TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı
July 15th, 2021
Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.
Elektron mikroskopisi analizi sıklıkla karmaşıktır. Protokolümüzün EM verilerinin büyük numune yüzeyinden ve orta hacimden işlenmesini ve edinimini kolaylaştırdığına inanıyoruz. Protokolümüz seri bölümlerde hedef yapıları bulmaya yardımcı olur.
Veri kaydı gerekli olanla sınırlıdır. Tam doku bloklarında veri toplama ile karşılaştırıldığında, kayıt süresi azalır ve veri analizi daha kolaydır. Yaklaşımın genel kolaylığı göz önüne alındığında, sadece bilimsel soruları değil, aynı zamanda bir tanı aracı olarak da kullanılabileceğine inanıyoruz.
Analiz için bir dizi oluşturmak için, önce numuneyi bir ultramikrotom tutucuya kelepçeleyin ve reçineyi numunenin etrafına kabaca kırpmak için bir jilet kullanın. Numuneyi ince kırpmak için bir elmas kırpma aracı kullanın ve bloğun üst ve alt yüzeylerinin bıçağın kesme kenarına paralel olduğundan emin olmak için 20 veya 90 derecelik eğimli kesme bıçakları kullanın. Ksilen ve tutkalları 3:1 oranında karıştırın ve karışımı kesilmiş bloğun üst ve alt kenarlarına uygulamak için kürdana bağlı bir kirpik kullanın.
Karışım kururken, bir gofret parçasını analiz için uygun boyuta kesmek için bir gofret sıkma aracı kullanın. Herhangi bir döküntünü durulamak için gofretleri damıtılmış suda temizleyin ve gofret kurudıktan sonra yüzeyi plazma ile temizleyin. Bir dizi tomografi bıçağı hazırlamak için, bir histo jumbo bıçağın altına bir iğne takmak için köpüklü yapışkan bant kullanın ve bıçağı ultra mikrotom tutucuya sıfır derecede yerleştirin.
Bıçağın kenarını blok yüzeyine paralel olarak ayarlayın ve kesilmiş bloğu kesit için hazır bir konumda bıçağın kenarına getirin. Temiz gofreti bıçak havzasına yerleştirin ve havzayı bıçak kenarı ile aynı seviyeye kadar suyla doldurun, ardından bıçağın elmas kenarının gerektiği gibi su eklemek veya çekmek için ekli şırınnayı kullanarak düzgün bir şekilde nemlendirmesine izin verin. Dizi bölümleme için mikrotomeyi 50 ila 100 nanometre kesme aralığına ve saniyede 6 ila 1 milimetre kesme hızına ayarlayın ve hedeflenen bir Z hacmini kaplayacak kadar uzun bir şerit elde etmek için bölümlere başlayın.
Blok boyutuna, dokunun homojenliğine ve reçine türüne bağlı olarak, şerit yaklaşık olarak düz olacaktır. Şeritleri bıçak kenarından ayırmak için kirpiğin temiz, yapışkan olmayan bir ucunu kullanın. Şeridi destek ortamının ortasına hafifçe taşımak için kirpik kullanın.
Gerekirse bölümü germek için kloroform veya ısıtma kalemi kullanılabilir. Gerdikten sonra, suyu boşaltmaya başlamak için şırınnayı geri çek. Daha hassas şeritler veya daha yavaş bir su geri çekilmesi için şırınnayı hortumdan ayırarak suyun damlamasını sağlar.
Su seviyesi gofret seviyesine ulaştığında, şeridi yavaşça havzanın ortasına itin ve kalan suyun tamamı havzadan tamamen çıkarılana kadar tahliyeye devam edin. Gofret temiz bir ortamda kurusun. Kurutma yaklaşık 30 dakika sürer.
Numune tamamen kuruduğunda, kir kirlenmesinden korumak için diziyi sıkıca kapatılan bir kutuya aktarın. Ve kutuyu en az 30 dakika boyunca 60 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin. Gofretteki bölüm konumlarını gösteren SEM görüntülerinin genel bir haritasını elde etmek için, bölümler şeridini kapsayan bir SEM görüntüsü elde etmek için yerleşik optik kamerayı kullanın.
Mozaik oluşturmak için, örneğin kamera görüntüsünü tıklatıp sürükleyin ve otomatik alımı başlatın. Hedef yapıları bulmak için daha yüksek çözünürlükte genel bakışlar alın. Yalnızca birkaç bölümün görüntülenmesi gerekiyorsa, edinilen görüntüleri orijinal konumlarında görüntülemek için yakınlaştırılabilir görüntüleyiciyi kullanın.
Yüksek çözünürlükte görüntülenmesi gereken bir bölüm belirlendikten sonra, görüntüleme bölgesi oluşturmak için tıklatın ve sürükleyin, ardından Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Ayarları'nı seçin ve ayarları bir şablonda depolayın Özellikle küçük veya tespit edilmesi zor nadir olayları bulmak için, her 10. Ardından görüntüleri gözden geçirin ve ilgi çekici bölgeyi içeren bölümleri işaretleyin. 10'dan fazla ardışık bölüm elde etmek için, tüm bölümleri otomatik olarak bulmak için bölüm bulucuyu kullanın.
Genel bakış görüntüleri net ilgi alanları göstermiyorsa, bölümlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntülerini alıp görüntüleri otomatik olarak oluşturmak ve almak için bölüm önizleme işlevini kullanın. En uygun görüntüleme ayarlarını belirlemek için mikroskop kontrol yazılımındaki canlı görüntülemeyi etkinleştirin ve ilgi çekici bir bölgeye gidin, ardından görüntüler net ilgi alanları gösterene kadar görüntüleme ayarlarını ayarlayın, ancak üreticinin yönergelerine göre aşırı uzun bir görüntü alımı olmadan. Görüntüleme bölgelerinin ardışık bölümlerdeki konumunu en iyi duruma getirmek için, ilgi alanı görüntüsüne yakınlaştırın ve kayıtlı bölüm konumlarının duyarlılığını artırmak için Konum İyileştirmeyi Başlat'ı tıklatın.
Görüntüleme bölgesi tanımlamak için, Alt tuşunu basılı tutarken herhangi bir bölümü tıklatıp sürükleyin ve açılır bağlam menüsünden Döşeme Kümesi Dizisi Oluştur'u seçin. Yazılım, bulunan veya daha önce işaretlenmiş tüm bölümlerde aynı göreli konumda görüntüleme bölgeleri oluşturur. Ardından her görüntü serisinde gerektiğinde piksel sayısı, piksel boyutu, döşeme düzeni ve piksel durma süresini ayarlayın.
Otomatik işlevi yapılandırmak için, gösterildiği gibi otomatik işlevler için ayrı bir görüntü serisi oluşturun ve görüntü serisini bölümde yüksek karşıtlık yapıları içeren bir konuma taşıyın. Görüntü serisini 1024 x 884 piksel olarak ayarlayın ve görüntü serisinde kullanılan en yüksek çözünürlüğe karşılık gelen bir piksel boyutu seçin. Otomatik işlevler listesinde Otomatik odaklama ve Otomatik damgalamayı kontrol edin.
Edinme sırası denetimlerinde İki Bölüm'ü seçin ve otomatik işlevin görüntüsünün listedeki ilk öğe olduğunu onaylayın, ardından görüntü alımını başlatmak için Tümlerini Al'ı tıklatın. Tüm görüntüleme serileri oluşturulduğunda ve ayarlandığında, seri bir iş kuyruğunda listelenir. Düşük çözünürlüklü alım, tek veya mozaik görüntüleme kullanılarak bölümün seçilen kısımlarına veya tüm bölüme manuel veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir ve ardından dikiş atılabilir.
Seçilen alandan görüntüler daha sonra mitokondri, çekirdek ve mikrovilliyi görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü parametreler kullanılarak elde edilebilir, örneğin, çözümlenmiş mozaik haritaların otomatik olarak alınması seçildikten sonra, birkaç ilgi alanı kırpılabilir veya bölgeler içinde ek yerel görüntüleme alanları tanımlamak için kullanılabilir. Drosophila bağırsağındaki farklı özel hücre tipleri rastgele dağıtılsa da, görüntüleri tek bölümlerden veya seri görüntüler topluluğu olarak yüksek çözünürlüklü parametreler kullanarak taradıktan sonra görsel olarak ayırt edilebilirler. Hizalamadan sonra, yığınlar farklı yazılım çözümleri kullanılarak işlenebilir.
Dizi tomografi analizi, tek gofret üzerinde birçok sıralı bölüm oluşturulmasına ve genel ilgi alanlarını yerelleştirmek için düşük çözünürlüklü parametreler kullanılarak taranmasını sağlar. Bu alanlar, gelişmiş alım parametreleri kullanılarak daha fazla analiz için hedeflenebilir. Örneğin, notumdaki mitotik bölünmelerin ultra yapısal düzeyde lokalize etmesi kolay değildir, çünkü hücreler çekimser bölgeye göre nispeten büyüktür.
Ancak bu yöntem kullanılarak, 20 ila 40 bölümlük sıçramaların otomatik orta çözünürlüklü genel bakış görüntüleri, bölünen hücreleri yerelleştirmek için kullanılabilir. Dizi tomografi prosedürü daha basit bir elektron mikroskopisi veri analizi sağlar. İzleyicileri yenilenmede ustalaşmaya ve haritalarla ilgili iş akışına aşina olmaya yatırım yapmaya teşvik ediyoruz Deneyimlerimize göre, çok az araştırma konusu tüm hayvanların veya tüm organların ultra yapısal analizini gerektirir.
Yöntemimiz, hücrelerin ve dokulardaki etkileşim ortaklarının hızlı lokalizasyonuna yardımcı olur.
Genel Bakış
Bu çalışma, taramalı elektron mikroskobu (SEM) içinde otomatik görüntüleme kullanarak Array Tomografi analizi için seri kesit şeritleri hazırlama protokolü sunmaktadır. Yöntem, büyük numune hacimlerinde lokalize edilmiş, nadir olayların etkin taramasını ve geri kazanımını sağlayarak, geleneksel tüm doku blok yöntemlerine kıyasla veri kayıt sürelerini önemli ölçüde azaltmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Elektron mikroskobu
- Görüntü edinme teknikleri
- Numune hazırlama yöntemleri
Arka Plan
- Elektron mikroskobu veri analizinin karmaşıklığı
- Nadir yapılar için hedefli görüntülemenin önemi
- Numune işlemede gelişmiş verimliliğe duyulan ihtiyaç
Kullanılan Yöntemler
- Ultra ince seri kesitlerin hazırlanması
- Ultramikrotom ve elmas bıçakların kullanımı
- Otomatik SEM görüntüleme protokolleri
Ana Sonuçlar
- Seri kesitlerin hazırlanması ve görüntülenmesi için yöntemleştirilmiş protokol
- Gelişmiş veri analiz kabiliyetleriyle birlikte azaltılmış görüntüleme süresi
- Yöntemin hedef yapıları tanımlamada etkinliği
Sonuçlar
- Protokol, elektron mikroskobu verisi elde etmek için önemli avantajlar gösterir
- Hücresel yapılara yönelik bilimsel sorgulamalar için tanısal bir araç sunar
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Array tomography in SEM enables precise localization of target structures within large sample volumes, reducing unnecessary data acquisition and improving efficiency in discovery workflows. This approach supports rapid identification of rare cellular events, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The method facilitates translational continuity by preserving samples for repeated imaging and enabling scalable, reproducible analysis across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise localization of target areas in serial sections.
- Operational Value: Reduces data acquisition time by focusing imaging on relevant fractions of sample volume.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by providing nanometer-resolution structural insights for organelle-level questions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream SEM imaging workflows.
- Operational Value: Enables array sectioning on wafers for standardized, repeatable sample preparation.
- Scalability: Supports creation of section libraries ready for repeated imaging and automated acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Conserves array tomography samples during imaging, allowing reuse for validation studies.
- Mechanistic De-risking: Provides quantitative structural data on mitochondria, nuclei, and microvilli to inform preclinical decisions.
- Predictive Confidence: Enables alignment of imaging data with disease-relevant systems through high-resolution parameter screening.
Pipeline & Workflow Integration
The array tomography workflow integrates into the discovery continuum by enabling early target localization, supporting lead identification through targeted high-resolution imaging, and informing preclinical validation via reproducible structural analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying rare events such as mitotic divisions in tissue samples.
- Screening: Delivers assay readiness through low-resolution overview imaging to localize areas of interest before high-resolution acquisition.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via mosaic maps and aligned stacks for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through rendered sections that support biomarker alignment and structural validation.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability via section libraries stored in tightly-closed boxes and oven-stabilized for repeated imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanometer-resolution imaging of cellular and structural details.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via automated SEM imaging protocols and section finder tools.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by efficient acquisition of volume information from large sample surfaces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultramicrotome operation, diamond knife handling, and wafer preparation techniques.
- Depends on instrumentation including ultramicrotome, plasma cleaner, syringe-based humidity control, and SEM with optical camera.
- Necessitates cross-team standardization of section thickness (50–100 nm), cutting speed (6–1 mm/s), and water basin protocols.
- Involves adaptation considerations for varying block size, tissue homogeneity, and resin type affecting ribbon straightness.
- Includes practical limitations such as the need for manual ribbon detachment using eyelash tips and water retraction timing for delicate samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Array Generation
1:42
Sample Sectioning
2:23
Array Sectioning and Transfer
3:53
Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:16
Imaging Region Definition
6:37
Auto Function Configuration and Image Acquisition
7:27
Results: Representative Targeted Acquisition of Volume Information
9:02
Conclusion
