Yumurtalık Dokularında Bakterilerin Karakterizasyonu ve Fonksiyonel Tahmini
23 Ekim 2021
Kanserli ve nonkanseröz yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek amacıyla immünhistokimya lekelenme ve 16S ribozomal RNA geni (16S rRNA geni) dizilimi yapıldı. Bakterilerin bileşimsel ve fonksiyonel farklılıkları BugBase ve Göz ardı Edilmeyen Durumların Yeniden İnşası (PICRUSt) ile Toplulukların Filogenetik İncelemesi kullanılarak tahmin edildi.
Bu protokol yumurtalık dokularındaki bakterileri keşfetmek ve işlevlerini tahmin etmek için tasarlanmıştır. İmmünohistokinometri lekeleme ve 16S rRNA dizilimi, kanserli ve kanserli olmayan yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek için kullanılmıştır. Bakterilerin telafi edici ve fonksiyonel farklılıkları, göz ardı edilmeyen günlerin yeniden inşası ile boP'lar ve toplulukların hücresel-genetik araştırması kullanılarak tahmin edilir.
Protokolümüz yumurtalık dokularından in situ bakteri çıkarmayı amaçlamaktadır. Her türlü tümördeki bakterileri keşfetmek için de kullanılabilir. Protokolümüzün temel avantajları, kolay ve kullanışlı olması, hemen hemen her laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.
Sonuçları almak da hızlı. Protokoldeki uygulama sırasında, tesis dışındaki tümör dokuları hariç tutulması önemlidir. Bu nedenle, bu protokoldeki tüm prosedürlerin steril olması gerekir.
Ameliyat sırasında, resektize edilmiş yumurtalıkları bir çift yeni steril cımbızla kabaca bir santimetre kalınlığında doku örneklerine ayırın. Tüm prosedür sırasında başka bir şeye dokunmaktan kaçının. Ayırmadan sonra, numuneyi steril bir tüpe çıkarın ve iletim için sıvı nitrojene koyun.
Örnekleri eksi 80 santigrat derecede koruyun. Dokuları formalin ile sabitle ve sonra parafin ile gömün. Bu protokol burada duraklatılabilir.
Dokular daha uzun süre muhafaza için oda sıcaklığında tutulabilir. Daha fazla adım atmak için numuneleri beş mikrometre seri bölümünde kesin. Sonra, örnekleri kurutun.
De-parafin ve numunelere rehidrasyon yapın. Antijeni almak için EDTA tamponunda 10 dakikalık bir mikrodalga tedavisi gereklidir. Numuneleri %0,3 hidrojen içeren PBS'ye batırın.
Endojen peroksidaz aktivitesini durdurmak için 20 dakika peroksidize edin. Antikor EMA'yı LPS çekirdeğinde 1'den 300'ün üzerinde bir konsantrasyonda gerçekleştirin. Ve dört santigrat derecede bir gece boyunca devam ettir.
Bakterileri keşfetmek için, HRP'nin varlığını tespit etmek için bir DAP substrat kiti kullanın. Bir üreticinin talimatlarına dayanarak, HRP polimer, anti-tavşan antikor kullanın. Antikorların tamamen birleşmesi için masa konsantratörü kullanın.
Birleştirici olmayan antikorları ortadan kaldırmak için PBS kullanın. Kimyasal lekelerinizi üreticinin talimatlarına göre yapın, ardından numuneleri su altına yıkayın. Örneklere dehidrasyon yapın.
İmzalayarak örnekleri takım elbise. Ve üreticinin protokolüne göre görüntüleme Pro Plus Prepare kitaplığını kullanarak örnek olarak girin. Gene özgü diziler ve Illumina adaptörü çıkınt nükleotid dizilerinden oluşan astar desenini uygulayın.
RRNA gen dizilerinde bakteriyel 16'ların V4 bölgesinin doğum oranlarını yükseltmek için amplicon PCR kullanarak DNA örnek girdisinden şablonu güçlendirin. Reaksiyon karışımını PCR ürününden çıkarmak için Mag-Bind RxNPure Plus manyetik boncukları kullanın. Dizinlenmiş PCR amplifikasyonu ikinci kez gerçekleştirin.
Kitaplığı denetlemek için Agilent 2200 TapeStation'ı kullanın. Kitaplığı ölçmek için QuantiFluor dsDNA Sistemini kullanın. 600 döngüsü ile v3 standart akış hücresi yaklaşık 100.000 eşleştirilmiş uç üretir.
2 kere 300 taban 3. Kitaplıklar normalleştirilir, havuza alındı ve sıralandı. Her numunenin ham oranları Trimmomatic tarafından sıralama kalitesine göre filtrasyona uğrar.
Astar ve bağdaştırıcı dizilerinin her ikisi de kaldırılmalıdır. Hem çifti hem de nitelikleri 25'ten düşük olan sıra okumaları kısaltılmalıdır. QIIME yazılım paketi ile 16s rRNA'yı analiz edin.
OTU'ları oluşturmak için dizileri toplayın ve benzerlik kesintisi %97 OPU'lar için, göreli bolluk her örnekte hesaplanmalıdır. Tüm dizileri sıralamak için RDP eğitim kümesinde bulunan bir Bayes sınıfılandırıcısı kullanın. OTU ile, dizilerin ana tutarlılığına sahip bir sınıflandırma OTU'lara atanır.
ATU'lar, örnek grup bilgilerine dayanarak Silva veritabanına hizalanır. Alfa çeşitliliği ve UniFrac tabanlı ana koordinat analizi gerçekleştirin. Bakterilerin özelliklerinin ilgili sunumlarını tahmin etmek için BugBase kullanın.
PICRUSt'ta bir metagenom'un işlevsel bileşimini tahmin edin. İzleme verilerinin ve referans genomları içeren bir veritabanının kullanımı ile STAMP yazılımı yardımıyla her grup arasındaki farklı işlevleri analiz edin. Sonucu hesaplamak için bir istatistik yazılımı kullanın.
İstatistiksel önemin göstergesi 0,05'ten az olarak ayarlanmalıdır. Yaş ve eşlik içeren kafa karıştırıcı faktörleri Öğrencinin t-test'ine göre hesaplayın. Ki-kare testi ile menopoz durumunu, hipertansiyon ve diyabet öyküsünün hesapını hesaplayın.
Mann-Whitney U testi ile yumurtalık bakteri taksonunun sayısını hesaplayın. Bu çalışmaya 16 hasta kayıt yaptırdı. BugBase, tahmin edilen metagenomların analizini uygulamak için kullanıldı.
Anti-bakteriyel LPS antikor kullanarak yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve immünhistokimyası. Bu rakam kanser ve kontrol gruplarında bakteriyel zenginliği ve çeşitliliği göstermektedir. 16S rRNA dizilimi ile ortaya çıktı.
Rakamlar tür indeksi gözlenir. Chao1 endeksi, ACE endeksi, Shannon endeksi, Evenness endeksi, Simpson endeksi sırasıyla. Phyla'nın göreceli bolluğu ve yumurtalık örneklerinde en bol 12 bakteri türü bu şekilde gösterilmiştir.
Şekil A, B, C ve D.Kontrol grubundaki hastaların yumurtalıklarındaki panelin ve yumurtalık kanseri grubundaki göreceli bolluk anlamına gelir. Kontrol hastalarının ve yumurtalık kanseri grubunun yumurtalıklarındaki en bol on iki bakteri türünün göreceli bolluğu. Bu, PCoA ve Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vacuolata'nın göreceli bolluğu kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanıdır.
Şekil A, PCoA kullanılarak kümelenen en yaygın olanları gösterir. PC1 ve PC2 x ve y ekseni üzerine çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki örneğe eşittir.
Mavi daire denetim grubundaki bir örneğe eşittir. Yumurtalık kanseri grubundan alınan örnekler kontrol grubundaki diğer örneklerden ayrılabilir. Şekil B, PCoA kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanları gösterir.
PC1 ve PC2 x ve y ekseninde çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki bir örneğe eşittir. Mavi düz daire, rahim miyomu olan hastadan alınan bir örneğe eşittir.
Ve mavi içi boş daire rahim adenomiyozu olan bir hastanın örneğine eşittir. Şekil C, Anoxynatronum sibiricum'un göreceli bolluğunu göstermektedir. Şekil D, Methanosarcina vacuolata'dır.
Bu rakam, tahmin edilen metanemiklerin BugBase analizidir. Kanser grubundaki yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve oksidatif stres tolerans fenotipi kontrol grubundan daha güçlüdür. Bu rakam PICRUSt analizi ile kanser ve kontrol grupları arasındaki KEGG yol boşluğundan önemli ölçüde farklıdır.
Numunelerimizi aldığımızda, bir çift yeni steril cımbıza ihtiyaç vardır. Numunelere olası kontaminasyona dikkat edin. Bu bakteri saha dışı tümör dokuları azmi büyük ölçüde etkileyebilir.
Denetim grubunu her adıma ayarlamak tercih edilir. Potansiyel kontaminasyonun etkisini azaltmak için.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kanserli ve kanserli olmayan over dokularındaki bakterileri in situ olarak keşfetmek ve ayırt etmek için tasarlanmıştır. Bakterilerin kompozisyonel ve fonksiyonel farklarını öngörmek için immünohistokimyasal boyama ve 16S rRNA dizileme yöntemleri kullanılmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Onkoloji
- İmmünoloji
Arka Plan
- Over dokularındaki bakteriyel kompozisyonun anlaşılması, kanser biyolojisine dair içgörüler sağlayabilir.
- İmmünohistokimya boyaması, doku örneklerindeki bakterilerin görselleştirilmesine olanak tanır.
- 16S rRNA dizileme, bakteriyel türlerin tanımlanması için güçlü bir araçtır.
- BugBase ve PICRUSt gibi öngörücü araçlar, genetik bilgilerine dayanarak bakteriyel fonksiyonların çıkarımını yapabilir.
Çalışmanın Amacı
- Over dokularından bakterileri ekstrakte etmek ve tanımlamak.
- Kanserli ve kanserli olmayan dokulardaki bakteri popülasyonlarını karşılaştırmak.
- Tanımlanan bakterilerin fonksiyonel rollerini öngörmek.
Kullanılan Yöntemler
- Doku görselleştirme için immünohistokimyasal boyama.
- Bakteriyel tanımlama için 16S rRNA gen dizileme.
- Bakteriyel kompozisyonu tahmin etmek için BugBase.
- Bakteriler arasındaki fonksiyonel farklılıkları tahmin etmek için PICRUSt.
Ana Sonuçlar
- Kanserli ve kanserli olmayan over dokularındaki farklı bakteriyel popülasyonların belirlenmesi.
- Fonksiyonel öngörüler, iki doku tipi arasında metabolik kapasite farkları olduğunu göstermektedir.
- Protokol, çeşitli tümör tipleriyle kullanıma uygun şekilde adapte edilebilir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, bakterilerin over kanserindeki rolünü anlamak için bir çerçeve sunmaktadır.
- Yöntemler erişilebilirdir ve çoğu laboratuvarda uygulanabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu bakteriyel toplulukların kanser ilerlemesi üzerindeki etkilerini inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Over dokularındaki mikrobiyal varlığın anlaşılması, tümör biyolojisini etkileyebilecek mikroçevresel faktörleri ortaya çıkararak kanser hedef hipotezlerinin risklerini azaltmaya yönelik artan bir ihtiyaca cevap vermektedir. Bu protokol, biyofarma Ar-Ge çalışmalarının onkogenik yolaklara bakteriyel katkıları değerlendirmesine olanak tanıyarak erken keşif aşamasında mekanistik içgörüyü destekler. Dokuyla ilişkili mikropları tespit etmek ve fonksiyonel olarak öngörmek için standartlaştırılmış bir yöntem sunarak, translasyonel güvenilirliği daha yüksek olan hedeflerin önceliklendirilmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kanserli ve kanserli olmayan yumurtalık dokularında farklı bolluklarda bulunan bakterileri tanımlayarak tümör mikroçevresi hipotezlerini sorgular.
- Operasyonel Değer: Bakteriyel varlığı in situ olarak mekansal olarak çözümlemek ve nicelleştirmek için immünohistokimya ve 16S rRNA dizileme kullanır.
- Öngörücü Değer: Kanser fenotipleriyle bağlantılı olan patojenite ve oksidatif stres toleransı gibi fonksiyonel fenotiplerile çıkarmak için BugBase ve PICRUSt kullanır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Örnek grupları arasında karşılaştırmalı mikrobiyal profilleme için uygun, standartlaştırılmış ve nicelendirilebilir 16S rRNA sekanslama çıktıları üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Gerçek dokuyla ilişkili sinyallerin güvenilir tespitini sağlamak için kontaminasyon kontrollerini ve steril doku işlemeyi içerir.
- Ölçeklenebilirlik: Farklı tümör türlerinde daha geniş uygulama için yüksek hacimli sekanslama ve biyoinformatik iş akışlarıyla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: İnsan yumurtalık kanseri dokularındaki mikrobiyal imzaları tespit ederek insan patofizyolojisiyle olan ilişkisini destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Mikrobiyal değişimlerin normalden malign durumlara geçişinin boylamsal takibine olanak tanır ve biyobelirteç keşfine temel oluşturur.
- Mekanistik Risk Azaltma: Tümör ilerlemesini veya terapötik yanıtı modüle edebilecek fonksiyonel mikrobiyal katkıları (örneğin, metabolik yolaklar) öngörür.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle immüno-onkoloji ve mikroçevre odaklı programlarda, hedef hipotez oluşturma aşamasından preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Belirli bakterilerin tümör dokularında zenginleşip zenginleşmediğini ve kanser fenotipleriyle ilişkili olup olmadığını ortaya çıkararak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Hedef önceliklendirmesi için multi-omik veri setleriyle entegre edilebilen, tekrarlanabilir ve nicel mikrobiyal profilleme verileri sağlar.
- Analitik: BugBase ve PICRUSt aracılığıyla fonksiyonel tahminler sunarak, gruplar arasındaki metabolik ve fenotipik potansiyellerin karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hasta kaynaklı dokularda diferansiyel bolluk ve fonksiyonel çıkarım yoluyla mikrobiyal saptamayı kanser biyolojisiyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış bir iş akışı kullanarak diğer solid tümörlere uyarlanabilir ve kanserler arası mikrobiyom çalışmalarına imkan verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mikrobiyal varlığı, kanserle ilişkili yolaklardaki fonksiyonel fenotiplerle ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Çoğu araştırma laboratuvarında uygulanabilir olan erişilebilir teknikler (IHC, 16S sekanslama, biyoinformatik) kullanır.
- Stratejik Değer: Keşif sürecinin başlarında mikrobiyal karıştırıcı faktörleri veya tümör biyolojisinin modülatörlerini belirleyerek devam/dur kararlarına bilgi sağlar.
- Portföy Etkisi: İlaç etkinliğini etkileyebilecek mikroçevresel değişkenleri hesaba katarak risk ayarlı hedef seçimine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Sekanslama ve fonksiyonel öngörüler için histoloji, moleküler biyoloji ve biyoinformatik alanlarında uzmanlık gerektirir.
- Steril doku işlemleri, PCR cihazları, sekanslama platformları ile QIIME, Trimmomatic ve STAMP gibi araçların kullanımını gerektirir.
- Kontaminasyonu en aza indirmek ve mikrobiyal verilerin karşılaştırılabilirliğini sağlamak için merkezler arası standartlaştırılmış protokoller gerektirir.
- Diğer organ sistemlerine uygulandığında, konak doku değişkenliği ve düşük biyokütle zorlukları dikkate alınmalıdır.
- Düşük bolluğa sahip topluluklardaki saptama hassasiyeti ve fonksiyonel çıkarımlar için referans veri tabanlarına olan bağımlılık ile sınırlıdır.
