Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

İn vitro veya inşa edilmiş insan epidermis modeli ilk olarak doksanlı yıllarda hayvan deneylerine alternatif test yöntemleri geliştirmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu 3D epidermal modeller artık kozmetik bileşenlerin hem güvenliğini hem de etkinliğini test etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Birkaç doku tedarikçisinden satın alınabilirken, bir laboratuvarda 3D modeli yeniden inşa edebilmek, ilginin son noktasına daha fazla esneklik sağlar.

3D epidermal modelin yeniden yapılanma protokolünü kısaca açıklayan birkaç araştırma makalesi vardır, ancak bugüne kadar yeniden yapılanma sürecinin kritik adımlarını gösteren bir video yoktu. Bu video makalenin yayımlanmasının arkasındaki neden budur. Kurum içinde yeniden inşa edilmiş insan epidermisinin hazırlanması, kültür ortam bileşimindeki değişiklikler, pro-enflamatuar veya oksidatif stres tetikleyicileri, ilgi genlerinin susturülmesi ve belirli biyolojik süreçlerin inhibisyonu veya uyarılması gibi kültleşme sürecinde çok fazla özgürlüğe izin verir.

Başlamak için, şişenin bir kısmını suya batırarak 37 santigrat derecede bir su banyosunda 1 milyon kriyo ile korunmuş normal insan epidermal keratinositleri veya NHEK'ler içeren bir şişeyi çözün. Şişeyi su banyosunda bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın, ta ki sadece küçük bir buz parçası görünene kadar. hücreleri iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyarak çok dikkatli bir şekilde yeniden biriktirin.

Hücre süspansiyonu, önceden uyarılmış toplam 15 mililitrelik çözülme ortamı içeren iki T75 şişesine aktarın, bu da santimetrekare başına dördüncü hücrelere 6,7 çarpı 10 tohumlama yoğunluğuna neden olur. İdeal olarak bir dağıtıcı pipet kullanarak 24 kuyu plakasını 1,5 mililitre batık ortamla önceden doldurun. Hücreleri% 80 izdiah ettikten sonra, yeniden yapılandırılmış insan epidermisinin veya RHE'lerin yetiştirilmesi için kesici uçlarda tohumlanmaya hazırdırlar.

Bazal ortamı NHEK'lerle T75 şişelerinden çıkarın. Her T75 şişesine beş mililitre önceden ısıtılmış PBS ekleyerek hücreleri durulayın, ardından PBS'yi şişelerden çıkarın. Her şişeye önceden ısıtılmış iki ila üç mililitre önceden ısıtılmış %0,05 Trypsin-EDTA ekleyin, tripin çözeltisinin şişenin hücre kültürü alanına eşit olarak dağıtıldığından emin olun.

Şişeleri dört dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, ardından hücrelerin mikroskobu kullanarak 10 X büyütmede ayrılıp ayırmadığını kontrol edin. Hücrelerin şişenin yüzeyinden salınmasını sağlamak için şişeyi rap. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, her T75 şişesine eşit miktarda önceden ısıtılmış tripsin inhibitörü ekleyin ve hücre süspansiyonu şişelerden bir santrifüj tüpüne aktarın.

Şişeleri beş mililitre önceden ısıtılmış PBS ile durulayın ve hücre süspansiyonu içeren santrifüj tüpüne aktarın. Hasat edilen hücreleri beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Tüpte yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre bırakarak süpernatantın çoğunu dikkatlice atın.

Peleti dikkatlice gevşetmek için tüpü parmaklarınızla hafifçe kaydırın. Tek tip bir hücre süspansiyonu sağlamak için 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme, düşük hacimli batık ortamda hücrelerin peletini hafifçe yeniden biriktirin. Hücre agregalarının oluşumunu önlemek için düşük bir hacimle başlayın ve ilk T75 şişesi başına bir mililitreye kadar batık ortam ekleyin.

Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak süspansiyondaki hücreleri sayın. Metin elyazmasında sağlanan ilk denklemi kullanarak mililitre başına beşinci hücrelere 3.525 çarpı 10 konsantrasyona ulaşmak için hücre süspansiyonu ek batık ortamla seyreltin. Seyreltilmiş çözeltinin ikinci hücre sayısını gerçekleştirin ve kültür eklemesine tohumlanacak hücre süspansiyon hacmini hesaplamak için metin el yazmasındaki ikinci denklemi kullanın.

24 kuyu kültürü kesici uçlarını taşıyıcı plakanın en yüksek konumuna asın ve taşıyıcı plakayı önceden batırılmış ortamla doldurulmuş 24 kuyu plakasına aktarın. Hücre süspansiyonunun belirlenen hacmini her kesici uça ekleyin ve kesici uçlara dokunmamaya dikkat edin. Tohumlamadan sonra, kenar etkisinin üstesinden gelmek için 24 kuyu plakasını oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.

Bu süre zarfında plakaları hareket ettirmeyin. Plakaları hücre kültürü inkübatörüne aktarın ve üç gün boyunca su altında bırakın. Hücre kültürü inkübatöründe üç günlük bir inkübasyondan sonra, bir aspirasyon sistemi ve bir cam Pasteur pipet ile su altında kalan ortamı apikal bölmeden çıkararak membran yüzeyine yapışmış hücreleri hava sıvı arayüzüne veya ALI'ye maruz kalın.

Yeni 24 kuyu plakasını 1,5 mililitre taze önceden ısıtılmış ALI ortamıyla doldurun ve taşıyıcı plakaları kültür kesici uçlarıyla yeni çok kuyulu plakalara aktarın. Çok kuyulu plakaları hücre kültürü inkübatörüne geri aktarın. ALI ortamını 14 gün boyunca her iki ila üç günde bir yenileyin.

2B kültürdeki keratinositler, tutarlı bir çokgen şekle sahip geleneksel bir morfoloji görüntüler. ALI'de 15 gün kaldıktan sonra, yeniden inşa edilen insan epidermisi, dört ana epidermal tabakası ile belirtilen tamamen tabakalı bir doku oluşturur. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin rekonstrüksiyon protokolünde farklı zaman noktalarında ultrayapısal analizi, zaman içinde artan kornea alanı katmanları ile kornifikasyon sürecini ortaya koymaktadır.

Epidermisteki keratinositler farklılaşma evrelerine göre farklı protein ekspresyon profilleri gösterirler. İnvolucrin ekspresyyönemi daha çok SG katmanında görünürken, filaggrin ve loricrin ifadesi üst katmanlarda bulunur. Keratin-10 ekspresyâtı SB tabakası hariç tüm uygulanabilir katmanlarda bulundu.

Yeniden inşa edilen insan epidermisi, uygulanabilir epidermal katmanların hücreler arası boşluğunda Desmoglein-1'in ifadesiyle belirtildiği gibi fonksiyonel desmosomal kavşakları görüntüler. Yeniden yapılan epidermis modelinin bariyer özellikleri, bilinen bir bariyer bozucu ile topikal tedavi üzerine doku canlılığı değerlendirilerek ve doku bütünlüğü değerlendirilerek araştırılmıştır. Doku bütünlüğü 15 gün sonra TEER'in voltmetre ile ölçülmesiyle belirlendi.

Epidermisin Lipopolisakkarit ve Tümör Nekroz Faktörü alfaya duyarlılığı araştırıldı. Hem LPS hem de TNF alfa tedavileri toksik değildi. Triton X-100 kontrolüne göre.

Interleukin-1 alfa ve Interleukin-8'in RHE ortamında salınımı IL lizisi kullanılarak ölçüldü. LPS tedavisi Interleukin-1 alfa ve Interleukin-8'in salınımında istatistiksel olarak anlamlı bir yukarı regülasyonla sonuçlandı. TNF alfa tedavisi sadece Interleukin-1 alfa salınımında istatistiksel olarak anlamlı bir yukarı regülasyon ile sonuçlandı.

Bununla birlikte, TNF alfa ile uyarılma üzerine Interlökin-8 seviyelerinde belirgin bir eğilim de gözlenmiştir. Bu protokolün ardından TEER, bariyer bütünlüğü için bir değer olarak ölçülebilir. Canlılık veya sitotoksiklik, örneğin bir MTT veya LDH tahlili ile ölçülebilir.

Süpernatant sitokinlerin veya diğer proteinlerin salgısını ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, doku proteinlerin veya ilgi genlerinin ekspresyonunun incelenmesi için kullanılabilir.