İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit bazlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerini takiben hücre ölümü seviyelerini ölçmekti. Bu model, hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanım için ücretsiz tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkilere sahip olabilir. HCM hücrelerini kültürlemek için, kriyoprezervasyonlu hücreleri 37 santigrat derecelik bir su banyosunda sıvı nitrojenden çözün ve bunları %95 hava ve %5 karbondioksit içeren bir atmosfer altında bir nemlendirici inkübatöründe tutun.

Hücreler% 60 ila 70 birleşmeye ulaştığında, ortamı altı oyuklu plakadan aspire edin ve hücreleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Her bir oyuğa iki mililitre taze şekersiz ortam ekleyin ve hücreleri, 37 santigrat derecede %95 azot, %5 karbondioksit ve %0.1 oksijen karışımı altında üç gazlı bir inkübatörde sabit bir sıcaklıkta kültürleyin. Zaman-sıcaklık protokolü için, ortamı altı oyuklu plakadan aspire edin ve iki mililitre taze şekersiz ortam ekleyin.

Hipoksi oluşturmak için hücreleri 12 saat boyunca bir tri-gaz inkübatörde kültürleyin. 10 saatlik düşük sıcaklık tedavisi ile başlayan sıcaklık programını ayarlayın, ardından iki saat ve 24 saatlik normotermi için yeniden ısıtma aşaması izleyin. Analiz için her zaman noktasında üç Petri kabını çıkarın.

Düşük sıcaklık işleminden sonra, ortamı altı oyuklu plakadan aspire edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Her oyuğa iki mililitre taze ortam ekleyin, ardından hücreleri% 95 hava ve% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede tutun. Plakanın her bir oyuğuna sekiz mikrolitre CCK-8 çözeltisi ekleyin ve plakayı inkübatörde bir saat bekletin.

İnkübasyondan sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nanometrede absorbansı ölçün. Apoptoz analizi için, hücreleri boyamak için beş mikrolitre Annexin V-FITC ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonuna 10 mikrolitre propidyum iyodür ekleyin.

Hücreleri yavaşça karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Akış sitometrisi yazılımında, iki nokta grafiği penceresi açın ve x ekseninde öne doğru saçılan ışığı ve y ekseninde yan saçılan ışığı seçin. PE algılama kanalını ve FITC'yi seçin.

Boş numune tüpündeki süspansiyondan parçacıkları toplamak için Kaydet'e tıklayın, ardından ilk nokta grafiğinde daha fazla analiz için hücre popülasyonunu geçitleyin. Ardından, tek lekeli numuneleri tüp destek koluna yerleştirin. Süspansiyondan parçacıkları toplamak ve daha fazla analiz için hücre popülasyonunu kapılamak için Kaydet'e tıklayın.

Mitokondriyal değerlendirme için, tripsinizli hücreleri içeren her tüpe 0.5 mililitre JC-1 çalışma çözeltisi ekleyin ve bunları 20 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin ve HCM'leri 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde bir mililitre buz gibi soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin. PE ve FITC algılama kanallarını seçerek JC-1'in floresan yoğunluğunu ölçün.

Reaktif oksijen türleri tahlili için, hücreleri ve kültür ortamını 10 mikromolar DCFDA ile boyayın ve hücre yoğunluğunu yaklaşık bir ila 10 milyon hücreye ayarlayın. Bu hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ardından bir akış sitometresinde analiz edin. Enzim etiketli plakaya 40 mikrolitre tampon çözeltisi ekleyin, ardından numuneden 80 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra 10 mikrolitre iki milimolar asetil DEVDp-nitroanilid ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede 120 dakika inkübe edin. Üreticinin talimatlarını kullanarak bir mikroplaka okuyucu makinesinde A405 değerini ölçün. Zaman-sıcaklık protokolündeki sıcaklık koşulları, üç zaman noktasında hassas sıcaklık düzenlemesine izin veren bir tri-gaz inkübatörü kullanılarak oluşturuldu ve sürdürüldü.

Oksijen ve glikoz yoksunluğunun veya OGD'nin HCM'lerin canlılığı üzerindeki etkisi, CCK-8 testi kullanılarak belirlendi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, hücre canlılığı zamana bağlı olarak önemli ölçüde azaldı. HCM'lerin apoptoz oranları, reperfüzyondan sonra sıfır ile 16 saat arasında kademeli olarak artmış, daha sonra 16 saatlik zaman noktasında maksimum hıza ulaşmıştır.

OGD grubu ile karşılaştırıldığında, hipotermi ile tedavi edilen üç grupta canlı hücrelerin yüzdesi daha yüksekti. Ek olarak, derin hipotermi grubundaki hücreler, OGD grubunda gözlemlenenden 2.1 kat daha yüksek olan en yüksek canlılığa sahipti. Akış sitometrisi sonuçları, hipoterminin OGD koşulları altında HCM'lerin apoptozunu önlediğini doğruladı.

Hipotermi tedavisi ayrıca HCM'lerde hücre içi ROS düzeylerini de azalttı. JC-1 boyama ile mitokondriyal membran potansiyeli tespit edildi. OGD tedavisinden sonra kırmızı-yeşil floresan oranı azaldı.

Hipotermi, OGD'nin neden olduğu bu etkiyi önemli ölçüde inhibe etti. Ayrıca, hipotermi ile tedavi edilen hücrelerde kaspaz-8 ve kaspaz-3'te bir azalma gözlendi. Bu modelin güvenilirliği, sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve kararlı deneysel sonuçlara bağlıdır.

Bu yöntem, hücre apoptozu üzerindeki hipotermik tedavinin spesifik mekanizmasını daha fazla araştırmak ve hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir. Hipotermik adjuvan tedavinin gelişimi için büyük önem taşımaktadır.