Deneysel Otoimmün Üveit: Göz İçi İnflamatuar Bir Fare Modeli

Bu model, immün aracılı insan posterior üveitinin patogenezini içeren hücresel mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin anlamı, yeni ilaç etkinliğinin izlenmesinde ve kimyasal hastalık progresyonuna mekanik bir bakış açısı sağlamada insan üveitinin translasyonel çalışmasına doğru uzanmaktadır. Bu modeli kullanmanın temel avantajı, hastalık indüksiyonunun güvenilirliği ve hastalığın ilerlemesini izlememizi sağlayan non-invaziv endoskopik tekniklerin kullanılmasıdır.

Burada hastalığın nasıl indükleneceğini ve patolojinin birkaç okuma kullanarak nasıl değerlendirileceğini açıklıyoruz IRBP 1-20 tam Freund's Adjuvan veya CFA'yı hazırlamak için, hesaplanan bir peptit miktarını minimum% 100 DMSO hacminde askıya alın. Toz tamamen çözündüğünde, çözeltiyi karıştırmak için nazik ajitasyon kullanılarak enjekte edilecek fare sayısına göre nihai hesaplanan PBS hacmine ulaşana kadar tüpe küçük miktarlarda PBS ekleyin. Freund's Adjuvant'ın tamamını hazırladıktan sonra, DMSO PBS peptid çözeltisini süspansiyona bire bir oranda damla damla eklerken, bir visküs ve eşit olarak dağıtılmış emülsiyon oluşturmak için çözeltiyi nazikçe ve sık sık pipetleyin.

Çözeltileri havalandırmak için, kalın, kremsi bir emülsiyon elde edilene kadar çözeltiyi tekrar tekrar pipetlemek için 700 mikrolitreye ayarlanmış 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Peptit süspansiyonunu enjekte etmeden önce, enjekte edilecek her fareyi ayrı bir kafese yerleştirin ve intraperitoneal olarak 100 mikrolitre RPMI 1640 ortamında 1.5 mikrogram Bordetella boğmaca toksini vermek için 23 gauge iğne ile donatılmış bir mililitre şırınga kullanın. Boğmaca toksin çözeltisi enjekte edildiğinde, fare scruff benzeri bir pozisyonda tutulmalı ve cilt boynun arkasında çadır benzeri bir yapı oluşturmak için sıkıştırılmalıdır.

İğneyi parmak ve başparmak arasındaki boşluğa geçirin ve 200 mikrolitre IRBP emülsiyonunu çadırlı cilde enjekte edin, enjeksiyondan sonra basıncı koruyun ve geri çekilmeden önce cildi kapatmak için iğne kafasını döndürün. Klinik hastalığı puanlamak için, enjeksiyondan sonraki 21. günde, anestezi uygulanan peptit enjekte edilen farede yaprak refleksine yanıt eksikliğini doğrulayın ve hayvanı bir karışıklıkta kısıtlayın. Topikal olarak, enjeksiyondan hemen sonra her gözün korneasına% 1 tropikamid% ve% 2 fenilefrin uygulayın.

Öğrenciler tamamen genişlediğinde, fareyi amaca yönelik bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Retinaya tam erişim için mikroskopu konumlandırın. Optik diski ve retinayı görmek ve tüm retina bölgesinin görüntülerini elde etmek, çevrenin tüm köşelerini ayarlamak ve kaplamak için görüntüleme işlemi boyunca göz merceğini gerektiği gibi ayarlayın.

Damar sızıntısını ölçmek için, boynun arkasına deri altından 100 mikrolitre% 2 floresein uygulayın ve fareyi, retina canlı görüntünün ortasında ortalanacak şekilde yeniden konumlandırın. Floresan enjeksiyonundan 1.5 ve yedi dakika sonra her birinin görüntüsünü elde etmeden önce fonoskopu 465 ila 490 nanometrede mavi ışık uyarma filtresine ayarlayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, intraperitoneal olarak iyileşme için enjekte edilebilir bir anti sedasyon verir ve fareyi, fare bilincini yeniden kazanana kadar izleme ile ıslak ıslatılmış diyete erişimi olan önceden ısıtılmış bir mat üzerindeki bir kafese yerleştirin.

Görüntülerin klinik hastalık skorlaması için, klinik değerlendirmeyi optik disk iltihabının şiddetine, retinal damar kelepçelemesine, retina dokusuna sızmasına ve yapısal hasara dayandırın. Bu parametrelerin her birini bir ila beş arasında bir ölçekte puanlayın. Kolektif toplam, göz başına elde edilebilecek maksimum 20 puan ile tüm göz için klinik hastalığı temsil eder.

Çalışmanın son klinik bitiş noktası için fundus görüntülemeden sonra, fareyi ötenazileştirin. Histolojik analiz için, tüm göze erişim için göz kapaklarını ayırın, ardından orbital bağ dokusunu ve optik siniri kavramak ve gözü enüklee etmek için kavisli forsepsleri dünyanın arkasına yerleştirin. Enüklee olmuş gözü, organı en az 24 saat boyunca bir ila beş mililitre% 10 formaldehit'e aktarmadan önce en az 15 dakika boyunca bir ila beş mililitre% 4 glutaraldehit içine yerleştirin.

Histolojik doku boyamasından sonra, standart protokollere göre, bağışıklık hücresi infiltrasyon seviyesine ve retina hasarının derecesine bağlı olarak sıfır ila üç arasında bir ölçekte puanlar atanır. Hastalığın ilerlemesi sırasında yapılan fundoskopik değişiklikler, retina dokusu ile vasküler ve optik disk inflamasyonu ve retinal yapısal hasarın yanı sıra infiltrasyona bağlı histolojik değişiklikler ve yapısal bozuklukları içeren inflamatuar değişiklikler olarak sınıflandırılır. Bu klinik ve histopatolojik değişiklikler, hastalığın ilerlemesini değerlendirmek ve terapötik müdahale etkinliğini değerlendirmek için derecelendirilebilir ve puanlanabilir.

Vasküler sızıntı ayrıca modelin ve insan üveitinin patolojik bir özelliğidir. Bu analizde gösterildiği gibi, floresein, vasküler sızıntıyı bu modelin başka bir okuması olarak görselleştirmek için kullanılabilir. Araştırmacıların, emülsiyonun, çözeltiler arasında ayrılık belirtileri olmadan doğru şekilde hazırlandığından emin olmaları önemlidir.

İyice karıştırılmalı ve nihai ürün dokuda pürüzsüz olmalıdır. Bu prosedür diğer ilaç uygulama yöntemleri ve retinal immün hücre popülasyonlarına sızan fenotipleme için sitometri ile birleştirilebilir.