Name: Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, insan epidermisinin üç boyutlu yeniden yapılandırılması için kapsamlı bir protokol. Bu yöntem, NHEK hücreleri kullanarak 15 günde tam katmanlı doku oluşturur ve kozmetik güvenlik testleri için esnek bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Avrupa Birliği'nin Marie Skłodowska-Curie Grant kapsamındaki Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı, 765602 numaralı hibe anlaşması ile bu çalışmayı finanse etti. Tüm yazarlar Adolphe Merkle Vakfı ve Ferrara Üniversitesi'nin desteğini kabul eder ve Dow Silicones Belçika'yı minnetle kabul eder. Dr. Miguel Spuch-Calvar, RhE yetiştirme sürecinin grafiksel görüntülerini hazırladığı için kabul edilir. Yazarlar teknik destekleri ve tartışmaları için Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati ve Dr. Agnès Tessier'e teşekkür ediyor.

Bu protokolü içeren herhangi bir araştırma faaliyetini planlamadan ve yürütmeden önce insan dokularının veya hücrelerinin kullanımıyla ilgili ulusal ve uluslararası etik hususları ve koşulları gözden geçirmek ve bunlara uymak. NOT: Bu protokolün tüm adımları aseptik koşullarda gerçekleştirilmelidir. Biyogüvenlik Seviye 2 uygulamaları RHE yetiştiriciliği için minimum gerekliliktir. Bu protokolde açıklanan kimyasallar/reaktifler ele alınırken gerekli tüm güvenlik önlemleri alınmalıdır.
1. Hücre kültürü medyasının hazırlanması
NOT: RHE'lerin yetiştirilmesinde kullanılan üç farklı serumsuz kültür ortamı vardır (Tablo 1): (i) NHEK'lerin2Dkültürü için kullanılan düşük kalsiyum seviyesine (60 μM Ca 2+ ) sahip bazal ortam; (ii) NHEK'lerin hücre kültürü kesici uç sistemine tohumlamada kullanılan yüksek kalsiyum seviyesine (1,5 mM Ca2+) sahip batık ortam; ve (iii) yüksek kalsiyum seviyesine (1,5 mM Ca2+), askorbik asit ve keratinosit büyüme faktörüne (KGF) sahip hava-sıvı arayüzü (ALI) ortamı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Orta</td>
			<td>Orta bilgi</td>
			<td>Gerekli miktar</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Bazal ortam</td>
			<td>Keratinosit büyüme ortamı</td>
			<td rowspan="3">36 mL/24 kuyular</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ % 1 [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ % 1 [v/v] 100x antibiyotik-antimycotic</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Batık ortam</td>
			<td>Keratinosit büyüme ortamı</td>
			<td rowspan="4">36 mL/24 kuyular</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ % 1 [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ % 1 [v/v] 100x antibiyotik-antimycotic</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Hava-sıvı arayüz ortamı</td>
			<td>Keratinosit büyüme ortamı</td>
			<td rowspan="6">216 mL/24 kuyu</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ % 1 [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ % 1 [v/v] 100x antibiyotik-antimycotic</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/mL askorbik asit</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/mL keratinosit büyüme faktörü</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. RhE'leri yetiştirmek için kullanılan farklı kültür ortamlarının özet tablosu. Takviyeleri ile farklı kültür medyası listesi.
<ol><li>Bazal ortamı hazırlayın.<ol>
<li>%0,2 [v/v] sığırın nihai konsantrasyonlarına ulaşmak için 500 mL keratinosit büyüme ortamı(Malzeme Tablosu)şişesini 5 mL insan keratinosit büyüme takviyeleri (HKGS) ile destekleyin hipofiz özü (BPE), 0.2 ng/mL insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF), 0.18 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL sığır transferin, ve 0.01 μg/mL rekombinant insan insülin benzeri büyüme faktörü-I (IGF-I).</li>
		<li>10.000 birim/mL penisilin, 10.000 μg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amphotericin B içeren 5 mL 100x antibiyotik-antimycotic çözeltisi ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Su altında kalan ortamı hazırlayın.<ol>
<li>%0,2 [v/v] BPE'lik nihai konsantrasyonlara ulaşmak için 500 mL keratinosit büyüme ortamı(Malzeme Tablosu)şişesini 5 mL HKGS ile tamamlayın, 0.2 ng/mL insan rekombinant EGF, 0.18 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL sığır transferrin ve 0.01 μg/mL insan rekombinant IGF-I.</li>
		<li>5 mL 100x antibiyotik-antimycotic çözelti ekleyin.</li>
		<li>1,5 mM Ca 2+ nihai konsantrasyona ulaşmak için0,144 M CaCl 2 (kalsiyum klorür) stok çözeltisinin5mL'lik bir kısmını ekleyin. NOT: Kalsiyum konsantrasyonu, keratinositlerin farklılaşmasını teşvik etmek ve tabakalaşma sürecini başlatmak için batık faz sırasında zaten artmıştır49.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hava sıvısı arabirimi (ALI) ortamını hazırlayın.<ol>
<li>%0,2 [v/v] BPE'lik nihai konsantrasyonlara ulaşmak için 5 mL HKGS ile 500 mL keratinosit büyüme ortamı(Malzeme Tablosu)bir şişe takviye, 0.2 ng/mL insan rekombinant EGF, 0.18 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL sığır transferrin ve 0.01 μg/mL insan rekombinant IGF-I.</li>
		<li>5 mL 100x antibiyotik-antimycotic çözelti ekleyin.</li>
		<li>1,5 mM Ca 2+ nihai konsantrasyona ulaşmak için0,144 M CaCl 2 stok çözeltisinin5mL'lik bir kısmını ekleyin.</li>
		<li>50 μg/mL askorbik asit nihai konsantrasyonuna ulaşmak için 25 mg/mL askorbik asit stok çözeltisinin 1 mL'lik kısmını ekleyin.</li>
		<li>10 ng/mL KGF'lik son konsantrasyona ulaşmak için fosfat tamponlu salin (PBS) stok çözeltisine %1 [w/v] sığır serum albüminine 100 μg/mL KGF'nin 50 μL'sini ekleyin. NOT: Askorbik asit oksidasyona duyarlı olduğundan, magnezyum l-askorbyl-2-fosfat59 veya L-askorbik asit 2-fosfat sesquimagnesium60gibi kararlı bir askorbik asit türevi kullanılması önerilir. Askorbik asit kullanılırsa, her yenilemeden önce ALI ortamını askorbik asitle tazelemeniz önerilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NHEK Kültürü
NOT: Birincil insan keratinositleri dördüncü veya beşinci pasajları61üzerinde proliferatif kaldığından, üçüncü pasajlarındaki NHEK'ler RHE'lerin yetiştirilmesi için kullanılır. Primer keratinositler yüksek hassasiyetleri nedeniyle çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Hücrelerin durumunu bozmamak için hücre süspansiyonlarının herhangi bir zamanda dikkatli ve yavaş pipetlemesi çok önemlidir.
<ol><li>Şişenin bir kısmını suya batırarak 37 °C'de bir su banyosunda 1 x 106 kriyoprezer korunmuş NHEKs ile bir şişeyi çözün. Şişeyi su banyosunda 1-2 dakika kuluçkaya yatırın, ta ki sadece küçük bir buz parçası görünene kadar. DİkKAT: Kirlenmeleri önlemek için şişenin tamamını su banyosuna batırmayın. Hücreleri 2 dakikadan fazla çözmeyin; bu hücre canlılığını azaltabilir. Tüpü laminar davlumbaz içine aktarmadan önce şişeyi% 70 etanol çözeltisi ile silin.</li>
	<li>Hücreleri 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile çok dikkatli bir şekilde yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonu, toplam 15 mL önceden ısıtılmış çözülme ortamı içeren iki T75 şişesine aktarın, böylece 6,7 x 104 hücre /cm2tohumlama yoğunluğu elde edilir. NOT: İlk iki pasaj ve kriyoprezite edilmiş NHEK'lerin çözülmesi için, tedarikçinin önerilerine göre hücre kültürü ortamı kullanılır.</li>
	<li>Şişeleri hücre kültürü inkübatörüne (37 °C, %5 CO 2 ve</li><li><li><li> </li></ol><img alt="Keratinosit farklılaşma süreç diyagramı, hava-sıvı arayüz yöntemi, insan epidermisi büyümesi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li></li><li> </li><li> </li><li><ol><li> </li></ol></li><li> <img alt="Statik dengeyi gösteren denklem, V2=C1*(V1/C2)-V1, devre analizinde anahtar." src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> </li><li> <img alt="Gerilim dönüşüm denklemi, V4=C3*(V3/C4), elektrik devresi formülü." src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><li> </li><li><li></ol>

Marc Eeman ve Benedetta Petracca, Dow Silicones Belgium'un çalışanlarıdır. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

RHE'ler farmasötik ve dermato-kozmetik alanlarında tarama aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır36,75,76,77,78. Birkaç şirket bu tür RHE'leri ticari olarak kullanılabilir hale getirmiş olsa da, maliyetli kalır ve yeni araştırma sorularını ele almak için gerektiği gibi yetiştirme parametrelerini değiştirme olasılığını sınırlar. Bu makale, şirket içi RHE'lerin üretim prosedürünü sağlam ve güvenilir bir şekilde açıklar ve modelin hayvan testlerine alternatif bir yaklaşım olarak alaka düzeyini doğrulamak için elde edilen dokuların ayrıntılı bir karakterizasyonunu sağlar.
Protokoldeki bazı adımlar, uygun keratinosit farklılaşması ve RhE tekrarlanabilirliğini sağlamak için çok önemlidir. Bu, en uygun hücreler, orta tipler ve yetiştirme koşulları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Önerilen RhE modelinde, yenidoğan NHEK'ler, yetişkin NHEK'lere kıyasla antijenik maruziyet eksikliği nedeniyle seçildi. Ayrıca, keratinositler türler arası değişkenliği önlemek için Kafkas etnik kökeni ile sınırlıydı. Birincil keratinositler genellikle ayırt etme ve tabakalama yetenekleri için kullanılır79. Ticari olarak veya yetişkin ciltlerinden kurum içi izolasyonla elde edilebilirler.80. Polikarbonat bir membran üzerinde bir hücre hattının (yani HaCaT) yetiştirilmesi, farklılaşmanın başarısız olduğunu göstermiş ve bariyer oluşumu için gerekli olan lipitleri sentezleme kapasitesinin bozulmuş olduğunu göstermiştir.81. Bununla birlikte, hidrojeller, kollajen, fibrin ve küresel kültürler gibi farklı kültür matrislerinin dahil edilmesi, 3D cilt modellerinin başarılı bir şekilde gelişmesine neden oldu.78,82,83,84,85,86. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, N/TERT, RHE'lerin geliştirilmesi için uygun olduğu gösterilmiştir.35. Birincil keratinositler dördüncü veya beşinci pasajlarında proliferatif kalır61bu nedenle, geçerli protokol keratinositlerin üçüncü pasajlarında kullanılmasını içerir. De Vuyst ve ark. hücre tohumlama yoğunluğunun önemli olduğunu ve yeterli olması gerektiğini göstermiştir (yani, ≥ 2.5x105 hücreler/cm2) bazolateral bölmedeki ortamın apikal bölmeye yayılmasına dikkat etmek için. Yetersiz tohumlama yoğunluğu (yani, < 2.5x105 hücreler/cm2) ortamın bazolateralden apikal bölmeye yayılmasıyla belirtilen uygun bir bariyerin oluşturulamamasına neden olabilir ve bu da ALI kültür koşulları yerine su altında kalmasına neden olabilir62. Serumsuz keratinosit büyüme ortamı (bkz. Malzeme Masası) kimyasal olarak tanımlanmış bir ortamla çalışma avantajı sunduğu ve kontaminasyon riskini azalttığı için tekrarlanabilirlik amacıyla tercih edildi. Bu ortam daha düşük kalsiyum konsantrasyonuna (yani 60 μM) sahiptir ve bu nedenle keratinositlerin çoğalmasını uyarır87. RhE ekiminin ilk adımından itibaren kalsiyum konsantrasyonunun (yani 1,5 mM) artırılması, keratinosit farklılaşması ve cilt bariyeri oluşumu ve homeostazını tercih eder49. Ek olarak, ALI ortamı, SC lipitlerinin oluşumu ve farklılaşmayı teşvik etmek için çok önemli olduğu gösterilen askorbik asit ile desteklenmiştir.52,53,54. ALI ortamı ayrıca, keratinosit transmembran reseptörlerine bağlanabilen fibroblastlar tarafından salgılanan bir büyüme faktörü olan kgf içerir ve aktivasyon üzerine farklılaşma ve yara onarımında çift role sahiptir.55,88. RHE'lere sürekli taze besin sağlamak için ALI ortamını belirli zaman aralıklarında yenilemek önemlidir. Taşıyıcı plaka sisteminin kullanımı, RhE yetiştiriciliği için daha büyük ölçekte (yani 24 kesici uç/ plaka) çok önemlidir. Zamandan tasarruf etme avantajı sunar, kontaminasyon riskini azaltır ve insan hatalarının ortaya konması için daha az yer bırakır. Ayrıca, RHE'leri yüksek miktarda medyada (yani 1,5 mL) kültürleme olanağı sağlar ve bu da gerekli ALI ortam yenileme sayısını azaltır. Ek olarak, tam bir plaka kesici ucu taze ortama sahip bir tabağa aktarma imkanı sunarak kesici uçlarla tek tek temastan kaçınır veya plaka kapağını ortaya çıkarır.
RhE modelinin belirtilmesi gereken birkaç sınırlaması vardır. Yerli insan derisinde bazal tabakadaki keratinositlerin çoğalması ile SC'deki korneositlerin kopması (yani, desquamasyon) arasında bir denge vardır.89. Ancak, in vitro, desquamation gerçekleşmez. Bu nedenle, korneositler RhE'ye bağlı kalır ve fizyolojik olarak daha az alakalı kalın bir SC oluşturur. Bu nedenle, RHE'lerin sınırlı bir ekim süresi vardır. Ayrıca, bu RhE modeli basit ve basittir, çünkü tekil bir hücre tipinden, yani epidermisin en bol hücre türü olan keratinositten oluşur. Bununla birlikte, epidermisin içinde melanositler, dendritik hücreler (örneğin Langerhans hücreleri), T hücreleri (örneğin, CD8) gibi başka hücre tipleri de vardır.+ hücreler) ve Merkel hücreleri13. Cilt modelinin fizyolojik alaka düzeyini artırmak için araştırmacılar melanositler ekleyerek cilt modellerini daha karmaşık hale getirmişlerdir.38 , bağışıklık hücreleri39veya hasta türevi hücreler90. İnsan derisi modellerinin bariyer özelliklerinin, özellikle farklı bir SC lipid bileşimi ve daha yüksek bariyer geçirgenliği nedeniyle, yerli insan cildine kıyasla farklı olduğunu akılda tutmak gerekir. 91,92,93,94,95. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar hipoksi altında ekim yoluyla insan derisi modellerinin bariyer özelliklerinde değişiklikler bildirmektedir.96 veya bağıl nemin azalması97, dermal matrisin chitosan ile modülasyonu98ve kültür ortamında serbest yağ asitlerinde değişiklik99. Ayrıca, hem basit hem de daha karmaşık RHE'lerde, kültür koşulları ve orta kompozisyon patolojik özellikleri taklit etmek için modüle edilebilir. Modele sitokinlerle meydan okuyarak, anormal bir morfoloji100 ve tipik olarak atopik dermatit ve sedef hastalığı gibi yaygın cilt bozukluklarında gözlenen gen ve protein ekspresyon düzeylerinde değişiklikler tespit edilebilir.35,101,102,103,104,105. 3D modelin rekonsiyel sürecini başlatmadan önce keratinositlerdeki spesifik genlerin susturulması, cilt bozukluklarının özelliklerini taklit etmek ve yeni terapötik çözümleri araştırmak için kullanılan bir başka yaklaşımdır.106,107. Sadece epidermal bir tabakayı modellemenin yanı sıra, RhE rekonsesi öncesinde fibroblastlar bir kollajen matrisine katıştırılarak modele bir dermal bölme (yani, insan derisi eşdeğerleri veya tam kalınlıklı modeller olarak adlandırılır) dahil edilebilir, bu da onu fizyolojik olarak daha alakalı ve yaşlanma ve yara iyileşmesi ile ilgili çalışmalar için uygun hale getirir.108,109,110. Ek olarak, melanom ilerlemesini incelemek için insan derisi eşdeğerlerine tümör sferoidleri eklenmiştir.111,112. Cilt modelleri alanındaki en son gelişmeler biyo-baskı ve çip üzerinde cilttir. Son zamanlarda (perfusable) biyo-baskılı cilt eşdeğerlerinin geliştirilmesinde birden fazla araştırma grubu başarılı oldu45,113,114. Önerilen protokol, 24 kuyulu bir formattan ve bir taşıyıcı plakadan yararlanarak, kesici uçların ayrı ayrı işlenmesini önler. Bununla birlikte, çalışma ölçeği hala oldukça sınırlıdır ve otomasyondan yoksundur. Biyo-baskı veya çip üzerinde cilt kullanımı uygulanarak, daha küçük cilt modelleri daha otomatik süreçlerle ve daha büyük ölçekte kullanılabilir.
Bu protokolde açıklanan RhE, zaten geliştirilmiş ve iyi karakterize edilmiş ticari epidermal modellere birden fazla benzerlik sürmüştir. Morfolojik analiz, önerilen RhE modelinde uygulanabilir katmanların sayısının yerli insan derisine kıyasla daha düşük olmasına rağmen (yani, 7-14'e kıyasla 6-7), EpiDerm RhE modelinin (yani 8-12)70ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir. EpiDerm, EpiSkin ve SkinEthic modellerine benzer şekilde, üst RhE katmanı yoğun paketlenmiş korneosit katmanlarının sepet örgü desenini gösterir28. Ayrıca, TEM analizi, önerilen RhE modelinde (yani 15-25) SC katmanlarının sayısının EpiDerm (yani 16-25)70ile karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koydu. Genel olarak, önerilen RhE modeli, yerli insan epidermisini taklit eden diğer ticarileştirilmiş epidermal modellerle benzer bir yapı göstermektedir. TEER tarafından ölçülen doku bütünlüğü ticari RhE modelleri (yani, 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73ve diğer şirket içi RhE'ler (yani, yaklaşık 5000 Ω.cm2)74,115ile arasındadır. Önerilen RhE modeli, farklılaşma ve doku yapışma belirteçlerinin varlığı ve doğru lokalizasyonu ile belirtildiği gibi iyi ayırt edildiğini göstermektedir. Ayrıca, önerilen RhE modeli proinflamatuar uyaranlara (lps ve TNF-α) duyarlı olduğunu göstermektedir.
Sonuç olarak, mevcut protokol, hem akademik hem de özel kurumlardaki araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için RHE'lerin güvenilir bir şekilde ve nispeten büyük ölçekte nasıl üretılacağını göstermektedir. Önerilen RhE modeli, mevcut diğer ticari modellere benzer morfolojiye, epidermal farklılaşmaya ve biyolojik yanıt vermeye sahip olduğunu göstermektedir. İlgili bir cilt modeline erişim gerektiğinde hem farmasötik hem de dermato-kozmetik alanı için alternatif bir araç sağlar.

Epidermis, insan vücudu ve dış ortam arasındaki doğrudan arayüzde cildin en dış tabakasıdır. Ana işlevleri koruma ve hidrasyon sağlamaktır1. Epidermis, dış ajanlara karşı etkili bir fiziksel bariyer görevi görür ve vücuttan aşırı su kaybını önler. Bu cilt fonksiyonları esas olarak cildin en dış katmanlarındaki hücresel düzenlemeye, hücreler arası lipitlerin bileşimine ve organizasyonuna bağlıdır2. Epidermis öncelikle dokunun dış tarafına doğru göç eden ve farklılaşmaya uğrayan keratinositlerden oluşur. Farklılaşma evreleri ile karakterize edilen 4-5 epidermal tabaka vardır. İçeriden dışarıya, epidermal tabakalar canlı epidermisin, yani stratum bazale (SB), stratum spinosum (SS) ve stratum granülosyumdan (SG) başlayarak, canlı olmayan en üst katmana, yani stratum korneum (SC)3'ekadar başlar. Bazal tabaka esas olarak çoğalan keratin ile zenginleştirilmiş keratinositlerden oluşur, bu da farklılaşma üzerine SS yoluyla göç eder4. Keratinosit olgunlaşması sırasında protein ekspresyasyonunda ve yapısında çeşitli değişiklikler meydana gelir. Keratinositler desmosomal kavşakların oluşumuna yapışır5. SG'de, lameller gövdelerin üretimi başlatılır. Cilt bariyeri fonksiyonunun oluşumu için çok önemli olan lipid öncülleri ve enzimlerden oluşurlar6. SG ayrıca keratinositlerin sitoplazmasında keratohyalin granüllerinin varlığı ile karakterizedir. SC ile arayüzde, lamel gövdelerinin içeriği hücreler arası alanlara ekstrüde edilir ve seramidler, kolesterol ve serbest yağ asitleri gibi polar olmayan lipitler hücre dışı lipid matrisini oluşturmak için istiflenmiş lameller lipid bilayerlerine düzenlenir7. SC'de hücreler, enzymatic bozulma süreçleri nedeniyle çekirdek de dahil olmak üzere tüm hücresel organelleri kaybeder ve düzleştirilmiş bir morfoloji benimser. Çapraz bağlı protein katmanlarından yapılmış cornified bir zarf ile çevrilidirler ve korneositler8,9olarak adlandırılırlar. Desmosomal bileşenler korneodezmozom oluşturmak ve korneositleri birbirine bağlamak için kornealanmış zarfa çapraz bağlanır. Elde edilen epitel, yaklaşık 5-6 haftalık bir devir süresi ile kök hücrelerden sürekli olarak yenilenir10. Tamamen tabakalı bir epidermis ile sonuçlanan keratinositlerin farklılaşma süreci, cildin bariyer fonksiyonunun oluşumu için çok önemlidir11.
Yaralanma ve iltihaplanma sırasında keratinositler yapışma moleküllerinde ve yüzey reseptörlerinde değişikliklere neden olur ve sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptitlerin salgılanması yoluyla proinflamatuar yanıtları tetikler12. Cilt sadece eksojen maddelere karşı fiziksel bir bariyer değildir; patojenlere maruz kalındıktan sonra bağışıklık sensörü görevi de görür. Ek olarak, insan vücudunu dehidrasyondan korumak için su içeriği gibi katmanları boyunca birkaç maddenin difüzyonunu düzenler. Cilt ayrıca D vitamini sentezinde yer alır ve diğer çeşitli metabolik fonksiyonlara sahiptir3,13,14.
Eksojen maddelerin olumsuz etkilerini değerlendirmek için, toksikologlar onlarca yıldır hayvan testlerine güvenmektedir, ancak günümüzde tercih edilen yaklaşım değildir. İnsan toksisitesi için sınırlı tahmin kapasitesine sahip olmasının yanı sıra, hayvan modelleri çok sayıda etik sorun içerir. Kozmetik endüstrisinde hayvan testlerinin yasaklanması ve araştırmalarda 3R prensibine (yani Değiştirme, Azaltma ve Arıtma) uyulması önerisi, in vitro yaklaşımlara dayalı alternatif test yöntemlerinin geliştirilmesine yolaçmıştır 15. İlk in vitro cilt hücresi modelleri zaten 90'larda tanımlanmıştır ve basit insan keratinosit mono kültürlerinden tamamen farklılaştırılmış epidermis ve tam kalınlıklı modellere kadar etkileyici bir gelişme elde edilmiştir16. Günümüzde cilt dokusu mühendisliği hem farmasötik hem de dermato-kozmetik alanlarında önem kazanmıştır. Son yirmi yılda, birkaç şirket ciltle ilgili çalışmalar için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir araçları temsil eden üç boyutlu (3D) yeniden yapılandırılmış insan epidermisini (RhE) ticarileştirdi. Cilt tahrişi17 , 18(yani test kılavuzu 439 19) ve cilt korozyonu 20 (yani test kılavuzu431 21)test etmek için OECD yönergelerine göre kimyasalların in vitro cilt testi için çeşitli ticari RhE modelleri kabuledilmektedir. Cilt duyarlılığı22 için in vitro testi (yani, SENS-IS testi) şu anda onay yolunda ve hakem incelemesi altında23. Ayrıca, ticari RhE modellerini kullanan çok sayıda başka tahlil de vardır, fototoksikliği değerlendirmek için24, ilaç formülasyonlarını test etmek için25, kozmetik formülasyonlar ve aktif bileşenler26, cilt bariyeri fonksiyonu27'yi incelemek ve çevresel stresörlere biyolojik yanıtı test etmek için28,29,30,31.
Ticari olarak mevcut 3D cilt modellerine ek olarak, birden fazla araştırma grubu kendi RhE32 , 33,34,35,36,37. Şirket içi RHE'ler, çalışmanın amacına göre kültür koşullarını kontrol etme avantajı sunar. Özellikle, araştırmacılar 3D epidermal modellerinin (yani, birincil ve ölümsüzleştirilmiş, yenidoğan vs. yaşlı, tek ve havuza edilmiş rastgele donörler, cinsiyet, etnik köken, sigara gibi bireysel yaşam alışkanlıkları vb.) yeniden uzlaştırılmasında kullanılacak keratinositlerin türünü ve kaynağını seçebilirler. Kültür ortamının bileşimini değiştirme ve hedef proteinlerin veya lipitlerin ekspresyonunu modüle edebilecek büyüme faktörleri, vitaminler veya diğer bileşikleri içerme olasılığına sahiptirler. Şirket içi RHE'ler ile araştırmacılar, 3D modelin farklılaşma durumunun bir işlevi olarak biyolojik yanıtları ve biyomekanik özellikleri de araştırabilirler. Bu sezgisel parametrelere ek olarak, 3D cilt modellerinin karmaşıklığını artırmak ve fizyolojik olarak daha alakalı hale getirmek için sürekli çabalar vardır, örneğin, diğer epidermal hücre tiplerini (örneğin melanositler ve bağışıklık hücreleri)ekleyerek 38,39, fibroblast nüfuslu bir kollajen matrisinin üzerine keratinositleri kült ederek 40,41,42ve vasküler ağın bileşenlerini dahil ederek43,44,45.
Kültür koşullarını belirli ihtiyaçlara göre ayarlamak mümkün olsa da, bir RhE'nin hem kalitesini hem de alaka düzeyini garanti etmek için saygı duyulan parametreler vardır. RhE dokularını yetiştirmek için, normal insan epidermal keratinositleri (NHEK'ler), gözenekli sentetik zarı kuyuları iki bölmeye, yani apikal ve bazolateral bölmeye ayıran belirli geçirgen kültür kesici uçlarına tohumlanır. Zarın gözenekliliği (yani, 0,4 μm'lik bir gözenek büyüklüğü), hücrelerin bazal kesici uç tarafına geçişi olmayan apikal bölmede bir hücre monolayerinin oluşumuna ve keratinositlerin bazolateral bölmede bulunan kültür ortamından temel besinlerle beslenmesine izin verir. Yeniden yapılanma sürecinin başlangıcında, NHEK'ler zara yapışmalarına izin vermek için birkaç gün boyunca su altında kalırlar. Her iki bölmedeki kalsiyum seviyesi, hücrelerin çoğalmasını yavaşlatmak ve bunun yerine farklılaşmalarını teşvik etmek için NHEK'lerin 2D kültürü için kullanılan kalsiyum konsantrasyonuna kıyasla artar46. Bariyer oluşumunu ve homeostazı düzenlemek için epidermal kalsiyum gradyanı gereklidir47,48. Yüksek kalsiyum seviyeleri (yani 1,5 mM'ye kadar) hücreler arası kavşakların oluşumunu teşvik eder ve terminal farklılaşması sırasında kornişli zarfın oluşumunu modüleeder 49. Keratinositler destekleyici membran üzerinde sürekli ve sıkı yapışan bir monolayer oluşturduktan sonra, apikal bölmeden ortam çıkarılır ve tabakalaşmayı uyarmak ve epidermal bariyer oluşturmak için hava sıvısı arayüzünde (ALI) kültür süreci devam eder50,51. Tamamen katmanlı bir epitel elde etmek için özel kültür koşulları çok önemlidir36. ALI'deki rekonstrüt işlemi sırasında, bazolateral bölmedeki ortam keratinosit büyüme faktörü (KGF), insülin, kalsiyum ve askorbik asit ile desteklenir. Askorbik asit, yerli insan derisininkine çok benzeyen uygun bir SC lipid bariyerinin oluşumunda önemli bir rol oynar52. Askorbik asit takviyeli ortamda yetişen keratinositler, korneositlerin interstiklerinde organize hücrelerarası lipid lamellerin yanı sıra gelişmiş sayıda keratohyalin granülleri ile farklılaştırılmış bir fenotip göstermektedir52. Bu takviye, cornified zarf içeriğini artırarak ve hidrofilik antioksidan depolarının tükenmesini önleyerek epidermal bariyer fonksiyonunu iyileştirmek için gereklidir53,54. Epidermal çoğalma ve farklılaşmanın önemli bir parakrin arabulucusunun kısaltması olan KGF, NHEKs55'iuyarmak için kullanılır.
Şirket içi RHE'lerin başlıca dezavantajları arasında araştırma kurumları arasındaki standardizasyon kaybı ve artan işgücü yoğunluğu ve zaman tüketimi (kullanıma hazır ticari modellere kıyasla 3 haftaya kadar) sayıldı. Mevcut makalenin amacı, bu dezavantajları gidermek ve üretimin temelini daha büyük ölçekte belirlemektir. Mevcut protokol, şirket içi RHE'lerin yukarıda belirtilen avantajlarına ek olarak, dokular arasındaki iç ve değişkenliği azaltmayı, kontaminasyon risklerini azaltmayı ve ekim sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Mevcut protokol, yenidoğan NHEK'leri kullanarak RHE'leri yetiştirmek için tekrarlanabilir ve sağlam bir yöntem açıklar. Ayrıca, RhEs morfolojisinin karakterizasyonu, bariyer bütünlüğü ve epidermal farklılaşmaya özgü proteinlerin ekspresyonunun temsili sonuçlarını gösterir. RhEs morfolojik yapısı hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak incelendi. Bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için transepidermal elektrik direnci (TEER) ve doku canlılığının %50'sini (ET 50) azaltmak için TritonX-100'emaruz kalma süresi ölçüldü. Keratinosit yapışmasını değerlendirmek için desmozomal kavşakların oluşumu (yani desmoglein 1) immünofluoresans (IF) ile analiz edildi. Epidermal yapısal proteinlerin (yani involükrin, lorikrin ve filaggrin) oluşumu IF ile değerlendirildi ve tespit edildi. Bu proteinler SC korneositlerini çevreleyen yüksek çapraz bağlı protein zarfının oluşumunda rol oynar ve sonuç olarak geç evre epidermal farklılaşma için önemli belirteçlerdir56,57. Ek olarak, IF, SS58'deki erken evre farklılaştırılmış hücrelerde indüklenen ve tüm farklılaştırılmış katmanların içinde bulunan bir protein olan keratin 10'u analiz etmek için kullanıldı. Son olarak, RhE'nin proinflamatuar uyaranlara (yani lipopolisakkarit ve tümör nekroz faktörü alfa) yanıtı araştırıldı. Hücre kültürü medyasında interlökin 1 alfa (IL-1α) ve interlökin 8 (IL-8) düzeyleri enzime bağlı immünorbent tahlilleri (ELISA) kullanılarak ölçüldü.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Eozin çözeltisini 100 mL'de 1 mL asetik asit ile asitleştirin.</td></tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Sulu Eozin Y çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110280</td><td>Eosin çözeltisini 100 mL'de 1 mL asetik asit ile asitleştirin.</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich veya Merck</td><td>C8106 veya 1.02378.0500</td><td>0.144 M'lik bir stok çözeltisi hazırlayın, süzün, sterilize edin ve alikotları -20 ° C'de saklayın; Her 6 ayda bir yeni alikotlar hazırlanması tavsiye edilir.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>100 &mu'da bir stok hazırlayın; g / mL ve -20 ° C'de saklayın & C. Çalışma koşulu 1 &mu'dur; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Entellan montaj ortamı</td><td>Merck</td><td>1.07960.0500</td><td>H & için montaj ortamı E boyama.</td></tr><tr><td>EpiLife ortamı (keratinosit büyüme ortamı olarak adlandırılır)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>MEPI500CA</td><td>0.06 mM Ca2+ içerir.</td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalin %10</td> <td>Leica Biosystems</td><td>3800770</td><td></td></tr><tr><td>İnsan keratinositleri büyüme takviyesi (HKGS) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>S0015</td><td>%0,2 [h/h] BPE, 0,2 ng/mL insan rekombinant EGF, 0,18 & mu; g / mL hidrokortizon, 5 & mu; g / mL sığır transferrini ve 0.01 & mikro; g / mL insan rekombinant insülin benzeri büyüme faktörü-I.</td></tr><tr><td>İzopropanol Biosolve</td><td>Bv</td><td>0016264102BS</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser'in gliserol jelatini, fenol içermeyen</td><td>Merck</td><td>1.08635.0100</td><td>IF boyama için montaj ortamı.</td></tr><tr><td>Keratinosit büyüme faktörü (KGF)Ar-Ge</td><td> D Systems</td><td>251-KG-050</td><td>KGF proteinini 100 & mu'da sulandırır; PBS'de steril% 0.1 [a / h] BSA'da g / mL. Alikotları hazırlayın ve -20°C.&nbsp'de saklayın.</td></tr><tr><td>Laktat dehidrojenaz (LDH) tahlil kiti</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>25 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlayın, filtreleyin, sterilize edin ve alikotları -20 ° C'de saklayın. Her 6 ayda bir yeni alikotlar hazırlanması tavsiye edilir. Karanlıkta saklayın.</td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit (LPS), E.coli suşu O55: B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4524</td><td>Steril PBS'de 1 mg / mL'lik bir stok hazırlayın ve alikotları -20 ° C'de saklayın Çalışma konsantrasyonu 100 & mu'dur; g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mayer' s Hematoksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS80</td><td></td></tr><tr><td>Normal insan epidermal keratinositleri (NHEK'ler)</td> <td>Lonza</td><td>00192906</td><td>Yenidoğan sünnet derisinden izole edilen, en az üç donörden toplanan insan primer keratinositleri.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010056 veya 10010-015</td><td>Referans numaraları ülkeler arasında farklılık gösterebilir.</td></tr><tr><td>Rekombinant tümör nekroz faktörü alfa (TNF-&alfa;)</td><td>ImmunoTools</td><td>11344483</td><td>100 &mu'luk bir stok hazırlayın; steril ultra saf suda g / mL. Çalışma konsantrasyonu 40 ng/mL'dir</td></tr><tr><td>Steril ultra saf su</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td>N/A Tiazolil</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>Steril PBS'de 5 mg/mL MTT stoğu hazırlayın. Çalışma konsantrasyonu 1 mg / mL'dir.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi (%0,4 [h/h])</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA (%0,05 [h/h])Thermo</td> <td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>Ab150113</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodyum sitrat dihidrat</td><td>Merck</td><td>1.06448.0500</td><td>IF boyama için antijen alma tamponu için.</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (Dylight 488)</td><td>Agrisera</td><td>AS09 633</td><td></td></tr><tr><td>Filaggrin Fare antikoru</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-53243</td><td></td></tr><tr><td>Involucrin Tavşan antikoru</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-33742</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 10 Fare antikoru</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-32962</td><td></td></tr><tr><td>Desmoglein-1 Fare antikoru&nbsp;</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>MAB944</td><td></td></tr><tr><td>Loricrin Tavşan antikoru</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP1-33610</td><td></td></tr></tbody></table>

büyük Ölçekte Üç boyutlu yeniden yapılandırılmış İnsan epidermisi yetiştirmek

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Yenidoğan primer keratinositlerden yeniden yapılanan üç boyutlu bir insan epidermis modeli sunulmaktadır. Burada, yetiştirme süreci ve modelin karakterizasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Yenidoğan primer keratinositler geçirgen polikarbonat kesici uçlara batırılmış olarak yetiştirilir ve tohumlamadan üç gün sonra hava sıvısı arayüzüne kaldırılır. Yüksek kalsiyum kültürü ortamında tanımlanmış büyüme faktörleri ve askorbik asit ile on dört günlük stimülasyondan sonra model tamamen farklılaştırilir. Histolojik analiz, yerli insan derisinin morfolojisini taklit eden tamamen tabakalı bir epidermis ortaya çıkardı. Modeli ve bariyer fonksiyonlarını karakterize etmek için, erken evre keratinosit farklılaşmasına özgü protein seviyeleri ve lokalizasyon (yani keratin 10), geç evre farklılaşması (yani, involükrin, lorikrin ve filaggrin) ve doku yapışması (yani, desmoglein 1), immünofluorescence ile değerlendirildi. Doku bariyeri bütünlüğü transepithelial elektrik direnci ölçülerek daha da değerlendirildi. Rekonar insan epidermisi proinflamatuar uyaranlara (yani lipopolisakkarit ve tümör nekroz faktör alfa) yanıt verdi ve sitokin salınımını artırdı (yani, interlökin 1 alfa ve interlökin 8). Bu protokol, çevresel etkileri ve ciltle ilgili çok çeşitli çalışmaları değerlendirmek için bir araç olarak yeniden yapılandırılmış insan epidermisini yetiştirmek için basit ve tekrarlanabilir bir in vitro yöntemi temsil eder.

2D kültürlü NHEK'ler, tutarlı bir çokgen şekle sahip geleneksel bir morfoloji görüntüler (Şekil 2A). Yukarıda açıklandığı gibi, NHEK'ler yaklaşık% 80'lik bir izdiah süresine ulaştıktan sonra kültür kesici uçlarına tohumlanır. RHE'lerin morfolojisi H&amp;E boyama ve TEM kullanılarak analiz edildi. ALI'de 15 gün sonra, dört ana epidermal katmanında belirtildiği gibi tamamen katmanlı bir doku elde edilir: SB, SS, SG ve SC (Şekil 2B). SB katmanında, hücreler sütunlu bir şekle sahiptir. İkinci katmandan RhE'nin üst katmanlarına doğru, NHEK'ler hücre morfolojislerindeki değişikliklerle gözlendiği gibi farklılaşmaz (SB katmanındaki sütunlu bir şekilden, SS katmanındaki dikenli bir şekle doğru). SG tabakasında, hücreler daha düz bir şekle sahiptir ve sitoplazmda mor noktalar olarak temsil edilen keratohyalin granüllerini (KG) görüntüler. Karakteristik yuvarlak ve yıldız şekilleri H&amp;E görüntüsündeki beyaz oklarla vurgulanır (Şekil 2C). SC'deki hücreler, ölümcül olarak farklılaştırılmıştır ve tamamen düzleştirilmiştir ve bir hücre çekirdeğinden yoksundur. Katmanlı RHE'ler genel kalınlık 84.3 ± 2.4 μm ve SC'leri 19.6 ± 3.2 μm kalınlıklara sahiptir (Şekil 2D). Bu değerler, yerli insan derisi için bildirilenlerle karşılaştırılabilir, yani sırasıyla 60-120 μm ve 10-20 μm,sırasıyla 69. Uygulanabilir katmanların sayısı 6-7'dir, bu da yerli insan derisine kıyasla daha düşüktür, yaklaşık 7-1470. RHE'lerin rekonstrüksiyon protokolünde farklı zaman noktalarında (yani 7, 10, 13 ve 15 gün) ultrayapısal analizi, RHE'lerin zaman içinde artan korneosit katmanları ile kornifikasyon sürecini ortaya koymaktadır(Şekil 2E). ALI'de 15 gün sonra, RhE dokusunun SC'si yaklaşık 15-25 katmandan oluşur, bu da yerli insan derisi için bildirilen değerle karşılaştırılabilir (yani, 15-20 katman)69.
<img alt="Deri tabakalarının histolojisi ve hücre büyümesi; Kalınlık analizi için mikroskopi görüntüleri ve çubuk grafik içerir." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: Primer keratinositler ve yeniden yapılandırılmış insan epidermisi. (A) Kesici uçlara tohumlamadan önce birincil keratinositlerin faz kontrastlı mikroskopi görüntüsü. Ölçek çubuğu 50 μm. (B-C) RhE'nin H&amp;E parlak alan mikroskopi görüntüsüdür. Ölçek çubuğu 50 μm (B) ve 25 μm (C' dir. (D) RhE ve SC kalınlığının nicelemesi (ortalama ± SEM, n=3). (E) ALI'de 7, 10, 13 ve 15 gün sonra RhE kesitlerinin iletim elektron mikroskopi görüntüleri. Ölçek çubuğu 4 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Farklılaşma evrelerine göre 3D olarak büyüyen NHEK'ler farklılaşma evrelerine göre farklı protein ekspresyon profilleri gösterirler. RHE'lerde erken evre keratinosit farklılaşmasına (yani keratin 10), geç evre keratinosit farklılaşmasına (yani involükrin, lorikrin ve filaggrin) ve keratinosit yapışmasına (yani desmoglein 1) özgü proteinlerin ekspresyonu IF boyama kullanılarak belirlendi. İnvolucrin ekspresyasyonu, farklılaşma işlemi sırasında daha önce başlatıldığı için SG katmanında daha ağırlıklı olarak bulunur (Şekil 3D), filaggrin ve lorikrin ise üst katmanlarda ifade edilir (Şekil 3B-C). Keratin 10 ifadesi, SB katmanı hariç tüm uygulanabilir katmanlarda bulunmuştur (Şekil 3E). RHE'ler, desmoglein 1'in uygulanabilir epidermal katmanların hücreler arası boşluğunda ifade edildiği gibi fonksiyonel desmozomal birleşimleri görüntüler (Şekil 3F). Sonuç olarak, beş belirteç de ifade edilir ve uygun epidermal katmanlarda bulunur ve sağlıklı bir epidermal farklılaşma sürecine çevrilir.
<img alt="Epidermal deri tabakalarının histolojisi ve immünofloresan mikroskobu; H&amp;E ve protein belirteçleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: Yeniden yapılandırılmış insanepidermisinin epidermal farklılaşması, doku yapışması ve doku bütünlüğü. (A) RhE'nin H&amp;E parlak alan mikroskopi görüntüsü. Konfokal floresan mikroskopi görüntüleri (B) filaggrin (FLG), (C) loricrin (LOR), (D) involucrin (INV), (E) keratin 10 (K10) ve (F) desmoglein 1 (DSG-1) macenta temsil edilir. Çekirdek lekesi (DAPI) mavi ile temsil edilir. Ölçek çubuğu 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
RhE modelinin bariyer özellikleri hem doku canlılığı hem de bütünlüğü değerlendirilerek araştırılmıştır. Doku bütünlüğü 15 gün sonra teer bir voltohmmetre kullanılarak ölçülerek belirlendi. RHE'ler için kaydedilen 2567 ± 415 Ω.cm2 değerleri sürekli bir bariyer oluşumunu çevirir (Şekil 4A). Bu değerler RhE modelleri71 , 72 , 73,74için bildirilenlerle aynı aralıktadır. Ek olarak, sitotoksik referans kimyasalı (yani Triton X-100) doku canlılığını % 50 (ET50)azaltmak için gerekli maruz kalma süresi tiazolyl mavi tetrazolium bromür (MTT) tahlili ile belirlendi. RhE için ölçülen ET50 değeri 2,1 saatti. Bu değer, tahriş sınıflandırmasının güvenilir tahmini için nitelikli diğer 3D epidermal modellerin kabul aralığına girer (OECD Kılavuzu 439)19.
<img alt="Maruz kalma süresine karşı doku direncini ve canlılığını gösteren kutu grafiği ve çizgi grafiği; ET50=2.1 saat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Şekil 4: Yeniden inşa edilen insan epidermisinin bariyer özellikleri. (A) Transepithelial elektrik direnci ile ölçülen doku bütünlüğü (ortalama ± SEM, n=6). (B) ET50, %1 Triton X-100'ün 78,3 μL'sine (ortalama ± SEM, n=3) topikal maruziyet üzerine doku canlılığının ölçülmesine (yani MTT tahlili) göre belirlenir.
RhE'lerin duyarlılığı bilinen proinflamatuar uyaranlar üzerine araştırıldı. RHE'ler, bazolateral bölmenin ortasına 100 μg/mL Escherichia coli lipopolisakkarit (LPS) ve 40 ng/mL tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) kullanılarak sistemik olarak tedavi edildi. 24 saatlik uyaranlardan sonra hücre kültürü ortamı toplandı. Sitotoksiklik bir laktat dehidrogenaz (LDH) tahlili kullanılarak ölçüldü ve bilinen bir membran bozucu olan Triton X-100 deterjanının değerleriyle karşılaştırıldı (Şekil 5). Triton X-100 ile tedavi edilen RHE'lerdeki LDH aktivitesinde önemli bir artış (p &lt; 0.05, tek yönlü ANOVA, Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi) gösterildi. LPS ve TNF-α tedavilerinin her ikisi de sitotoksik olmadığını göstermiştir.
<img alt="LDH aktivite çubuk grafiği; TX-100, LPS, TNF-α karşılaştırması; enzim tahlil sonuçları; İstatistiksel analiz." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Şekil 5: Laktat dehidrogenaz (LDH) tahlili ile ölçülen sitotoksiklik. Veriler kontrol etmek için göreli değerler, tedavi edilmemiş dokular (CTRL); ortalama ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Önem, Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi olan tek yönlü ANOVA ile test edildi. Yıldız işareti, CTRL, **p &lt; 0,0001) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
RhE ortamında interlökin 1 alfa (IL-1α) ve interlökin 8 (IL-8) salınımı ELISA'lar kullanılarak ölçüldü. Şekil 6, RHE'ler tarafından LPS ve TNF-α ile meydan okuma üzerine hem nicel hem de göreceli IL-1α ve IL-8 sürümünü göstermektedir. LPS tedavisi istatistiksel olarak anlamlı (p &lt; 0.05, eşleşmemiş Öğrenci T testi) IL-8 (9.6 ± 1.0 kat artış) ve IL-1α (2.7 ± 1.3 kat artış) indüklenmiş bir serbest bırakma ile sonuçlandı. TNF-α, IL-8 seviyelerinde artış eğilimi gözlenmesine rağmen (2,3 ± 0,8 kat artış) IL-8 salınımını önemli ölçüde teşvik etmedi. Bununla birlikte, TNF-α önemli ölçüde (p &lt; 0.05, eşleşmemiş Öğrenci T testi) IL-1α salınımını tetikledi (1.8 ± 0.5 kat artış).
<img alt="IL-8, IL-1α ekspresyon seviyelerinin çubuk grafik karşılaştırması; LPS, TNF-α etkileri; İstatistiksel analiz." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Şekil 6: Yeniden inşa edilen insan epiderminde proinflamatuar yanıtlar. LPS (A) ve TNF-α (B) ile 24 saatlik bir mücadele üzerine RhE tarafından IL-8 sürümükonsantrasyonları. Veriler ortalama ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α) olarak temsil edilir. (C) Veriler, kontrol, tedavi edilmemiş dokular (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α) ile karşılaştırıldığında göreli değerin ortalaması olarak temsil edilir. LPS (D) ve TNF-α (E) ile 24 saatlik bir meydan okuma üzerine RhE'nin IL-1α salınımınınkonsantrasyonu. Veriler ortalama ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α) olarak temsil edilir. (F) Veriler, CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α) ile karşılaştırıldığında göreli değer ortalaması olarak temsil edilir. Önemi, eşleşmeyen bir Öğrencinin T testi ile test edildi. Yıldız işareti, CTRL, *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,0001) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, üç boyutlu yeniden oluşturulmuş insan epidermisini tekrarlanabilir ve sağlam bir şekilde yetiştirmek için basit bir yöntemi açıklar. Ek olarak, epidermal bariyer modelinin yapı-işlev ilişkisini karakterize eder. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin proinflamatuar uyaranlar üzerine biyolojik tepkileri de sunulmaktadır.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

İn vitro veya inşa edilmiş insan epidermis modeli ilk olarak doksanlı yıllarda hayvan deneylerine alternatif test yöntemleri geliştirmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu 3D epidermal modeller artık kozmetik bileşenlerin hem güvenliğini hem de etkinliğini test etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Birkaç doku tedarikçisinden satın alınabilirken, bir laboratuvarda 3D modeli yeniden inşa edebilmek, ilginin son noktasına daha fazla esneklik sağlar.3D epidermal modelin yeniden yapılanma protokolünü kısaca açıklayan birkaç araştırma makalesi vardır, ancak bugüne kadar yeniden yapılanma sürecinin kritik adımlarını gösteren bir video yoktu. Bu video makalenin yayımlanmasının arkasındaki neden budur. Kurum içinde yeniden inşa edilmiş insan epidermisinin hazırlanması, kültür ortam bileşimindeki değişiklikler, pro-enflamatuar veya oksidatif stres tetikleyicileri, ilgi genlerinin susturülmesi ve belirli biyolojik süreçlerin inhibisyonu veya uyarılması gibi kültleşme sürecinde çok fazla özgürlüğe izin verir.Başlamak için, şişenin bir kısmını suya batırarak 37 santigrat derecede bir su banyosunda 1 milyon kriyo ile korunmuş normal insan epidermal keratinositleri veya NHEK'ler içeren bir şişeyi çözün. Şişeyi su banyosunda bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın, ta ki sadece küçük bir buz parçası görünene kadar. hücreleri iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyarak çok dikkatli bir şekilde yeniden biriktirin.Hücre süspansiyonu, önceden uyarılmış toplam 15 mililitrelik çözülme ortamı içeren iki T75 şişesine aktarın, bu da santimetrekare başına dördüncü hücrelere 6,7 çarpı 10 tohumlama yoğunluğuna neden olur. İdeal olarak bir dağıtıcı pipet kullanarak 24 kuyu plakasını 1,5 mililitre batık ortamla önceden doldurun. Hücreleri% 80 izdiah ettikten sonra, yeniden yapılandırılmış insan epidermisinin veya RHE'lerin yetiştirilmesi için kesici uçlarda tohumlanmaya hazırdırlar.Bazal ortamı NHEK'lerle T75 şişelerinden çıkarın. Her T75 şişesine beş mililitre önceden ısıtılmış PBS ekleyerek hücreleri durulayın, ardından PBS'yi şişelerden çıkarın. Her şişeye önceden ısıtılmış iki ila üç mililitre önceden ısıtılmış %0,05 Trypsin-EDTA ekleyin, tripin çözeltisinin şişenin hücre kültürü alanına eşit olarak dağıtıldığından emin olun.Şişeleri dört dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, ardından hücrelerin mikroskobu kullanarak 10 X büyütmede ayrılıp ayırmadığını kontrol edin. Hücrelerin şişenin yüzeyinden salınmasını sağlamak için şişeyi rap. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, her T75 şişesine eşit miktarda önceden ısıtılmış tripsin inhibitörü ekleyin ve hücre süspansiyonu şişelerden bir santrifüj tüpüne aktarın.Şişeleri beş mililitre önceden ısıtılmış PBS ile durulayın ve hücre süspansiyonu içeren santrifüj tüpüne aktarın. Hasat edilen hücreleri beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Tüpte yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre bırakarak süpernatantın çoğunu dikkatlice atın.Peleti dikkatlice gevşetmek için tüpü parmaklarınızla hafifçe kaydırın. Tek tip bir hücre süspansiyonu sağlamak için 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme, düşük hacimli batık ortamda hücrelerin peletini hafifçe yeniden biriktirin. Hücre agregalarının oluşumunu önlemek için düşük bir hacimle başlayın ve ilk T75 şişesi başına bir mililitreye kadar batık ortam ekleyin.Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak süspansiyondaki hücreleri sayın. Metin elyazmasında sağlanan ilk denklemi kullanarak mililitre başına beşinci hücrelere 3.525 çarpı 10 konsantrasyona ulaşmak için hücre süspansiyonu ek batık ortamla seyreltin. Seyreltilmiş çözeltinin ikinci hücre sayısını gerçekleştirin ve kültür eklemesine tohumlanacak hücre süspansiyon hacmini hesaplamak için metin el yazmasındaki ikinci denklemi kullanın.24 kuyu kültürü kesici uçlarını taşıyıcı plakanın en yüksek konumuna asın ve taşıyıcı plakayı önceden batırılmış ortamla doldurulmuş 24 kuyu plakasına aktarın. Hücre süspansiyonunun belirlenen hacmini her kesici uça ekleyin ve kesici uçlara dokunmamaya dikkat edin. Tohumlamadan sonra, kenar etkisinin üstesinden gelmek için 24 kuyu plakasını oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.Bu süre zarfında plakaları hareket ettirmeyin. Plakaları hücre kültürü inkübatörüne aktarın ve üç gün boyunca su altında bırakın. Hücre kültürü inkübatöründe üç günlük bir inkübasyondan sonra, bir aspirasyon sistemi ve bir cam Pasteur pipet ile su altında kalan ortamı apikal bölmeden çıkararak membran yüzeyine yapışmış hücreleri hava sıvı arayüzüne veya ALI'ye maruz kalın.Yeni 24 kuyu plakasını 1,5 mililitre taze önceden ısıtılmış ALI ortamıyla doldurun ve taşıyıcı plakaları kültür kesici uçlarıyla yeni çok kuyulu plakalara aktarın. Çok kuyulu plakaları hücre kültürü inkübatörüne geri aktarın. ALI ortamını 14 gün boyunca her iki ila üç günde bir yenileyin.2B kültürdeki keratinositler, tutarlı bir çokgen şekle sahip geleneksel bir morfoloji görüntüler. ALI'de 15 gün kaldıktan sonra, yeniden inşa edilen insan epidermisi, dört ana epidermal tabakası ile belirtilen tamamen tabakalı bir doku oluşturur. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin rekonstrüksiyon protokolünde farklı zaman noktalarında ultrayapısal analizi, zaman içinde artan kornea alanı katmanları ile kornifikasyon sürecini ortaya koymaktadır.Epidermisteki keratinositler farklılaşma evrelerine göre farklı protein ekspresyon profilleri gösterirler. İnvolucrin ekspresyyönemi daha çok SG katmanında görünürken, filaggrin ve loricrin ifadesi üst katmanlarda bulunur. Keratin-10 ekspresyâtı SB tabakası hariç tüm uygulanabilir katmanlarda bulundu.Yeniden inşa edilen insan epidermisi, uygulanabilir epidermal katmanların hücreler arası boşluğunda Desmoglein-1'in ifadesiyle belirtildiği gibi fonksiyonel desmosomal kavşakları görüntüler. Yeniden yapılan epidermis modelinin bariyer özellikleri, bilinen bir bariyer bozucu ile topikal tedavi üzerine doku canlılığı değerlendirilerek ve doku bütünlüğü değerlendirilerek araştırılmıştır. Doku bütünlüğü 15 gün sonra TEER'in voltmetre ile ölçülmesiyle belirlendi.Epidermisin Lipopolisakkarit ve Tümör Nekroz Faktörü alfaya duyarlılığı araştırıldı. Hem LPS hem de TNF alfa tedavileri toksik değildi. Triton X-100 kontrolüne göre.Interleukin-1 alfa ve Interleukin-8'in RHE ortamında salınımı IL lizisi kullanılarak ölçüldü. LPS tedavisi Interleukin-1 alfa ve Interleukin-8'in salınımında istatistiksel olarak anlamlı bir yukarı regülasyonla sonuçlandı. TNF alfa tedavisi sadece Interleukin-1 alfa salınımında istatistiksel olarak anlamlı bir yukarı regülasyon ile sonuçlandı.Bununla birlikte, TNF alfa ile uyarılma üzerine Interlökin-8 seviyelerinde belirgin bir eğilim de gözlenmiştir. Bu protokolün ardından TEER, bariyer bütünlüğü için bir değer olarak ölçülebilir. Canlılık veya sitotoksiklik, örneğin bir MTT veya LDH tahlili ile ölçülebilir.Süpernatant sitokinlerin veya diğer proteinlerin salgısını ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, doku proteinlerin veya ilgi genlerinin ekspresyonunun incelenmesi için kullanılabilir.

cultivating-three-dimensional-reconstructed-human-epidermis-at-large

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu raporda, üç boyutlu bir cilt, mimari ve kompozisyon insan deri taklit modeli yeniden açıklar. Melanosit fizyolojisi, melanom ilerlemesi ve dermal kök hücre kaderi cilt modeli yeniden kullanarak incelenmiştir. Model preklinik ilaç değerlendirilmesi için bir araç olarak da yararlıdır.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Bu videoda, melanom ilerlemesini incelemek için in vitro 3D organotipik cilt rekonstrüksiyonları oluşturmak için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır. Bu cilt modeli, in vivo organların hem mimarisini hem de çok hücreli karmaşıklığını taklit eder.

Organotipik Tam Cilt Rekonstrüksiyonlarının Oluşturulması: İnsan Derisi Örneklerini Kullanarak 3D Cilt Modeli Oluşturma Prosedürü

Bu video protokolü, epidermal keratinositler ve cansızlaştırılmış insan dermisi kullanarak insan organotipik cildi oluşturmak için kaset tabanlı bir in vitro kültür tekniğini açıklar. İn vivo doku muadillerinin işlevini ve fizyolojisini taklit ederler.

Organotipik 3D Cilt Kültürü: Aselüler Dermiste İnsan Epidermisini Yeniden Oluşturmak İçin Kaset Tabanlı İn Vitro Kültür Tekniği

Bu protokolün amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmaktır. Özel olarak yapılmış bir otomatik yaralama cihazı ile, sterilitenin korunması altında hassas ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

Burada, biz mevcut her iki mimari beyannamedir bir 3D organotypic Melanom küresel Cilt modeli oluşturmak için bir protokol ve bir organ/tümör vivo içinde ama aynı zamanda çok hücreli karmaşıklık barındırır sistematik deneysel müdahale.

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Bu protokolün amacı, uzun vadeli kültür için erişilebilir ve basit teknikler kullanarak damarlı insan derisi eşdeğerlerinin neslini ve hacimsel analizini tanımlamaktır. Mümkün olduğu ölçüde, adımların gerekçesi, araştırmacılara araştırma ihtiyaçlarına göre özelleştirme olanağı sağlamak için açıklanmıştır.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Burada, bir hücre kültürü laboratuvarında rutin araştırmalar için çeşitli 3D cilt modellerini tanıtmak için ucuz ve basit prosedürler sunuyoruz. Araştırmacılar, ticari olarak mevcut modellere güvenmeden ihtiyaçlarına göre uyarlanmış modeller oluşturabilirler.

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre

Bu protokol, cilt mimarisini ve işlevini çoğaltmak için düzlemsel, fizyolojik olarak ilgili bir hava-sıvı arayüz kültür sistemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden saç folikülleri içeren cilt organoidleri üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir.

Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

Öğrenin, insan epidermisinin üç boyutlu yeniden yapılandırılması için kapsamlı bir protokol. Bu yöntem, NHEK hücreleri kullanarak 15 günde tam katmanlı doku oluşturur ve kozmetik güvenlik testleri için esnek bir model sunar.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

Daha fazla video keşfet