Yumurtalık Dokularında Bakterilerin Karakterizasyonu ve Fonksiyonel Tahmini
October 23rd, 2021
Kanserli ve nonkanseröz yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek amacıyla immünhistokimya lekelenme ve 16S ribozomal RNA geni (16S rRNA geni) dizilimi yapıldı. Bakterilerin bileşimsel ve fonksiyonel farklılıkları BugBase ve Göz ardı Edilmeyen Durumların Yeniden İnşası (PICRUSt) ile Toplulukların Filogenetik İncelemesi kullanılarak tahmin edildi.
Bu protokol yumurtalık dokularındaki bakterileri keşfetmek ve işlevlerini tahmin etmek için tasarlanmıştır. İmmünohistokinometri lekeleme ve 16S rRNA dizilimi, kanserli ve kanserli olmayan yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek için kullanılmıştır. Bakterilerin telafi edici ve fonksiyonel farklılıkları, göz ardı edilmeyen günlerin yeniden inşası ile boP'lar ve toplulukların hücresel-genetik araştırması kullanılarak tahmin edilir.
Protokolümüz yumurtalık dokularından in situ bakteri çıkarmayı amaçlamaktadır. Her türlü tümördeki bakterileri keşfetmek için de kullanılabilir. Protokolümüzün temel avantajları, kolay ve kullanışlı olması, hemen hemen her laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.
Sonuçları almak da hızlı. Protokoldeki uygulama sırasında, tesis dışındaki tümör dokuları hariç tutulması önemlidir. Bu nedenle, bu protokoldeki tüm prosedürlerin steril olması gerekir.
Ameliyat sırasında, resektize edilmiş yumurtalıkları bir çift yeni steril cımbızla kabaca bir santimetre kalınlığında doku örneklerine ayırın. Tüm prosedür sırasında başka bir şeye dokunmaktan kaçının. Ayırmadan sonra, numuneyi steril bir tüpe çıkarın ve iletim için sıvı nitrojene koyun.
Örnekleri eksi 80 santigrat derecede koruyun. Dokuları formalin ile sabitle ve sonra parafin ile gömün. Bu protokol burada duraklatılabilir.
Dokular daha uzun süre muhafaza için oda sıcaklığında tutulabilir. Daha fazla adım atmak için numuneleri beş mikrometre seri bölümünde kesin. Sonra, örnekleri kurutun.
De-parafin ve numunelere rehidrasyon yapın. Antijeni almak için EDTA tamponunda 10 dakikalık bir mikrodalga tedavisi gereklidir. Numuneleri %0,3 hidrojen içeren PBS'ye batırın.
Endojen peroksidaz aktivitesini durdurmak için 20 dakika peroksidize edin. Antikor EMA'yı LPS çekirdeğinde 1'den 300'ün üzerinde bir konsantrasyonda gerçekleştirin. Ve dört santigrat derecede bir gece boyunca devam ettir.
Bakterileri keşfetmek için, HRP'nin varlığını tespit etmek için bir DAP substrat kiti kullanın. Bir üreticinin talimatlarına dayanarak, HRP polimer, anti-tavşan antikor kullanın. Antikorların tamamen birleşmesi için masa konsantratörü kullanın.
Birleştirici olmayan antikorları ortadan kaldırmak için PBS kullanın. Kimyasal lekelerinizi üreticinin talimatlarına göre yapın, ardından numuneleri su altına yıkayın. Örneklere dehidrasyon yapın.
İmzalayarak örnekleri takım elbise. Ve üreticinin protokolüne göre görüntüleme Pro Plus Prepare kitaplığını kullanarak örnek olarak girin. Gene özgü diziler ve Illumina adaptörü çıkınt nükleotid dizilerinden oluşan astar desenini uygulayın.
RRNA gen dizilerinde bakteriyel 16'ların V4 bölgesinin doğum oranlarını yükseltmek için amplicon PCR kullanarak DNA örnek girdisinden şablonu güçlendirin. Reaksiyon karışımını PCR ürününden çıkarmak için Mag-Bind RxNPure Plus manyetik boncukları kullanın. Dizinlenmiş PCR amplifikasyonu ikinci kez gerçekleştirin.
Kitaplığı denetlemek için Agilent 2200 TapeStation'ı kullanın. Kitaplığı ölçmek için QuantiFluor dsDNA Sistemini kullanın. 600 döngüsü ile v3 standart akış hücresi yaklaşık 100.000 eşleştirilmiş uç üretir.
2 kere 300 taban 3. Kitaplıklar normalleştirilir, havuza alındı ve sıralandı. Her numunenin ham oranları Trimmomatic tarafından sıralama kalitesine göre filtrasyona uğrar.
Astar ve bağdaştırıcı dizilerinin her ikisi de kaldırılmalıdır. Hem çifti hem de nitelikleri 25'ten düşük olan sıra okumaları kısaltılmalıdır. QIIME yazılım paketi ile 16s rRNA'yı analiz edin.
OTU'ları oluşturmak için dizileri toplayın ve benzerlik kesintisi %97 OPU'lar için, göreli bolluk her örnekte hesaplanmalıdır. Tüm dizileri sıralamak için RDP eğitim kümesinde bulunan bir Bayes sınıfılandırıcısı kullanın. OTU ile, dizilerin ana tutarlılığına sahip bir sınıflandırma OTU'lara atanır.
ATU'lar, örnek grup bilgilerine dayanarak Silva veritabanına hizalanır. Alfa çeşitliliği ve UniFrac tabanlı ana koordinat analizi gerçekleştirin. Bakterilerin özelliklerinin ilgili sunumlarını tahmin etmek için BugBase kullanın.
PICRUSt'ta bir metagenom'un işlevsel bileşimini tahmin edin. İzleme verilerinin ve referans genomları içeren bir veritabanının kullanımı ile STAMP yazılımı yardımıyla her grup arasındaki farklı işlevleri analiz edin. Sonucu hesaplamak için bir istatistik yazılımı kullanın.
İstatistiksel önemin göstergesi 0,05'ten az olarak ayarlanmalıdır. Yaş ve eşlik içeren kafa karıştırıcı faktörleri Öğrencinin t-test'ine göre hesaplayın. Ki-kare testi ile menopoz durumunu, hipertansiyon ve diyabet öyküsünün hesapını hesaplayın.
Mann-Whitney U testi ile yumurtalık bakteri taksonunun sayısını hesaplayın. Bu çalışmaya 16 hasta kayıt yaptırdı. BugBase, tahmin edilen metagenomların analizini uygulamak için kullanıldı.
Anti-bakteriyel LPS antikor kullanarak yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve immünhistokimyası. Bu rakam kanser ve kontrol gruplarında bakteriyel zenginliği ve çeşitliliği göstermektedir. 16S rRNA dizilimi ile ortaya çıktı.
Rakamlar tür indeksi gözlenir. Chao1 endeksi, ACE endeksi, Shannon endeksi, Evenness endeksi, Simpson endeksi sırasıyla. Phyla'nın göreceli bolluğu ve yumurtalık örneklerinde en bol 12 bakteri türü bu şekilde gösterilmiştir.
Şekil A, B, C ve D.Kontrol grubundaki hastaların yumurtalıklarındaki panelin ve yumurtalık kanseri grubundaki göreceli bolluk anlamına gelir. Kontrol hastalarının ve yumurtalık kanseri grubunun yumurtalıklarındaki en bol on iki bakteri türünün göreceli bolluğu. Bu, PCoA ve Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vacuolata'nın göreceli bolluğu kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanıdır.
Şekil A, PCoA kullanılarak kümelenen en yaygın olanları gösterir. PC1 ve PC2 x ve y ekseni üzerine çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki örneğe eşittir.
Mavi daire denetim grubundaki bir örneğe eşittir. Yumurtalık kanseri grubundan alınan örnekler kontrol grubundaki diğer örneklerden ayrılabilir. Şekil B, PCoA kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanları gösterir.
PC1 ve PC2 x ve y ekseninde çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki bir örneğe eşittir. Mavi düz daire, rahim miyomu olan hastadan alınan bir örneğe eşittir.
Ve mavi içi boş daire rahim adenomiyozu olan bir hastanın örneğine eşittir. Şekil C, Anoxynatronum sibiricum'un göreceli bolluğunu göstermektedir. Şekil D, Methanosarcina vacuolata'dır.
Bu rakam, tahmin edilen metanemiklerin BugBase analizidir. Kanser grubundaki yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve oksidatif stres tolerans fenotipi kontrol grubundan daha güçlüdür. Bu rakam PICRUSt analizi ile kanser ve kontrol grupları arasındaki KEGG yol boşluğundan önemli ölçüde farklıdır.
Numunelerimizi aldığımızda, bir çift yeni steril cımbıza ihtiyaç vardır. Numunelere olası kontaminasyona dikkat edin. Bu bakteri saha dışı tümör dokuları azmi büyük ölçüde etkileyebilir.
Denetim grubunu her adıma ayarlamak tercih edilir. Potansiyel kontaminasyonun etkisini azaltmak için.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, kanserli ve kanserli olmayan over dokularında bakterileri saptamak ve ayırt etmek için tasarlanmıştır. Bakterilerin yapısal ve işlevsel farklılıklarını tahmin etmek için immünohistokimyasal boyama ve 16S rRNA sekanslaması kullanılır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Onkoloji
- Immunoloji
Arka Plan
- Over dokularında bakteri bileşimini anlamak, kanser biyolojisi hakkında bilgiler sağlayabilir.
- İmmünohistokimyasal boyama, doku örneklerinde bakterilerin görselleştirilmesini sağlar.
- 16S rRNA sekanslaması, bakteri türlerini tanımlamak için güçlü bir araçtır.
- BugBase ve PICRUSt gibi tahmine dayalı araçlar, genetik bilgilerine dayanarak bakteri işlevlerini çıkarsamak için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Over dokularında bakterileri çıkarmak ve tanımlamak.
- Kanserli ve kanserli olmayan dokulardaki bakteri popülasyonlarını karşılaştırmak.
- Tanımlanmış bakterilerin işlevsel rollerini tahmin etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Doku görselleştirmesi için immünohistokimyasal boyama.
- Bakteri tanımlamak için 16S rRNA gen sekanslaması.
- Bakteri bileşimini tahmin etmek için BugBase.
- Bakteri arasındaki işlevsel farklılıkları tahmin etmek için PICRUSt.
Ana Sonuçlar
- Kanserli ve kanserli olmayan over dokularında farklı bakteri popülasyonlarının tanımlanması.
- Fonksiyonel tahminler, iki doku türü arasında metabolik yeteneklerde farklılıklar olduğunu gösterir.
- Protokol, çeşitli tümör türleri için kullanılmaya uyarlanabilir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, over kanserinde bakterilerin rolünü anlamak için bir çerçeve sağlar.
- Yöntemler erişilebilirdir ve çoğu laboratuvarda uygulanabilir.
- Dahası araştırmalar, bu bakteri topluluklarının kanser ilerlemesindeki etkilerini inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
