CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Hedeflenen mutajenez ancak son zamanlarda kum sineklerine uyarlanmıştır ve bu vektör böceklerde ilgilenilen genlerin rolünü ve işlevini anlamak için çok önemli bir tekniktir. Embriyo mikroenjeksiyonu, böcek genomu düzenlemede çok önemli bir adımdır, ancak üzerinde çalıştığınız türlere, bizim durumumuzda kum sineklerine uyarlanması gerekir. Diğer böcek türleri ile karşılaştırıldığında, kum sineği embriyoları çok küçüktür.

Gelişmesi uzun zaman alır ve özellikle nem seviyesine karşı hassastır. Enjeksiyondan beş gün önce, rutin koloni bakımı için dişi kum sineklerini kanla besleyin. Beslenmeden bir gün sonra, kanla beslenen dişileri 100 ila 150 kişilik gruplar halinde yan portlu alçı bölmelerde yakalayın ve sinekleri% 30 sükroz çözeltisi ile besleyin.

Kan beslemesinden sonraki beşinci günde, yumurtlama haznesine beyaz bir parça nemli filtre kağıdı yerleştirin. Ve alçı bölmesinden yaklaşık 10 dişiyi toplamak ve yumurtlama odasına aktarmak için bir ağız aspiratörü kullanın. 30 ila 60 dakika sonra Petri kabını ve filtre kağıdını yumurta haznesinden çıkarın.

Buna dikkat ederek, filtre kağıdı nemli kalır ve bu süre boyunca yeni dişi ve embriyo grupları toplamaya devam eder. Tüm embriyolar toplandığında, yaklaşık 50 embriyoyu tek tek nemli siyah filtre kağıdı parçalarına dikkatlice aktarmak için bir stereo mikroskop ve çok ince bir boya fırçası kullanın, mikroskop slaytlarına yerleştirin, üzerine slayt başına tek bir kapak kayması. Embriyoları yüzmeden veya kapak fişlerinin altına emilmeden nemli tutmak için her filtre kağıdına yeterince su ekleyin ve embriyoları kapak fişlerine karşı hizalayın.

Yumurta toplamanın başlamasından iki ila üç saat sonra, diseksiyon mikroskobu altına bir slayt yerleştirin ve filtre kağıdının arka ucuna dikkatlice su eklemek için boya fırçasını kullanın. 0,5 ila bir mikrolitre yük enjeksiyon karışımını bir mikro enjeksiyon iğnesine geri yükleyin ve iğneyi, mikroskop altında inç kare başına 30 pound'a ayarlanmış bir pnömatik enjeksiyon kontrolörüne monte edin. İğne ucundaki havayı dışarı atmak için tetiğe basın.

Hava serbest bırakıldığında, tutma basıncını yavaşça artırın. Enjeksiyon materyali akmaya başladığında, iğneden akan enjeksiyon karışımının noktasının hemen altına gelene kadar tutma basıncını azaltın ve iğneyi ilk embriyonun yanına yerleştirin. Embriyonun arkasındaki kapak kızağını geri durdurucu olarak kullanarak, iğneyi nazikçe çıkarmadan önce embriyoya az miktarda enjeksiyon karışımı verin.

İğneyi çıkardıktan hemen sonra, iğne ucundan geri doldurulmuş herhangi bir materyali çıkarmak için enjektöre basın ve bir sonraki embriyoya geçin. Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, çalışan bir çetele tutmak için enjekte edilen embriyoların sayısını sayın ve kapak kaymasının yüzmesi için filtre kağıdına su ekleyin. Ardından, kapak kaymasını embriyolardan çekerken filtre kağıdını yerinde tutmak için bir prob kullanın.

Ve kaydıraktaki fazla suyu temizlemek için filtre kağıdıydı. Filtre kağıdını yeni bir Petri kabındaki nemli filtre kağıdı yığınına aktarın ve her embriyoyu kalabalık olmadan nemlendirilmiş, küçük boyutlu alçı bölmelerine manuel olarak aktarın. Ardından bölmeleri bir ekranla örtün ve bölmeleri 26 derecelik bir inkübatörde% 70 nemde saklayın.

En başarılı mikroenjeksiyon protokollerinde olduğu gibi, enjekte edilen embriyoya uygun iyi bir mikroenjeksiyon iğnesi önemlidir. İyi keskin iğneler, materyalin enjeksiyon sonrası kaçmasına izin vermeden embriyoya kolayca nüfuz edebilir. Çekilen iğneler çok uzun bir konikliğe sahip olmamalıdır.

Aksi takdirde, iğnenin lümeni, konikliğin büyük bir kısmı için çok daralır ve enjeksiyon basıncının, malzemeyi iğneden geçirmeye yetecek kadar yüksek olmasını zorlaştırır. Enjeksiyon sonrası sağlıklı olan yetiştirilen embriyolar korunmalı, hasarlı mantar kontamine olmuş, kurumuş veya deforme olmuş embriyolar atılmalıdır. Enjeksiyon sonrası yetiştirilen bireylerde potansiyel mutant aleller, beklenen kesme bölgelerini çevreleyen bölgenin PCR analizi ile tanımlanabilir.

Enjekte edilen embriyolar kullanılarak mutant hat oluşturulduktan sonra, genotipleme PCR, homozigot mutant kardeş çaprazlamalarının tanımlanmasına izin verir. Nazik olmak ve embriyoları manipüle etmek ve enjekte etmek için iyi bir iğneye sahip olmak çok önemlidir. Ve tüm prosedür boyunca embriyoların hidratlandığından emin olmak için.

Bazı sineklerde genom düzenlemesi daha yeni başlıyor. Bu teknik, daha karmaşık genom modifikasyon stratejileri tarafından takip edilmesi gereken bir ilk adımdır.