için uygun kütüphanelerin oluşturulması.
- Benzersiz T ve B hücre klonlarının tanımlanması.
- Çeşitli bozukluklarda lenfosit çeşitliliğine dair içgörüler.
Sonuçlar
- Bu yöntem, immün dinamiklerin anlaşılmasını geliştirir.
- Hastalıklarda biyobelirteçlerin belirlenmesi için bir çerçeve sunar.
- Yaklaşım, çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Alaka Düzeyi
Yeni nesil dizileme yoluyla T ve B hücresi reseptör immün repertuar analizi, biyofarma Ar-Ge çalışmalarına adaptif immün dinamiklerin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü sunarak, hedef validasyonu ve biyobelirteç keşfinde mekanistik risk azaltma imkanı sağlar. Hastalık durumları boyunca klonaliteyi, gen kullanımını ve repertuar çeşitliliğini nicelleştiren bu yöntem, erken keşif ve translasyonel karar verme süreçlerinde öngörücü güvenilirliği destekler. Bu yetkinlik, inflamatuar, enfeksiyöz, onkolojik ve otoimmün durumlarda immün yanıtları terapötik sonuçlarla ilişkilendirmeyi amaçlayan immünoloji odaklı pipeline'lar için doğrudan uygulanabilirdir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Farklı anatomik bölgelerde ve zaman noktalarında antijene özgü T ve B hücresi klonlarını takip ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fonksiyonel hedef etkileşimini netleştirmek ve biyolojik riskleri azaltmak için immün repertuarların nükleotid veya amino asit düzeyinde çözünürlüğünü sağlar.
- Öngörücü Değer: Hastalık fenotipi veya tedavi yanıtı ile korelasyon gösteren klonal olarak genişlemiş popülasyonları tanımlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik değerlendirmesi için uygun, standardize edilmiş, kantitatif immün repertuvar profilleri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Kan ve dokudan, sonraki tarama iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasına olanak tanır.
- Teknik Değer: Bileşik veya biyolojik madde tarama kampanyaları için güvenilir okumalar sağlayan klonalite ve çeşitlilik metrikleri üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Hastalıkla ilişkili sistemlerde klonal dinamikleri izleyerek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği sağlar.
- Biyobelirteç Uyumluluğu: Hastalar arasında ortak veya genişlemiş klonların tanımlanmasını kolaylaştırarak, immün aracılı bozukluklarda translasyonel biyobelirteç keşfini destekler.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: Patofizyoloji ile ilişkili farklı VDJ gen kullanımı ve klonal genişleme modellerini ortaya çıkararak, go/no-go (devam/durdur) kararlarına temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlama ve preklinik çalışmalara kadar uzanan keşif sürecine entegre edilmektedir; özellikle bağışıklık mekanizmasının risklerinin azaltılmasının kritik olduğu immünoloji ve immüno-onkoloji süreçlerinde önem taşır.
- Keşif Biyolojisi: T ve B hücre bölmelerindeki antijen kaynaklı klonal seçilimi ve genişlemeyi ortaya çıkararak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: İzole edilmiş DNA'dan TCR ve IGH repertuvarlarının standartlaştırılmış kütüphane hazırlığı ve sekanslanması yoluyla analiz hazır hale getirilmesini sağlar.
- Analitikler: Karşılaştırmalı durum analizi için klonalite, gen ailesi kullanımı (V, D, J) ve benzersiz klon takibi dahil olmak üzere kantitatif çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Kan ve doku bölmelerindeki immün klonların boylamsal takibine olanak tanıyarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Protokol adaptasyonundan sonra birden fazla hastalık alanı ve örnek tipi genelinde uygulanabilen yeniden kullanılabilir bir platform yetkinliği olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Reperatuvar dinamiklerinin doğrudan ölçümü aracılığıyla, immün aracılı hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü DNA izolasyonu, kütüphane hazırlığı ve NGS iş akışları yoluyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: İmmünolojik olarak aktif klonların erken tanımlanmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve geç aşama biyolojik riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: İmmün reperatuvar değişikliklerini hastalık mekanizmaları ve terapötik müdahale ile ilişkilendirerek riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- İmmünogenomik, NGS kütüphane hazırlığı ve immün repertuvar verilerinin biyoinformatik analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- NGS sekanslayıcılara, manyetik boncuk tabanlı saflaştırma sistemlerine ve DNA işlemleri için kontrollü laboratuvar ortamlarına erişime bağlıdır.
- Tutarlı repertuvar analizi için immünoloji, genomik ve veri bilimi birimleri arasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- DNA verimini ve bütünlüğünü koruyarak, bağırsak dışı organlar için doku sindirim protokollerinin adaptasyonunu gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında girdi DNA miktarı gereksinimleri ve kütüphane hazırlığı sırasındaki PCR amplifikasyonundan kaynaklanabilecek potansiyel yanlılıklar yer alır.
