Name: Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Keşfedin, fare kalp ve akciğerlerinden hücreden arındırılmış ekstraselüler matris iskeletleri oluşturma yöntemini. Bu protokol, biyokimyasal ve anatomik analizler için yapısal bütünlüğü koruyan ECM elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prof. Ivana Novak ve Dr. Nynne Meyn Christensen'e (Kopenhag Üniversitesi İleri Biyogörüntleme Merkezi)'ne mikroskop erişimi sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ve JTE); Lundbeck Vakfı'ndan doktora bursu (R286-2018-621; SN. ); İsveç Araştırma Konseyi (2017-03389; CDM); İsveç Kanser Derneği, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj ve 190007; CDM); Alman Kanser Yardımı (Deutsche Krebshilfe; RR); ve Danimarka Kanser Derneği (R204-A12454; RR).

Burada yer alan tüm prosedürler Kopenhag Üniversitesi'nde deneysel tıbbı düzenleyen etik komite tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve Danimarka ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu protokolü göstermek için, 8-12 haftalık dişi BALB / cJ fareleri ve 11 haftalık bir MMTV-PyMT dişi fare kullandık.
NOT: Hücreden çıkarımlı ECM iskelesinin bakteriyel kirlenmesini önlemek en iyi görüntüleme sonucunu verir ve uzun süreli numune depolamaya izin verir. Bu nedenle tüm adımları steril tutmak önemlidir. Bu nedenle, dikiş, mikro dikiş, çözeltiler, boru, Luer konektörleri ve kateterler de dahil olmak üzere tüm aletler ve cerrahi malzemeler steril olmalıdır. Polistiren tepsi de dahil olmak üzere yüzeyler% 70 etanol ile dezenfekte edilmeli ve perfüzyon tercihen laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler oda sıcaklığında gerçekleşir.
1. Ölüm sonrası mikrocerrahi
<ol><li>Fareyi bir CO2 odası kullanarak ötenazi edin.<ol>
<li>Fareyi 4 L odaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca 0,2 L / dk'dan başlayarak% 100 CO2 ile doldurmaya başlayın, 3 dakika sonra 0,8 L / dk'lık bir akışa ulaşana kadar artırın. Fare ilk 2 dakika boyunca bilinçsiz kalmalı ve daha sonra solunum sona ermelidir (genellikle yaklaşık 5 dakika, ancak akış gerektiği gibi korunabilir). Bir sonraki adıma geçmeden önce ölümü onaylayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toraksı, karnı ve farenin arkasını saç kesme makinesi ile tıraş edin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. Tıraş, görüntüleme veya biyokimyasal analiz için numunelerde saç varlığı nedeniyle eser sayısını büyük ölçüde azaltır.</li>
	<li>Fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, ön ve arka ayaklarının yanı sıra başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin.</li>
	<li>Mayo düz desen makası kullanarak, alt menekbüler bölgeden alt karın bölgesine kadar uzanan bir kese kesisi ile cerrahi erişim kurun ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.</li>
	<li>Mikrocerrahi makas kullanarak, göğüs duvarının her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesin.</li>
	<li>Düz desenli makas kullanarak, sternumu önceki kesiler boyunca kesin ve daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek bir sternotomiyi tamamlayın, ardından kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın.</li>
	<li>Yuvarlak uçlu mikro-toparlamalar (veya Dumont mikro-toparlamaları) kullanarak, timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarır. Bu büyük gemileri ortaya çıkardı.</li>
	<li>Koter kullanarak, azalan kava damarını dağla ve düz desen makası kullanarak yemek borusunu kesin.</li>
	<li>Keskin mikro-tokaps kullanarak, brakiyofalik damarları ve brakiyofalik, sol ortak karotis ve sol subklaviyen arterleri alttaki dokudan ayırarak ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırın.</li>
	<li>Mikro iğne tutucu, keskin mikro-emişler ve 9-0 dikiş kullanılarak brakiyofalik, sol ortak karotid ve sol subklaviyen arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirilir.</li>
	<li>Braşiyofalik damarları dağla.</li>
	<li>Boyun kaslarını ve trakeayı açığa çıkarmak için orta hat boyunca submandibuler tükürük bezlerini ayırın. Krikotiroid ligamenti ortaya çıkarmak için kasları ayırın. Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın.</li>
	<li>Trakeaya 27 G kateter takın ve trakea dalları bronşlara girene kadar hassas bir şekilde itin (yani katetere direnç karşılanana kadar, sonra 3 mm geri çekilin). Bronşları bozmamaya dikkat edin. 6-0 dikiş kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına 3 dikiş yerleştirin.</li>
	<li>Fareyi 12. İnen aort omurgaya doğru ön olarak çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Alt yarısını ayırın.</li>
	<li>Aortu retrograd katetere ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. 9-0 dikiş kullanarak, kateter ucunun 5 mm altından başlayarak aortun etrafına 4 dikiş yerleştirin.</li>
</ol>2. Hücreden Arındırma
<ol><li>Silikon boru ve Luer konektörleri kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca 200 μL / dak'ta deiyonize su ile perfuse. Hücreden arındırma sırasında bu akış hızını koruyun.</li>
	<li>Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0,5 sodyum deoksikolat (DOC) olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.</li>
	<li>Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ile değiştirin ve 8 saat boyunca perfuse yapın.</li>
	<li>SDS ve DOC'u 24 saat boyunca yıkamak için bir gecede deiyonize su ile perfuse.</li>
	<li>Hücreden çıkarılan kalp ve akciğerleri kavisli bir makas kullanarak toraksa bağlayarak resect yapın ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ve 4 °C'de 0.3 μM sodyum azit ile deiyonize su içeren steril bir kriyo-tüpte saklayın. İskele biyokimyasal analiz için kullanılacaksa (örneğin, kütle spektrometresi), sıvı nitrometrede snap dondurun.</li>
</ol>3. İmmünasyon
<ol><li>Görüntülemeyi planlayın: birincil antikoru (veya antikorları) ve floresan konjuge sekonder antikorların kombinasyonunu birbirleriyle eşleşecek ve floresan mikroskobun lazer hatlarına uyacak şekilde belirleyin.</li>
	<li>Örneği% 6 (v / v) eşek serumu içeren bir kriyotüme batırarak engelleyin - bir gecede% 3 (w / v) sığır serumu albümin (BSA).</li>
	<li>PBS'de %3 eşek serumunda primer antikor (veya antikorlar) ile 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS'de (PBST) 20% ara 0,05'te her seferinde 1 saat boyunca 5 kez yıkayın.</li>
	<li>PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor (veya antikorlar) ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>%0,05'te (PBST) 1 saat boyunca 5 kez yıkayın. Her yıkama arasında 1 saat bekleyin.</li>
	<li>İyonize su ekleyin ve doğrudan ışıktan 4 °C'de saklayın. Bu noktada, iskele görüntüye hazırdır.</li>
</ol>4. Görüntüleme
<ol><li>Numuneyi cam tabanlı bir tabağa yerleştirin ve iki damla saklama çözeltisi (PBS veya deiyonize su) ile nemlendirin.</li>
	<li>Hedefi hazırlayın. Suya daldırma hedefi kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.</li>
	<li>Bilgisayar kontrolüne geçin. Lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektör dalga boylarını, kazancı, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın ve edinmeye başlayın. Doku penetrasyonunu artırmak ve ışık, ağartma ve doku hasarının saçılmasını en aza indirmek için multifotoğraf lazer ekscitasyon kullanmanızı öneririz.</li>
</ol>5. Hematoksilin-eosin lekeleme
<ol><li>Ötenazili bir fareden 1 akciğer lobundan alıntı.</li>
	<li>10 mm x 10 mm x 5 mm kriyoold yerleştirin ve yaklaşık 500 μL OCT bileşiği ile örtün.</li>
	<li>Kuru buzda (-70 °C) dondurun ve numuneyi bu sıcaklıkta saklayın.</li>
	<li>2.5. adıma göre işlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar.</li>
	<li>En büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyoold yerleştirin ve adım 5.2'de belirtildiği gibi OCT bileşiği ile örtün.</li>
	<li>Kuru buzda (-70°C) dondurun ve numuneyi başka türlü gerekli olana kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir.</li>
	<li>Bölüm donmuş doku blokları -20 °C'de 5 μm kalınlığında bir kriyostatta ve yapışkan cam slaytlara bölümler yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Hava kuruyana kadar (yaklaşık 20 dk) kaymaları oda sıcaklığına alın.</li>
	<li>Kısa bir süre PBS'ye dalın ve slaytları PBS'de % 4 paraformaldehit içine 15 dakika daldırarak düzeltin. PBS'de bir kez 5 dakika, ardından iki kez damıtılmış suda 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Mayer'in hematoksilin çözeltisinin içine 10 dakika daldırın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.</li>
	<li>Bir Coplin kavanozunda damıtılmış su altında 10 dakika yıkayın.</li>
	<li>7 dakika boyunca eosin çözeltisinin içine dalın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.</li>
	<li>%70 etanol ve %96 ve %100 etanol 30 saniye boyunca kısa bir süre daldırma ile fazla Eozin ve susuzluk gidermek için% 50 etanol daldırın. Xylene'e birkaç kez daldırın.</li>
	<li>Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak parçası yerleştirin.</li>
	<li>Slaytları kimyasal bir kaputun altında bir gecede kurumaya bırakın.</li>
	<li>Slayt tarayıcıdaki slaytları tarayın.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Doku ajitasyonuna dayalı desellülerizasyon teknikleri ECM yapısını değiştirerek ECM yapı analizi için uygun hale getirir4. Trakea aort gibi anatomik bir yol kullanarak perfüzyon desellülerizasyonu kılcal yatağa veya terminal alveollere ulaşmayı sağlar ve hücreden çıkarıcı ajanların organ boyunca teslimini kolaylaştırır. Dokuyu hücreden çıkarmak için zwitteriyonik, anionik ve iyonik olmayan deterjanların kullanımı4,5,6 bildirilmi...

ECM, çok hücreli bir organizmadaki tüm hücreleri barındıran, organlara şekil veren ve yaşam boyunca hücre davranışını düzenleyen protein ve glikanlardan oluşan üç boyutlu bir ağdır1. Yumurta döllenmesinden itibaren, hücreler ECM'yi oluşturur ve yeniden şekillendirir ve buna karşılık kesinlikle kontrol edilir. Bu protokolün amacı, fareler memeli patofizyolojisinde en çok kullanılan model organizma olduğu için fare ECM'yi analiz etmenin ve haritalamak için bir yol açmaktır.
Bu yöntemin gelişimi, metastaz ilişkili yerel ECM2'yi karakterize etme ve izole etme ihtiyacından kaynaklanmıştır. Tümörler uygun anatomik vaskülerizasyondan yoksun olduğundan ve fareler nispeten küçük organizmalar olduğundan, mikrocerrahi prosedürler aortu geriye dönük kateterize etmek için tasarlanmıştır, bu nedenle tümöre (örneğin pulmoner damarlara) giden ana damarın dolaşımını izole eder, böylece reaktif akışına odaklanır ve tümör desellülerizasyonuna izin verir. Bu yöntem, bağışıklık sistemi baskılanabilen ve görüntülenebilen korunmuş bir yapıya2 sahip ECM iskeleleri üreterek ecm yapısının altmikron detaylı olarak haritalandırılmasını sağlar. Bu protokolü gerçekleştirmek için, kullanımına potansiyel bir sınırlama oluşturabilecek cerrahi ve mikrocerrahi becerileri (diseksiyon, mikrosütür ve kateterizasyon) kazanmak gerekir. Bilgimize göre, bu yöntem yerel ECM yapı görüntüleme analizi için en son teknolojiyi temsil eder2,3.

<table><tbody><tr><td><güçlü>MİKROCERRAHİ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 sütür, üçgen kesitli iğne (Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 mikro-sütür (Safil)</td><td>B Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Adson forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Dişli Adson forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo mikro iğne tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>no. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 fare ötenazisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su (Milli-Q IQ 7000, Ultra saf laboratuvar su sistemi)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık polistiren tepsi (~30 &kat; 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu (Greenough, iki kollu deveboynu ile)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>Çift uçlu mikrospatula</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont mikroforseps (iki)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>45 derece ile Dumont mikroforseps; ipuçları (iki)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Saç kesme makineleri</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Halsey iğne tutucu (tungsten karbür çeneli)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>İntravenöz 24-gauge kateter (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>İntravenöz 26-gauge kateter (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>Mayonez makas (sert kesim, düz)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>Halkalı uçlu mikroforseps (iki)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yaylı makas (Vannas, kavisli)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>İğneler (27 gauge; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu (steril) veya cerrahi peçete&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tırtıklı makas (CeramaCut, düz)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Spatula (Freer-Yaşargil)</td><td>Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (1 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021001</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngaları (10 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>Tendon makası (Walton)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-kobay IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 eşek anti-tavşan IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albümin sığır fraksiyonu V, standart derece, liyofilize)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV poliklonal antikor (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>Ana bilgisayar: tavşan</td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, 10 kez;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Ev sahibi: keçi</td></tr><tr><td>Periostin poliklonal antikoru (Manuel Koch'tan nazik bir hediye. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td><td>Ev sahibi: kobay</td></tr><tr><td>Neşter tek kullanımlık bıçak no.11 (adet. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>Serum (normal eşek serumu)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Dedektörler (hibrid dedektör (Leica, HyD S modeli) ve fotoçoğaltıcı tüpler (PMT'ler; )&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Floresan ışık kaynağı&nbsp;</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroskop (ters multifoton mikroskobu)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Objektif (lambda mavisi, 20&0 kez;, 0.70 sayısal açıklık (NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; İki foton Ti&ndash; safir lazer (Spectra-fizik, Mai Tai DeepSee modeli)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Beyaz ışık lazeri (WLL)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DECELLULARIZATION</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol (mutlak alkol %99,9); mutlak alkol, deiyonize su kullanılarak %70'e (hacim/hacim) ayarlanmalıdır&nbsp;</td><td>Erik</td><td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su (Milli-Q IQ 7000, Ultra saf laboratuvar su sistemi)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Luer-to-tubing erkek bağlantı parçaları (1/8 inç)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, 10&times;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa (12 kanallı)</td><td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru (2 mm iç çap ve 4 mm dış çap ile)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat (DOC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H & E BOYAMA</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%4 PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>%96 Etanol</td><td>Erik</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Erik</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lameller (24x50mm; 1000 adet)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 adet)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX montaj ortamı</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y çözeltisi alkollü% 0.5</td> <td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Tüy mikrotom bıçağı paslanmaz çelik, C35 (50 adet)</td> <td>Pfm medikal</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Superfrost Plus slaytlar (25 x 75 mm; 144 adet)</td> <td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>Mayers hematoksilen</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT bileşiği</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Slayt tarayıcı (Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

murine kardiyopulmoner kompleksinin hücreden arındırılması

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Burada fare kalbi ve akciğerleri için bir hücreden arındırma protokolü sunuyoruz. ECM topolojisini ve bileşimini analiz etmek için kullanılabilecek yapısal ECM iskeleleri üretir. Kalbi ve akciğerleri hücreden çıkarıcı ajanlarla boğmak için ötenazili bir farenin trakeasını ve aortlarını kateterize etmek için tasarlanmış mikrocerrahi bir prosedüre dayanmaktadır. Hücreden çıkarıcı kardiyopulmoner kompleks daha sonra yapısal ECM proteinlerinin yerini ortaya çıkarmak için immünositize edilebilir. Tüm prosedür 4 günde tamamlanabilir.
Bu protokolden kaynaklanan ECM iskeleleri boyutsal bozulmalardan arındırılmıştır. Hücrelerin yokluğu, ECM yapılarının 3D olarak mikrokron çözünürlüğe kadar yapısal olarak incelenmesini sağlar. Bu protokol, fibrozis ve kanserin fare modelleri de dahil olmak üzere 4 haftalık kadar genç farelerden sağlıklı ve hastalıklı dokulara uygulanabilir ve kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM tadilatını belirlemenin yolunu açar.

Kardiyopulmoner desellülerizasyon Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerlerin yanı sıra aort arkı gibi ek dokular hücrelerden arındırılmış olacaktır. Desellülerizasyon, ecm iskelelerinin hematoksilin-eozin lekelenmesi (Şekil 1) ile doğrulanabilir. Bu iskeleler taze organların boyutlarını korur ve çözünmeyen ECM yapısı bozulmadan kalır2. Şekil 2 , fare kardiyo-pulmoner k...

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Bu protokol hücre dışı matrise açılan kapıdır. Karmaşıklık ve yapısı mikron ölçeğine kadar iniyor. Bu nedenle, bu yöntemin temel avantajı, yapısal bütünlüğünü koruyan hücre dışı bir matris elde etmeyi mümkün kılmaktadır, böylece biyokimyasal ve anatomik analizin yolunu açmaktadır.Prosedürü gösterenler, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten ve Maria Rafaeva, şu anda laboratuvarımda ve Chris Madsen ve laboratuvarımda bulunan ve Lund Üniversitesi'nde çalışmaya devam eden. Ötenazili farenin toraksını, karnını ve sırtını saç kesme makinesi ile tıraş darak başlayın. Bölgeyi% 70 etanol ile dezenfekte edin.Daha sonra fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, dört uçlu arka uzuvlarını, başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin. Mayo düz desen makası kullanarak, alt mandibular bölgeden alt karın bölgesine doğru akan bir kese kesisi yapın ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.Daha sonra torasik duvarın her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesmek için mikrocerrahi makas kullanın. Sternumu önceki kesiler boyunca düz desen makası ile kesin. Daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek sternotomiyi tamamlayın.Kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın. Timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarmak için yuvarlak uçlu mikro toparlamalar kullanın. Ve yemek borusunu mikro makasla kesin.Brachiocephalic veinleri ve brakiyofalik arteri keskin mikro torptiklerle ayırın. Daha sonra ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırmak için sol ortak karotis ve sol subklavyan arterleri alttaki dokudan ayırın. Brakiyofalik sol ortak karotis ve sol subklavyan arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirmek için bir mikroneedle tutucu ve keskin mikroasipler ve dokuz oh dikiş kullanın, brakiyofalik damarları dağlayın.Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın. Nefes borusuna 27 ölçer kateter takın ve bronşlara trakea dallarına kadar hassas bir şekilde itin, bronşları bozmamaya dikkat edin. Altı O dikişi kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına üç dikiş yerleştirin.12. torasik omurun yüksekliğinde fareyi bölümlendirin, alçalan Aorta omurgaya doğru ön sırada çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Aort katerazörünü retrograd olarak katetere alın ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. Bir dikiş kullanarak, kateter ucunun beş milimetre altından başlayarak Aorta'nın etrafına dört dikiş yerleştirin.Silikon boru ve daha düşük konektörler kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca dakikada 200 mikrolitre deiyonize su ile perfuse. Daha sonra perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.5 DOC olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.Ertesi gün, perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 SDS olarak değiştirin ve sekiz saat boyunca perfüzyon. Daha sonra SDS ve DOC'u yıkamak için 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüzyona uğrayın.Dokuyu steril bir kriyo tüpünde% 1 penisilin streptomisin ve dört santigrat derecede 0.3 mikromoler sodyum azit ile deiyonize suda saklayın. İmmün lekelenme yapmak için örneği bir gecede %6 eşek serumu ve %3 BSA içeren bir kriyo tüpüne inkübe ederek engelleyin. Daha sonra PBS'de % 3 eşek serumunda 24 saat primer antikor ile kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra numuneyi PBST'de beş kez yıkama başına bir saat yıkayın. PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından yıkamaları PBST'de tekrarlayın.İyonize suyu ekleyin ve numuneyi doğrudan ışıktan dört santigrat derecede saklayın. Örneği görüntülemek için, cam bir alt tabağa yerleştirin ve iki damla damla çözeltisi ile nemlendirin. Hedefi belirleyin ve floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.Bilgisayar kontrolüne geçin, lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektörlerin dalga boyunu, kazancını, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. Z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın, sonra edinmeye başlayın. Bir akciğer lobu ötanazili bir fareden geçirin ve 10'a 10 ila 5 milimetre kriyo kalıbına yerleştirin.Yaklaşık 500 mil oct bileşiği ile örtün ve kuru buz üzerinde dondurun. Numuneyi o sıcaklıkta tut. İşlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar, en büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyo kalıbına yerleştirin ve OCT bileşiği ile örtün.Numuneyi kuru buz üzerinde dondurun ve aksi gerekmedilene kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir. Donmuş doku bloklarını eksi 20 santigrat derecede beş mikrometre bölümüne bölümlere ayırdık için kriyostat kullanın.Ve bölümleri yapışkan cam slaytlara yerleştirin. Slaytları hava kuruyana kadar oda sıcaklığına aktarın. Slaytları PBS'ye kısaca daldır, ardından 15 dakika boyunca PBS'de %4 paraformaldehit.PBS'de bir kez, daha sonra iki kez damıtılmış suda yıkama başına beş dakika yıkayın. Slaytları Myer'in hematoksilin çözeltisinde 10 dakika boyunca daldırin. Daha sonra, slaytları 10 dakika boyunca damıtılmış su altında bir Copeland kavanozunda yıkayın ve yedi dakika boyunca eosin çözeltiye daldırin.Xylene'e birkaç kez daldırın. Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak kayması yerleştirin. Slaytları kimyasal bir başlık altında bir gecede kurumaya bırakın ve ardından bir slayt tarayıcısında tarayın.Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerler ile NX dokusu hücrelerden arındırılmış olacaktır. Hücreden arındırma, ECM iskelelerinin hematoksilin eozin boyanma ile doğrulanabilir. İskeleler taze organların boyutlarını korur ve insoliable ECM yapısı bozulmamış.ECM iskeleleri geçirgenliğin ve hafif penetrabilliğin arttığını gösterdi. Bu protokolün motorlu bir mikroskop aşaması ile kullanılması, tüm montaj örneklerinin alt mikron çözünürlüğünde üç boyutlu karo görüntülemesini sağlar. Komple decellurizasyon elde etmek için ilgi organlarına doğru akıştan kaçınmak önemlidir.Damarların mikrocerrahi diseksiyonu ve ligasyonu etkili olmalıdır. Ve aynı zamanda yerel VCM yapısını korumak için hedef dokulara saygı gösterin. Bu prosedürden sonra, iskeleler yapısal ECM proteinleri için zenginleştirilecek ve kütle spektrometresi veya doku mühendisliği için kullanılabilir.Bu teknik, hücre dışı matrisin yüksek çözünürlüklü haritalandırılmasına giden yolu açmaktadır.

decellularization-of-the-murine-cardiopulmonary-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, deterjanların damar sistemi boyunca antegrad perfüzyonu uygulanarak hücreden arındırılmış hücre dışı matris veya ECM iskeleleri üretme yöntemi gösterilmektedir. Yapısal ECM iskeleleri daha sonra kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM yeniden modellemesini analiz etmek için kullanılabilir.

Kardiyopulmoner Kompleks Decellularizasyon: Murin Modelinden Kalp ve Akciğerleri Hücreden Arındırma Tekniği

Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Tüm organ hücresizleştirme, rejeneratif tıp için kullanılabilecek doğal biyolojik iskeleler üretir. Tüm akciğerlerin hücrelerden arındırıldığı ve daha sonra vasküler dolaşımı ve sıvı ortam ventilasyonunu kolaylaştıran bir biyoreaktörde yetişkin kök hücreler ve endotel hücreleri ile tohumlandığı insan dışı bir primat akciğer rejenerasyonu modelinin tanımı sunulmaktadır.

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Bu çalışmalarda, biz rejeneratif çalışmalarda kullanılmak üzere yeni, yenidoğan murin kardiyak iskeleleri için bir yöntem sağlamak.

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Kardiyak hücre dışı Matriks (ECM) anahtar süreçlerinde doku ve organların fizyolojik hayatı boyunca remodeling kalıcı süre alacak moleküllerinin karmaşık bir ağdır. Fetal ve yetişkin kalplerin standart decellularization 3D bir bağlamda yerel mimari ve biyomekanik özellikleri yakalayarak karşılaştırmalı deneysel çalışmalar hem dokuların izin verir.

Vitro çalışmalar için 3D benzeri platformlar olarak Fetal ve yetişkin kalp doku karşılaştırılabilir Decellularization Explants

Bu yöntem, decellularization karmaşık bir solid organ ozmotik şok ve perfüzyon en az organ matris bozulma ile iyonik deterjan dayalı basit bir protokol kullanarak sağlar. Gerçek zamanlı akış dinamiği ve hücresel enkaz çıkış izleme ile basınçlı bir kese içinde insan kalpleri bir roman decellularization tekniği oluşmaktadır.

Decellularization ters yönde bir basınçlı bir kese içinde bütün insan kalp

Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

Bu protokol, murin pulmoner venlerinin mikroskopi kılavuzluğunda izolasyonunu ve immünofloresan boyamasını gösterir. Sol atriyum, pulmoner venler ve ilgili akciğerleri içeren doku örnekleri hazırlıyoruz ve bunları kardiyak Troponin T ve Connexin 43 için boyuyoruz.

Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması

Bu makale, hücreden arındırma ve yeniden hücreselleştirme yöntemleri kullanılarak biyomühendislik ürünü fare akciğerlerinin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır. Ayrıca sonraki ortotopik akciğer naklini de detaylandırır.

Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

Keşfedin, fare kalp ve akciğerlerinden hücreden arındırılmış ekstraselüler matris iskeletleri oluşturma yöntemini. Bu protokol, biyokimyasal ve anatomik analizler için yapısal bütünlüğü koruyan ECM elde etmeyi sağlar.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

Daha fazla video keşfet