ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi
November 5th, 2020
Çevresel DNA tahlilleri, alan verilerinin toplanmasına başlamadan önce titiz bir tasarım, test, optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Burada, çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespiti ve nicelleştirilmesi için türe özgü, prob tabanlı bir qPCR testi tasarlamanın her adımında kullanıcıları götürecek bir protokol sunuyoruz.
İyi optimize edilmiş tahliller, çevresel DNA verilerinin doğru yorumlanması için hayati önem taşır. Bu protokol, böyle bir tahlil geliştirmek için gerekli tasarım ve test adımlarını açıklar. Genel olarak, çevresel DNA, belirli bir türü veya tür grubunu tespit etmek için invaziv olmayan bir yöntemdir.
Geleneksel anket yöntemlerine kıyasla maliyetleri düşürebilir ve daha hassas olabilir. Bu yöntem, ilgilenilen bir türden DNA'nın tespit edilmesi yoluyla koruma ve yaban hayatı yönetimine yardımcı olabilir ve örneklenen alanda bu türün varlığının potansiyel olarak anlaşılmasına olanak tanır. Kantitatif PCR'nin büyük hassasiyeti nedeniyle, kontaminasyon kolayca gerçekleşebilir ve kontaminasyonun ortaya çıktığı adımları belirlemek için negatif kontrollere ihtiyaç vardır.
eDNA, jargon ve steno terimlerle dolu bir alandır. Moleküler biyoloji veya qPCR alanında uygulanmayanlar için görsel gösteriler, kavramsallaştırmadan veri üretimine kadar deneysel bir tasarımın planlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir biyolog olan Dannise Ruiz Ramos ve bir öğrenci laboratuvar yardımcısı olan Trudi Frost olacak.
Başlamak için, NCBI'nin Nükleotid Veritabanını kullanarak ilgilenilen türler için birden fazla gen bölgesinden dizileri arayın ve indirin. Spesifikasyonlarla eşleşen tüm dizileri seçin ve Gönder'i seçin.Tam Kayıt, Dosya, İndirme Formatı'nı GenBank veya MOSTA olarak seçin, ardından Dosya Oluştur'u seçin. Bu diziler artık bilgisayara kaydedilir.
İlgilendiğiniz tüm türler için bu adımları tekrarlayın. Her gen bölgesi için dizileri ayrı bir dosyada saklayın, çünkü bunlar ayrı ayrı analiz edilecektir. Dizileri her bir gen bölgesinden ayrı ayrı hizalamak için, indirilen dizi dosyalarını Geneious Prime yazılımı gibi bir dizi hizalama programına aktarın.
Her gen bölgesi için ayrı klasörler oluşturun, ardından bir gen bölgesinden diziler içeren bir klasördeki tüm dizileri seçin. Seçilen dizilerin Geneious veya MUSCLE gibi bir nükleotid hizalaması oluşturmak için Çoklu Hizalama aracını kullanın. Hizalanmış dizi verilerinin görselleştirilmesi yoluyla tahlil tasarımı için umut verici bölgeleri seçin.
İlgilenilen türler için çok sayıda dizi verisine sahip, türler arasında oldukça farklı olan ve tür çeşitliliği içinde düşük gösteren bir bölge seçin. Ardından, tahlil primerlerini ve probu tasarlayın. Beş set qPCR testi tasarlamak için qPCR testi tasarım yazılımını kullanın.
Seçili diziyi Sıra Girişi kutusuna yapıştırın. Hizalama boşluk oluşturduysa, bunları diziden silin. Tasarımınızı Seçin seçeneğinde qPCR 2 primer probunu seçin, ardından önerilen tahlilleri indirin.
Dizileri ilk tahlilin ileri astarından kopyalayın ve bu astar dizisini önceden oluşturulan hizalamada arayın. Geneious Prime kullanıyorsanız, astar bölgesini hizalamaya eklemek için Açıklama Tahmin Et aracını kullanın. Bunu tüm astar ve prob kombinasyonları için yapın.
Hizalamanın bu bölgelerini, hedef türlerin yanı sıra birlikte ortaya çıkan türler içindeki varyasyon açısından inceleyin. Astarları NCBI'nin Primer-BLAST'ı ile in silico olarak test edin. Astarları, Astar Parametreleri altındaki kendi astar kutumu kullan seçeneğine yapıştırın.
Primer Pair Specificity Checking Parameters (Primer Çifti Özgüllük Denetimi Parametreleri) seçeneklerinde, Database (Veritabanı) olarak NR'yi seçin ve Organism (Organizma) kutusuna ilgilenilen organizmanın taksonomik sırasını veya ailesini yazın. Seçilen primerlerin hedef olmayan türleri büyütme olasılığının düşük olduğundan emin olun. Standart bir eğri oluşturarak test verimliliğini in vitro olarak test edin ve eğrinin verimliliğini ve doğrusal aralığını belirleyin.
Hedef diziyi içeren bir sentetik DNA standardının en az altı on kat seyreltmesini, reaksiyon başına yaklaşık bir ila bir milyon kopya olacak şekilde test edin. Y ekseninde her standardın CQ değerini ve X ekseninde reaksiyon başına kopya olarak ilk standart konsantrasyonun günlük tabanını 10 çizmek için qPCR yazılımını kullanın. qPCR yazılımı otomatik olarak doğrusal bir regresyon çalıştırmalıdır.
Regresyonun eğiminden verimliliği hesaplayın. Verimlilik ve R kare değerleriyle ölçülen standart eğriyi sapma veya düşük performans açısından görsel olarak inceleyin. Gerçek saha numunelerinin PCR inhibisyonunu test etmek için dahili bir pozitif kontrol kullanın, bu da hassasiyette ve yanlış negatiflerde azalmaya yol açabilir.
Her tahlil için tespit ve miktar tayini sınırlarını belirleyin. Spesifikliği doğrulamak için tahlilleri hedef olmayan türlerle test edin ve tahlilin çoğullanmış bir IPC ile iyi performans gösterdiğinden emin olun. İyi duyarlılık, özgüllük ve verimliliğe sahip tahliller sonraki adımlara geçebilir.
Testin yerinde testini gerçekleştirmek için birden fazla su numunesi alın ve bunları qPCR için işleyin. Kantitatif PCR testini çalıştırın ve eDNA konsantrasyonunu ve tespit sıklığını, oluşum ve bolluktaki bilinen bölge farklılıklarıyla karşılaştırın. Sıralama ile tüm algılamaları onaylayın.
Clinch Nehri'ndeki tüm Unionidae türlerinin mevcut dizileri indirildi ve hizalandı. Birden fazla tahlil tasarlandıktan sonra, görsel değerlendirme için hizalamaya beş set primer ve prob eklendi. Astar ve prob setleri in silico ve in vitro olarak test edilmiştir.
Laboratuvarda, tüm tahliller, özgüllüğü doğrulamak için mevcut 27 türün DNA ekstraksiyonları kullanılarak test edildi. Bir tahlil, yalnızca hedef türü başarıyla çoğalttı. İyi verimlilik ve R kare değerleri ile başarılı bir test burada gösterilmiştir.
Seçilen tahlil için LOD ve LOQ'nun her ikisi de reaksiyon başına beş kopyaydı. Buna karşılık, düşük verimliliğe sahip standart bir eğri üreten tahliller atıldı. Kaliteli bir qPCR'de, standart seyreltmeler, konsantrasyondaki her on kat fark için yaklaşık 3.3 döngülük eşit aralıklı döngü miktar belirleme değerlerinde amplifiye edilir.
Zayıf bir qPCR'de standartlar, seyreltmeler arasındaki döngü niceleme değerlerinde eşit olmayan farklılıklar gösterebilir. Bilinmeyen numuneler için IPC amplifikasyonu, negatif şablon kontrol IPC'sinin sonuçlarıyla karşılaştırılmalıdır. Numunelerde herhangi bir inhibitör yoksa, tüm IPC amplifikasyonu, döngü niceleme değerleri şablon kontrolü yok ile hemen hemen aynı olacak şekilde, grafikte sıkı bir gruplandırmaya sahip olmalıdır.
Tahlilin yerinde test edilmesi için, konum alanları deredeki midye yatağının dibini, kıyıya yakın kas yatağının dibini, deredeki yatağın 100 metre aşağısını, deredeki yatağın 500 metre aşağısını ve kıyıya yakın yatağın 500 metre aşağısını içeriyordu. Çevresel DNA için kantitatif PCR testleri, hem istilacı hem de nesli tükenmekte olan türlerin izlenmesine yardımcı olabilir ve ayrıca bireysel organizmayı fiziksel olarak yakalamak zorunda kalmadan tür tespitindeki mekansal ve zamansal değişiklikler hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Genel Bakış
Bu protokol, çevresel DNA'yı (eDNA) tespit etmek için tür-spesifik, prob tabanlı qPCR analizlerinin tasarımını ve optimizasyonunu özetlemektedir. Doğru veri yorumlamasını sağlamak için titiz analiz geliştirmenin önemini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Çevresel DNA analizi
- Kantitatif PCR (qPCR)
- Koruma biyolojisi
Arka Plan
- Çevresel DNA, tür tespiti için invaziv olmayan bir yöntemdir.
- Geleneksel araştırma yöntemlerinden daha hassas ve maliyet-etkin olabilir.
- Kontaminasyon önemli bir endişe kaynağıdır ve sıkı kontroller gerektirir.
- Görsel yardımlar, analiz tasarımının uzman olmayanlar tarafından anlaşılmasını sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- qPCR analizlerini geliştirmek için kapsamlı bir protokol sağlamak.
- Çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespit edilmesini kolaylaştırmak.
- Koruma ve yaban hayatı yönetimi uygulamalarını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- NCBI'nin Nükleotid Veritabanı'ndan dizi alımı.
- Geneious Prime gibi yazılımlar kullanılarak dizi hizalaması.
- Hizalanmış dizilere dayalı qPCR primerleri ve problarının tasarımı.
- Deneme verimliliği ve özgüllüğünün in silico ve in vitro yöntemlerle test edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Hedef tür DNA'sının yüksek verimlilikle başarılı bir şekilde amplifikasyonu.
- Analizler için tespit ve kantitasyon sınırlarının belirlenmesi.
- Deneme özgüllüğünün hedef dışı türlere karşı doğrulanması.
- Alan örneklerinde etkili eDNA tespitinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Doğru eDNA analizlerinde iyi tasarlanmış qPCR analizlerinin kritik öneme sahip olduğu.
- Analizlerin verimlilik ve özgüllük açısından titiz bir şekilde test edilmesi gerektiği.
- Bu protokol, alanındaki araştırmacılar için değerli bir kaynak olarak hizmet vermektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Species-specific qPCR assay development enables precise, non-invasive detection of target organisms from environmental samples, supporting early-stage biological hypothesis testing in conservation and toxicology contexts. Rigorous assay validation provides quantitative, reproducible data that improves predictive confidence in species presence/absence calls, reducing false positives and negatives in field monitoring. This approach strengthens translational continuity from discovery to application by delivering scalable, standardized tools for biodiversity assessment and ecological risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of species-specific genetic markers to clarify target presence in complex environmental matrices.
- Operational Value: Supports functional validation of ecological targets through sensitive, quantitative detection of low-abundance DNA.
- Predictive Value: Establishes confidence in biomarker-like signals for species occupancy, informing go/no-go decisions in environmental monitoring programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated primer-probe sets with defined limits of detection and quantification for reliable eDNA quantification.
- Operational Value: Ensures assay specificity through empirical testing against non-target species, minimizing cross-reactivity in multiplexed formats.
- Scalability: Standard curve generation enables normalization across batches and sites, supporting longitudinal and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular detection outputs to ecological outcomes, enabling correlation of eDNA levels with species abundance and distribution.
- Disease-Relevant System: Applicable to pathogen or invasive species surveillance in aquatic systems, supporting early-warning monitoring frameworks.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in environmental sampling by linking DNA signal to biological origin through sequencing confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay development workflow fits within early discovery to translational validation, providing a standardized path from sequence data to field-deployable detection tools for species-specific monitoring.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing regarding species presence, distribution, and ecological interactions through targeted genetic interrogation.
- Screening: Delivers ready-to-use, optimized qPCR assays with defined dynamic range and sensitivity for high-throughput environmental sample analysis.
- Analytics: Generates quantitative Cq data convertible to DNA copy numbers, enabling statistical comparison across conditions and time points.
- Translational Research: Supports extrapolation from lab validation to field application via IPC controls and sequencing verification of positives.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assay development pipeline applicable to multiple species or gene targets across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic confidence in species detection by linking qPCR signal to specific genetic targets.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows with built-in contamination controls and inhibition monitoring.
- Strategic Value: Improves decision-making in environmental programs by reducing uncertainty in species detection data.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of sampling sites or conservation actions based on validated eDNA signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, sequence alignment, and qPCR optimization.
- Dependent on access to qPCR instrumentation, bioinformatics tools, and synthetic DNA standards.
- Necessitates standardized SOPs for sample processing, DNA extraction, and negative control inclusion.
- Must account for environmental inhibitors through IPC multiplexing in field sample analysis.
- Limited by availability of reference sequences and potential for primer-dimer or off-target amplification in complex backgrounds.
