CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

Bu protokol, araştırmacıların B hücrelerindeki bir geni hassas bir şekilde ortadan kaldırmasına, o genin işlev kaybı etkilerini incelemesine veya araştırma veya terapötik amaçlar için kullanılabilecek stabil trans gen ekspresyonu için bir trans gen eklemesine olanak tanır. Bu yöntemin temel avantajı, B hücrelerinin yüksek verimlilikle kolay ve hassas bir şekilde tasarlanmasını mümkün kılan evrensel bir platform sağlamasıdır. Bu yöntem, rekombinant antikorları veya enzimleri eksprese etmek için B hücrelerini tasarlamak ve daha sonra bu B hücrelerini enfeksiyonları veya enzimopatileri tedavi etmek için transfer etmek için kullanılabilir.

Başlamak için, B hücrelerini 37 santigrat derece su banyosunda çözün. Beklerken, iki mililitre önceden ısıtılmış FBS'yi steril, 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. B hücreleri tamamen çözüldükten sonra, numuneye hemen bir mililitre önceden ısıtılmış FBS damla damla ekleyin.

Oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Numuneyi yeniden süspanse etmek için nazikçe pipetleyin ve tüm hacmi damla şeklinde iki mililitre önceden ısıtılmış FBS içeren konik bir tüpe aktarın. Steril PBS ile hacmi 15 mililitreye getirin, ardından tüpü kapatın ve iki ila üç kez hafifçe ters çevirin.

Numuneyi beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin, ardından hücre peletini bozmadan süpernatanı atın. Peletleri bir mililitre önceden dengelenmiş B hücresi genleşme ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Toplam hücre sayısı yaklaşık 10 ila yedinci hücre olmalıdır.

Hücreleri, önceden dengelenmiş B hücresi genleşme ortamının 20 mililitresini içeren bir şişeye aktarın. Hücrelerin nihai konsantrasyonu, mililitre başına yaklaşık beş kez 10 ila beşinci hücre olmalıdır. Şişeyi bir doku kültürü inkübatöründe dikey olarak inkübe edin.

Transfeksiyon reaksiyonu başına bir mikrogram kimyasal olarak modifiye edilmiş sgRNA'yı 1.5 mikrogram kimyasal olarak modifiye edilmiş streptococcus pyogenes Cas9 çekirdek mRNA'sı ile karıştırarak CRISPR/Cas9 transfekte edici substratı hazırlayın. Kontrol için, sekiz tüp şeridinden oluşan 0.2 mililitrelik bir tüpe sgRNA yerine bir mikrolitre TE tamponu ekleyin. Bir elektroporatörü açın ve nükleer enfeksiyon reaktiflerini hazırlayın.

Transfeksiyon reaksiyonu başına 1 milyon B hücresini sayın ve steril bir konik tüpe aktarın. Steril PBS ile hacmi 15 mililitreye getirin ve beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın.

Hücreleri 10 mililitre steril PBS ile yeniden süspanse edin ve beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin, ardından hücre peletini bozmadan süpernatanı tamamen atın. Hücre peletine 1 milyon B hücresi başına 0,5 mikrogram kimyasal olarak modifiye edilmiş GFP mRNA ekleyin. Pelet, 1 milyon B hücresi başına 20 mikrolitre birincil hücre transfeksiyon reaktifi ile yeniden süspanse edin ve beş ila altı kez pipetleyerek hafifçe karıştırın.

Transfeksiyon reaksiyonu başına 20.5 mikrolitreyi CRISPR / Cas9 reaktifi içeren 0.2 mililitrelik tüplere aktarın. Karıştırmak ve tüm hacmi bir transfeksiyon küvetine aktarmak için bir kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Sıvının küvetin altını kapladığından emin olmak için küveti tezgahın üzerine hafifçe kapatın ve vurun.

Transfeksiyon için elektroporatör üzerinde insan birincil B hücresi protokolünü kullanın. Elektrikli hücreleri küvette oda sıcaklığında 15 dakika dinlendirin. Daha sonra önceden dengelenmiş B hücresi genleşme ortamının 80 mikrolitresini küvetteki transfeksiyon reaksiyonuna aktarın.

Küveti 30 dakika boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Numunenin tüm hacmini küvetten karıştırmak ve bir mililitre B hücresi genleşme ortamı içeren 48 oyuklu bir doku kültürü plakasının uygun bir kuyusuna aktarmak için hafifçe boru kafasına birkaç kez sıkın. Hücrelerin nihai konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon hücre olmalıdır.

Bir gen knock-in deneyi gerçekleştirerek, 500.000 enfeksiyon çokluğunda rekombinant adeno ilişkili tip-altı viral vektörü uygun iyi içeren elektroporatlı hücrelere aktarın. Plakayı 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Nakavt deneyinde, B hücresi sayısı, elektroporasyondan 24 saat sonra hem kontrol hem de CD19 nakavt örneklerinde hücre geri kazanımında hafif bir azalma ile %80'den fazla canlı hücre gösterdi.

B hücreleri, akış sitometrisi ve gelgit analizi için transfeksiyondan sonraki beşinci günde toplandı. Kontrol ve nakavt numunelerinin temsili dağılım grafikleri sırasıyla %14 ve %95 CD19 negatif hücre gösterdi ve bu da nakavt numunelerinde CD19 ekspresyonunda önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Genomik dizilemenin kromatogramları, CD19 nakavt B hücrelerinde çift tepe noktaları gösterdi, bu da CRISPR/Cas9 aracılı çift sarmallı kırılmalar sonrası nükleotidlerin eklenmesini veya delesyonlarını gösterdi.

Nakavt numunelerinin kromatograflarının Indel analizi, akış sitometrisi ile tespit edilen yüzde CD19 protein kaybı ile tutarlı olan CD19 lokusunda yüksek bir indel oluşumu yüzdesi gösterdi. Knock-in deneyinden elde edilen B hücreleri, mühendislik sonrası 12. günde toplandı. Dağılım grafikleri, RNP ile birlikte rekombinant adeno ilişkili tip altı viral vektörü alan örnekteki EGFP pozitif hücrelerin %64'ünü gösterirken, kontrol ve sadece vektör örneklerinde sırasıyla hiç EGFP pozitifliği gözlenmedi veya minimal EGFP pozitifliği gözlendi.

Bir kavşak PCR amplifikasyonu, knock-in numunede 1.5 kilobaz çifti amplikon gösterdi ve ne kontrol ne de sadece vektör numunesinde hiçbir PCR ürünü gözlenmedi. Hücre sayımları, mühendislik sürecinin, knock-in numunesindeki hücre geri kazanımını kontrol veya yalnızca vektör numunelerinden daha fazla etkilediğini gösterdi. Bununla birlikte, tüm numuneler mühendislikten sonraki üç gün içinde hızla toparlandı.

Bu prosedür aynı zamanda, B hücresi genomundaki tek nokta mutasyonlarını indüklemek veya düzeltmek için tek baz çiftlerini değiştirmek için baz düzenleyici ajanları tanıtmak için de kullanılabilir. Ayrıca, erken durdurma kodonlarını tanıtmak veya ekleme bölgelerini değiştirmek için de kullanılabilir, bu da kromozomal translokasyon riski olmadan çoklu gen nakavtlarına izin verir. Bu teknik geliştirilmeden önce, insan B hücrelerinin mühendisliği, diğer daha zorlu gen mühendisliği yaklaşımlarının kullanımını sorgulayacaktı.

Bu teknik daha kolay, daha ucuz ve daha hızlı bir alternatiftir. Klinik kullanım için hücre tedavisi ürünlerini sentezlemek için de potansiyel olarak kullanılabilir.