Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı
21 Şubat 2021
İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.
Bu protokol, AML hücrelerinin yüzeyindeki NKG2DL'leri algılamanın iki farklı yolunu gösterir. Teknik, bilinen ve muhtemelen bilinmeyen tüm NKG2DL'leri tespit etmek için hızlı, kullanıcı dostu bir boyama yöntemi sağlar. Bu yöntem, lösemik kök hücrelerin dökme AML hücrelerinden ayrılmasına izin verir, bu da bu hücrelerin daha fazla karakterize edilerek karakterize edilemeyi mümkün kılar.
Biotin ve NKG2D füzyon protein tüplerini oda sıcaklığında eriterek başlayın. NKG2D FC tozunun altını hızla aşağı çevirin, ardından tozu yeniden inşa etmek ve bir P-1000 mikropipette kullanarak iyice karıştırmak için 500 mikrolitre PBS ekleyin. Mililitre başına 10 mikrogramlık son bir konsantrasyon elde etmek için bir biotin tüpüne 100 mikrolitre NKG2DL füzyon proteini ekleyin ve çözeltiyi bir P-100 mikropipette ile iyice karıştırın.
AML hücrelerini eritmek için, birincil AML içeren cryovial'ı sıvı azot deposundan çıkarın ve hemen 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Tüpü suda hafifçe ileri geri hareket ettirerek şişenin içeriğinin sadece küçük bir buz kristali kalana kadar çözülmesini sağlar. Çözülen hücreleri hemen tüp içeren ortama aktarın ve bir mililitre orta kullanarak şişeyi durulayın.
Hücreleri 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve peletı bozmadan süpernatantı atın. Hücreleri %10 FCS içeren beş mililitre RPMI ortamıyla yıkayın ve santrifüjü tekrarlayın. Hücre peletini boyama tamponu ile mililitre başına yedinci hücrelere 0,5 çarpı 10 son konsantrasyona yeniden biriktirin.
Daha sonra hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini bir hücre kültürüne aktarın 96 kuyu U-alt plaka ve plakayı 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın. Biyotinilasyonlu NKG2D füzyon proteininin ana karışımını hazırlayın, böylece hücreler kuyu başına 50 mikrolitrelik son bir hacimde, kuyu başına mililitre başına 10 mikrogramlık son bir NKG2D konsantrasyonu ile yeniden kullanılır.
Hazırlanan ana karışımı ekleyin ve hücre peletlerini 200 mikroliter pipetle yeniden ıslatın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi plakayı kuluçkaya yatırın ve santrifüj edin. Streptavidin PE kullanarak bir ana karışım hazırlayın, böylece hücreler 50 mikrolitrelik son bir hacimde yeniden dirilir.
Ana karışımı hücrelere ekleyin ve peletleri 300 mikroliter çok kanallı pipetle yeniden biriktirin. Plakayı santrifüj ettikten ve süpernatantı attıktan sonra, hücre peletlerini 200 mikrolitrelik boyama tamponu artı 7-AAD'de yeniden kullanmak için 300 mikrolitre çok kanallı bir mikropipette kullanın. Ardından bir akış sitomemetri cihazı kullanarak hücreleri analiz edin.
Analiz edilen AML örnekleri CD34 ve NKG2DL için pozitiftir, ancak toplamda dört farklı popülasyonla negatif alt popülasyonlar da mevcuttur. Tipik gating stratejisi, FSC ve SSC aracılığıyla hücrelerin ana popülasyonunun seçilmesiyle başlar. Aşağı akış analizinde çiftler ve ölü hücreler hariç tutulur.
Kapılar, pozitif hücrelerin doğru tanımlanmasını sağlamak için FDO kontrolleri kullanılarak ayarlanır. CD34 ve NKG2DL için pozitif hücrelerin floresan yoğunlukları burada vurgulanmıştır. CD34 için pozitif olan AML hücreleri, NKG2DL ekspresyonunun sap eksikliği ile ilişkili olduğunu gösteren NKG2DL'nin daha düşük bir yüzey ifadesini gösterir.
Üç primer AML örneği füzyon proteini boyamada 19.8, 49.8 ve %89.4 pozitif olay gösterirken, havuza alınan anti-NKG2DL antikor boyamada %20.4, 50.4 ve %90.6 pozitif olay gösterdi. Öte yandan, tek ligand boyama, ligand'a göre değişen yüzdelerle% 92'ye kadar bir dizi olumlu olay gösterdi. Bu yöntemi denerken, birincil AML hücrelerini çözerken hızlı olmak çok önemlidir, çünkü kırılgandırlar ve bu adım sırasında kolayca ölebilirler.
Bu protokol yapıldıktan sonra, popülasyonları daha fazla araştırmak için NKG2DL sinyaline dayalı bir hücre sıralaması yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, insan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligandlarının (NKG2DL'ler) saptanması için iki farklı boyama yöntemini sunmaktadır. Bu teknikler, lösemik kök hücrelerin daha ayrıntılı karakterizasyon için toplu AML hücrelerinden ayrılmasını sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Onkoloji
Arka Plan
- NKG2D ligandları, kanserde immün tanıma için önemlidir.
- Akut myeloid lösemi (AML), hücre karakterizasyonunda zorluklar teşkil eder.
- Mevcut yöntemler, lösemik kök hücreleri etkili bir şekilde ayırt edemeyebilir.
- Yeni boyama protokolleri, tespit yeteneklerini artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- NKG2DL saptaması için etkili boyama protokolleri geliştirmek.
- Lökemik kök hücrelerin toplu AML hücrelerinden ayrıştırılmasını kolaylaştırmak.
- AML örneklerinin karakterizasyonunu iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- NKG2DL'leri tanımak için bir füzyon proteinin kullanılması.
- Birden fazla anti-NKG2DL antikorunun uygulanması.
- Biyotin ve NKG2D füzyon proteininin çözülmesi ve yeniden konfigüre edilmesi.
- Boyama için istenen konsantrasyonları elde etmek amacıyla çözeltilerin karıştırılması.
Ana Sonuçlar
- Her iki protokol de bilinen ve bilinmeyen NKG2DL'leri etkili bir şekilde tespit eder.
- Lösemik kök hücrelerin toplu AML hücrelerinden ayrılması sağlanır.
- Yöntemler kullanıcı dostu ve hızlıdır.
- AML hücrelerinin geliştirilmiş karakterizasyonu mümkündür.
Sonuçlar
- Yeni boyama protokolleri, NKG2DL'lerin tespitini geliştirmektedir.
- Bu yöntemler, AML biyolojisinin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, terapötik içgörüler elde etmek için bu tekniklerin üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Lösemik kök hücrelerin toplu AML popülasyonlarından ayırt edilmesi, hedef doğrulamada ve preklinik model geliştirmede kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir. Kök hücre özelliklerine sahip NKG2DL-negatif alt popülasyonları izole edebilme yeteneği, terapötik hipotezlerin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlar ve erken keşif iş akışlarında öngörülebilir güveni destekler. Bu yaklaşım, daha yüksek tümörijenik potansiyele sahip hastalıkla ilgili sistemleri tanımlayarak portföy önceliklendirmesine doğrudan bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: NKG2DL yüzey ekspresyonuna göre lökemik kök hücreleri izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kök hücre benzeri alt popülasyonları, diferansiye olmuş AML hücrelerinden ayırt etmek için hızlı ve kullanıcı dostu bir yöntem sağlar.
- Bilimsel Değer: NKG2DL-negatif fraksiyonlarda kök hücre özelliklerinin fonksiyonel validasyonu yoluyla biyolojik risk azaltımını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Liganda özgü ve pan-ligand boyama yaklaşımları genelinde NKG2DL ekspresyonunu karşılaştırmak için kantitatif akış sitometrisi okumaları oluşturur.
- Operasyonel Değer: Yüksek çıktılı tarama hazırlığıyla uyumlu, tekrarlanabilir ve standardize boyama protokolleri sunar.
- Bilimsel Değer: Alt bileşik taramaları ve hedef etkileşim çalışmaları için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: NKG2DL baskılanmasını LSC'lerdeki immün kaçış mekanizmalarıyla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Hastalığı başlatan hücrelerin izolasyonuna olanak tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Bilimsel Değer: Farklı tümörijenik potansiyele sahip AML alt popülasyonlarını tabakalamak için NKG2DL durumunu kullanarak preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, mekanistik olarak tanımlanmış alt popülasyonların izolasyonuna olanak sağlayarak, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik değerlendirmeye kadar olan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: NKG2DL-negatif LSC'leri, NKG2DL-pozitif toplu AML hücrelerinden ayırarak hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Akış sitometrisi tabanlı tarama platformlarıyla uyumlu, standardize edilmiş ve kantitatif yüzey tespit yoluyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitikler: Boyama yöntemlerinin ve alt popülasyon frekanslarının karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (pozitif olay yüzdesi, floresan yoğunluğu) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili modellerde fonksiyonel doğrulama için LSC'lerin izolasyonuna imkan tanıyarak preklinik sürekliliği sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: AML örnekleri genelinde uygulanabilen ve benzer immün kaçış mekanizmalarına sahip diğer kanser türlerine uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir bir kök hücre zenginleştirme yetkinliği oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kök hücre zenginleştirmede öngörülebilir güven, LSC tanımlamasındaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Çok sayıda AML örneğinde NKG2DL tespitinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Hedef doğrulamada iyileştirilmiş devam/durdurma kararları, erken risk azaltma yoluyla sermaye verimliliği, geç evre biyolojik riskin azaltılması.
- Portföy Etkisi: LSC zenginleştirme potansiyeli ve immün kaçış fenotipine dayalı, riske göre ayarlanmış hedef önceliklendirmesi.
Uygulama Dikkat Noktaları
- Akış sitometrisi, hücre boyama ve primer AML örneklerinin işlenmesi konularında uzmanlık gerektirir.
- Akış sitometrelerine, santrifüj ekipmanlarına ve biotin, NKG2D füzyon proteini, streptavidin PE ve 7-AAD dahil olmak üzere reaktiflere erişime bağımlıdır.
- Tutarlı sonuçlar için gating stratejilerinin, FMO kontrollerinin ve kompanzasyon ayarlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- NKG2DL ekspresyon modellerindeki değişkenlik nedeniyle, farklı model sistemlerine uygulanırken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, primer AML hücrelerinin çözünme sırasındaki hassasiyeti yer almakta olup, canlılığı korumak için hızlı işlem yapılması zorunludur.
