Name: CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Öğrenin Phlebotomus papatasi kum sineği embriyolarına CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyonu ile hedefli mutagenez yöntemini. Bu teknik vektör böceklerinde gen fonksiyonlarını incelemek için genetik mühendisliğinde kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Vanessa Meldener-Harrell'e makalenin eleştirel okuması için teşekkür eder.

Farelerin kum sineği beslemesi için kan kaynağı olarak kullanılması, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol, NIAID, NIH Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası LPD 68E) tarafından onaylandı. Omurgasızlar NIH yönergeleri kapsamında değildir.
1. İğne hazırlama (Şekil 1)
<ol><li>Meuti ve Harrell19'daaçıklandığı gibi iğneleri ve eğimi çekin. Kısaca, borosilikat cam kılcal damarları kullanarak çift aşamalı bir cam mikropipette çekme üzerine iğneler çekin.</li>
	<li>Ekstra ince bir taş kullanarak mikropipette eğimli ıslak eğimli iğneleri keskinleştirin.</li>
</ol>2. Embriyo toplanması ve mikromanipülasyonu (Şekil 2)
<ol><li>Enjeksiyon gününden beş gün önce, koloni bakımı için rutin olarak gerçekleştirilen kan besleme kumu dişileri siner. Kum sineği kolonilerinin yetiştirme prosedürleri ve gerekli malzeme hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Avukat ve ark.1 Böcekleri tüm gelişimleri sırasında% 70 nemde ve 26 ° C'de inkübatörlerde saklayın.<ol>
<li>Bir gün kan besleme sonrası, kanla beslenen dişileri yan portlu alçı kaplarda 100-150 kişilik gruplar halinde yakalayın. Dişileri, koloni bakımı için olağan olan şeker çözeltisi (% 30 sakkaroz - küçük bir pamuk toplarını ıslatmak için yeterli hacim) ile besleyerek koruyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kan besleme sonrası 2-3 gün, alçı kapları nemlendirmeyin. Dişileri kuru bir substrat üzerinde tutmak erken yumurtlamayı önleyecektir, çünkü dişiler nemli bir ortama yumurta bırakmayı tercih eder.</li>
	<li>Kan besleme sonrası 5. günde embriyo toplama, mikromanipülasyon ve mikroenjeksiyonu gerçekleştirin. Yumurtlama odasına nemli bir filtre kağıdı sokun. Yeni döşenmiş embriyolar tam olarak gelişmiş bir korona sahip değildir ve beyaz görünür. Beyaz embriyoların görselleştirilmesini kolaylaştırmak için işlem sırasında siyah filtre kağıdı kullanın.</li>
	<li>Küçük bir grup dişiyi alçı tencereden bir ağız aspiratörü kullanarak yan bağlantı noktalarından yumurtlama odasına aktarın. Nemli bir substratın (filtre kağıdı) varlığı dişileri oviposit'e teşvik eder.</li>
	<li>30-60 dakika sonra, filtre kağıdını odadan yeni döşenen embriyolarla dikkatlice alın. Filtre kağıdını ve embriyoları petri kabında 3 saate kadar saklayın. Bu süre zarfında, nemli kalmasını sağlamak için filtre kağıdının nem seviyesini düzenli olarak değerlendirin. Bu süre zarfında, yeni kadın gruplarıyla 2.4 ila 2.6 adımlarını tekrarlayın ve mümkün olduğunca çok embriyo toplayın.</li>
	<li>Enjeksiyon için mikroskop slaytları hazırlayın: yumurtaları çok ince bir boya fırçasıyla tek tek manuel olarak toplayın ve cam kapaklı bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirilmiş başka bir nemli siyah filtre kağıdına dikkatlice aktarın.<ol>
<li>Filtre kağıdına su ekleyin, embriyoları nemli tutmaya yetecek kadar, ancak kapak kapağından uzaklaşmalarına veya örtünün altına çekilmelerine neden olmaz. Embriyoları kapak çizgisine göre hizala. Kapak, enjeksiyon sırasında yumurtaların yuvarlanmasını önleyen bir backstop görevi görür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embriyo Enjeksiyonları (Şekil 3)
<ol><li>Enjeksiyonları yumurta toplamanın başlamasından 2,5 ila 3 saat sonra başlatın. Enjeksiyonları oda sıcaklığında ve ortam laboratuvarı nemsinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Hizalanmış embriyoların yeterli suya sahip olduğundan emin olun, böylece nemli tutulurlar. NOT: Enjeksiyonlar sırasında embriyoların nemli tutulması kritik öneme sahiptir. Enjeksiyon işlemi sırasında nemli değillerse, iğne embriyoyu delmede sorun yaşadığı için enjeksiyonlar zorlaşır. Doğru miktarda su, embriyoların etraflarında bir menisküs su olduğu noktadır, ancak kapak kapağı suyun üzerinde yüzerek embriyoların örtünün altına itmesine neden olmaz. Enjeksiyonlar sırasında embriyoların etrafındaki su miktarını izlemek önemlidir. Embriyoları nemli tutmak için gerektiği kadar su ekleyin.</li>
	<li>Bir fırçayı suyla ıslatarak ve suyu filtre kağıdının arka ucuna aktararak dikkatlice su ekleyin. Bu şekilde su eklemek, suyun yavaş ve kontrollü bir şekilde eklenmesini sağlar, böylece embriyoları nemli tutacak kadar eklenir. Çok fazla su embriyoların hizadan çıkmasına neden olabilir ve bu da embriyoların enjekte edilmesine neden olabilir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon iğnesine geri yük enjeksiyonu karışımı. Elle çizilmiş bir borosilikat iğne dolgusu kullanarak iğneye yaklaşık 0,5 ila 1 μL enjeksiyon karışımı ekleyin, jel yükleme pipet uçları da kullanılabilir. Enjeksiyon karışımı, ticari rekombinant Cas9 proteini (300 ng/μL) ile karıştırılmış belirli bir lokusu hedeflemek için tasarlanmış bir veya birkaç kılavuz RNA'dan (her biri 80 ng/μL) oluşur.</li>
	<li>30 psi'deki enjeksiyon basıncından başlayarak, iğnenin ucundaki havayı dışarı çıkarmak için enjeksiyon tetiğine basın. Bu, enjeksiyon karışımını iğnenin ucuna zorlayacak ve enjeksiyon karışımının akmasını sağlayacaktır. Bu noktada, enjeksiyon malzemesi akmaya başlayana kadar tutma/sabit basıncı yavaşça artırın, ardından iğneden akan enjeksiyon karışımının noktasının hemen altında olacak şekilde tutma/sabit basıncı geri çekilin. Kapılı ayar, embriyoya girmek için az miktarda malzeme görülebilmesi için yeterli enjeksiyon malzemesi sağlamalıdır. NOT: Drosophila ve sivrisinekler için kullanılan diğer protokollere benzer şekilde halokarbon yağı altında kum sineği embriyolarının enjeksiyonu başlangıçta test edildi, ancak bu enjeksiyonların hayatta kalma yüzdesi çok düşüktü. Sağkalım, yukarıda açıklandığı gibi nemli filtre kağıdına enjeksiyonlara geçilerek iyileştirildi.</li>
	<li>İğneyi embriyonun yanına yerleştirin. Embriyonun arkasındaki kapak kapağını, iğnenin embriyoyu delmesine yardımcı olacak bir backstop olarak kullanın. İğneyi hafifçe çıkarmadan önce embriyoya az miktarda enjeksiyon karışımı sunun.</li>
	<li>İğne çıkarıldıktan hemen sonra, iğne ucundan doldurulan herhangi bir malzemeyi çıkarmak için enjektöre basın. Bu, iğnenin tıkanmasını önlemeye yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Bir sonraki embriyoya geçin. Her enjeksiyon arasında filtre kağıdının nemli olduğundan ve iğnenin tıkanmamasını sağlayın.</li>
	<li>Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, bir çetele tutmak için enjekte edilen embriyo sayısını sayın.</li>
	<li>Kapak kapağının yüzmesi için filtre kağıdına su ekleyerek kapak kapağını çıkarın. Bu noktada, kapak sapını enjekte edilen embriyolardan uzaklaştırmak için bir parmak kullanılırken filtre kağıdını yerinde tutmak için bir prob (ucuna yapışmış böcek pimli ahşap aplikatör çubuğu) kullanın.</li>
	<li>Kapak kapağı çıkarıldıktan sonra fazla suyu filtre kağıdından silin.</li>
</ol>4. Enjeksiyon sonrası yetiştirme (G0) (Şekil 4)
<ol><li>Filtre kağıdını, nemi korumak için bir Petri kabına yerleştirilmiş birkaç nemli filtre kağıdı katmanının üzerine embriyolarla birlikte aktarın. Diğer embriyoları enjekte etmek için gereken süre boyunca embriyoları burada tutun. Embriyolar bunun gibi en fazla 3 saat tutulabilir. Enjeksiyondan sonra yavaşça kahverengiye dönerler.</li>
	<li>Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, manuel olarak daha önce nemlendirilmiş küçük boyutlu alçı kaplara aktarın. Bireyler arasında olası mantar kirlenmesini önlemek için her tencereye çok fazla embriyo koymayın ve aralarındaki mesafeyi koruyun. Saksıları bir ekranla örtün ve tüm gelişimleri sırasında% 70 nemde ve 26 ° C'de inkübatörlerde tutulan kum sineği koloni yumurtaları için tipik olarak yapılacağı gibi saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonraki 1. günde, tüm hasarlı ve ölü embriyoları bir boya fırçasıyla çıkarın. Mantar kontaminasyonunu sınırlamak için enjekte edilen embriyoları içeren alçı kaplara damla damla 100 μL% 0,5 propiyonik asit ekleyin. Enjeksiyon işlemi sırasında hasar gören embriyolardan sitoplazm salınımı özellikle mantar büyümesi için elverişlidir.</li>
	<li>Alçı kapları her gün kontrol edin ve kötü veya ölü embriyoları çıkarın. Mantar varsa, tüm enfekte embriyoları çıkarın ve birkaç damla% 0.5 propiyonik asit ekleyin.</li>
	<li>Larvalar enjeksiyon sonrası 8 ila 12 gün arasında yumurtadan çıkar. Günde iki kez, yeni ortaya çıkan larvaları maksimum 5-10 kişilik gruplar halinde yeni alçı kaplara aktarın. Az miktarda yiyecek ekleyin ve yiyecekleri haftada 2-3 kez kontrol edin.<ol>
<li>Mantar kontaminasyonu riskini çok fazla artırdığı için larva yiyeceklerinin miktarını dikkatlice izleyin. Kum sineği larvaları gruplar halinde daha iyi hayatta kalırlar, ancak yeterli yiyecek yoksa yamyam olabilirler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larvalar yavruladığında, dişileri bakire olarak korumak için onları cinsiyete göre ayırın. Hayatta kalan çok kişi varsa, erkekleri atın ve sadece dişileri tutun. NOT: Hem erkekler hem de dişiler mutasyon taşıyabilir ve iletebilir. Bununla birlikte, dişiler geçilmeden önce bakire tutulmaları gerektiği için, wt böceklerini cinsiyete göre ayırmak zorunda kalmamak için sadece G0 enjekte edilen kadınları kullanmak daha kolaydır. G0 erkekleri, yetişkin hayatta kalanların sayısı düşükse yedek olarak tutulabilir ve bu durumda sıralanmış wt bakire dişilerle çiftleştirilecektir.</li>
</ol>5. Mutant alellerin seçimi ve taranır (Şekil 5)
<ol><li>G0 dişilerini bir kafeste wt erkeklerle topluca geçin. Normal koloni bakımı için yapılacağı gibi onları tamamen kanla besleyin.</li>
	<li>Kan beslemeden bir gün sonra,2-3 wt erkekli her G 0 dişisini bir ağız aspiratörü kullanarak ayrı alçı tüplere aktarın. Sinekleri her gün değiştirilen küçük bir pamuk topu üzerinde şekerle besleyin ve alçı neminin yumurtlama için uygun olduğundan emin olmak için bir şırınna su kullanın.</li>
	<li>G0 dişileri yumurta bıraktıktan sonra (G1'ekarşılık gelen), vücutlarını daha sonra genotipleme için bireysel, açıklamalı Eppendorf tüplerinde toplayın. Embriyoları genellikle wt kolonileri için yapıldığı gibi koruyun.</li>
	<li>DNA'yı G0 dişilerinden seçim yöntemiyle çıkarın.</li>
	<li>Dna'yı mutasyonların varlığı için tarayın, örneğin beklenen CRISPR kesimlerinin bölgesini çevreleyen astarları kullanarak bir PCR testi tasarlayarak.</li>
	<li>Sadece G0 dişileri tarafından serilen G1 embriyolarını dönüşüm kanıtı göstererek saklayın. Bu G1 embriyoları pupa haline geldiğinde, onları cinsiyete göre ayırın ve sadece dişileri tutun. G1 dişilerini aynı G0 dişiden wt erkeklere geçin, kanla besleyin, ardından 2-3 kadın ve 4-5 erkekten oluşan küçük gruplar halinde küçük boyutlu kaplara aktarın. NOT: Tüm G1 bireyleri benzersiz bir mutasyon taşıma şansına sahiptir, bu nedenle hayatta kalan bireylerin sayısı çok yüksek değilse, G1 dişilerini wt erkeklerle ayrı ayrı geçmek daha iyidir. Aynı tüpte bulunan farklı bir mutasyon taşıyan birkaç dişinin durumu nadirdir, ancak ortaya çıkabilir. Genotiplemeden sonra böyle bir durum görülürse, G2 soy dişileri daha sonra erkeklere ayrı ayrı çiftilmelidir. Bu çiftleşme şeması, soyda birden fazla mutasyon olasılığını önler.</li>
	<li>Yumurtlamadan sonra, G1 kadın vücutlarını toplayın ve mutasyonlar için tarayın. Sadece en az bir dişinin mutasyon kanıtı gösterdiği tüpleri saklayın.</li>
	<li>Sonraki nesiller için tek çift çapraz yapar. Yumurtlamadan sonra, ebeveynleri mutasyon varlığı için tarayın. Her iki ebeveyn de aynı mutasyon için homozigous olana kadar her nesilde tekrarlayın. Tespit edildikten sonra, homozigous mutant stoğunun kurucuları olacak.</li>
</ol>

<ol><li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42(2017).</li>
<li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9%3A+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li>
<li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li>
<li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).</li>
<li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li>
<li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li>
<li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies%3A+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li>
<li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).</li>
<li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486(2011).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li>
<li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).</li>
<li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651(2020).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes+and+Genetics+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
</ol>

Burada Phlebotomus papatasi kum sineklerinde CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen mutajensis için yakın zamanda geliştirilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon yöntemini sunuyoruz. Böcek genetik modifikasyonu için embriyo mikroenjeksiyon 1980'lerin ortalarında Drosophila'da geliştirilmiştir21 ve şimdi rutin olarak çok çeşitli böceklerde kullanılmaktadır. ReMOT 20 , 21 , 22,23 ve elektroporasyon23gibi böcekler...

Vektör kaynaklı hastalıklar sürekli evrimde önemli bir halk sağlığı tehdididir. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, çok farklı filojenik ailelere yayılmış yüzlerce vektör türü (örneğin sivrisinekler, keneler, pireler) yılda 700.000'den fazla insan ölümüyle sonuçlanan çok sayıda mikrobiyal patojenin bulaşmasından sorumludur. Vektör böcekler arasında, fenbotomik kum sinekleri (Diptera, Psychodidae), farklı coğrafi bölgelerde bulunan farklı fenotipik özellikler ve vektörel kapasiteler sergileyen kanıtlanmış 80 vektör türü ile geniş bir grup oluşturur. Leishmaniacinsinin protozoan parazitleri için vektörlerdir Yaklaşık 1.3 milyon yeni Leishmaniases vakasına ve yılda 20.000 ila 30.000 ölüme neden olan. Leishmaniases klinik sonuçları, kendi kendini sınırlayan keseli lezyonlardan tedavinin yokluğunda ölümcül olan viseral yayılıma kadar çeşitli semptomlarla çeşitlidir.
Kum sinekleri kesinlikle karasal böceklerdir. Diğer Diptera'lara kıyasla nispeten uzun olan yaşam döngüleri, sıcaklık, nem ve beslenme gibi farklı parametrelere bağlı olarak üç aya kadar sürer. Bir embriyonik evre (6 ila 11 gün), dört larva evresi (toplam 23 ila 25 gün sürer) ve bir pupal evreden (9 ila 10 gün) ve ardından metamorfoz ve daha sonra yetişkinlikten oluşur. Kum sinekleri yetiştirme için nemli ve sıcak bir ortam gerektirir. Hem erkekler hem de dişiler, çiçek nektarlarından vahşi doğada elde edilen şekerlerle beslenir. Sadece dişiler kan besleyicidir, çünkü yumurta üretimi için kan yemeğinden elde edilen proteinlere ihtiyaç duyarlar1.
Araştırmanın önemli bir odağı, aktarılabilir enfeksiyonların gelişmesine yol açan vektör / parazit etkileşimlerinin doğasını belirlemektir. Diğer vektör böceklerde olduğu gibi, kum sineklerine içsel parametrelerin, patojenleri konaklarına taşıma ve iletme yetenekleri olarak tanımlanan vektör yeterliliklerini etkilediği gösterilmiştir. Örneğin, parazit yüzey bileşenlerini tanıyan reseptörler olarak hareket eden Phlebotomus papatasi kum sineği midgut hücreleri tarafından galektinlerin ifadesi, Leishmania majör2,3için vektör yetkinliklerini doğrudan etkileyebilir. Böcek immün yanıt yolu, İmmün Yetmeme (IMD), Leishmania major4için Phlebotomus papatasi kum sineği vektör yeterliliği için de çok önemlidir. Vektör böcek immün yanıt yolları için enfeksiyöz patojenlerin iletimini kontrol etmede kritik bir rol benzer şekilde Aedes aegypti sivrisineklerinde5,6,7, tsetse fly Glossina morsitans8ve Anopheles gambiya sivrisineklerinde 9,10.
Kum sineği/Leishmania etkileşimleri çalışmaları, bu böceklerde kullanılmak üzere uyarlanmış gen ekspresyon modifikasyon yöntemlerinin eksikliği ile sınırlı olmuştur. Yakın zamana kadar sadece küçük müdahale RNA'sı (siRNA) ile gen küçültme11,12,13,14 olarak gerçekleşmiştir. Yetişkin kadınların mikroenjeksiyonu ile ilişkili mortalite ile sınırlı olan teknik, sadece nesilden nesile bulaşamayan kısmi bir işlev kaybına yol açar.
CRISPR/Cas9 teknolojisi, kum sinekleri gibi model olmayan organizmalarda fonksiyonel genomik araştırmalarda devrim yaratmamıştır. Bakteriyofajlara karşı savunma için prokaryotlardaki adaptif bağışıklık sisteminden modifiye edilmiş15,16, CRISPR Cas9 sistemi, böcekler de dahil olmak üzere üstün ökaryotik organizmalar için bir genom düzenleme aracı olarak hızla uyarlanmıştır. CRISPR/Cas9 hedefli genom düzenleme prensibi, tek bir kılavuz RNA'nın (sgRNA) belirli bir genomik lokusa tamamlayıcılığına dayanmaktadır. Cas9 çekirdeği sgRNA'ya bağlanır ve sgRNA'nın tamamlayıcı dizisiyle ilişkilendirildiği genomik DNA'da çift iplikli DNA (dsDNA) kırılması oluşturur. Cas9-sgRNA kompleksi, sgRNA'daki 17 ila 20 tamamlayıcı taban tarafından seçilen çekirgeye yönlendirilir, dsDNA kırılması daha sonra iki bağımsız yol ile onarılabilir: nonhomologous end joining (NHEJ) veya homology-directed repair (HDR)17. NHEJ onarımı, kesmenin basit bir şekilde kapatılmasını içerir, ancak genellikle küçük ekleme/silme olaylarına yol açar. HDR aracılığıyla DNA onarımı, onarım için bir şablon olarak hedef DNA ile homolojiyi paylaşan bir donör DNA molekülü kullanır. Böcekler her iki makineye de sahiptir.
CRISPR/Cas9 teknolojisi, NHEJ onarım yolundan seçilen bir çekirgede mutasyonlar oluşturabilir; veya uygun bir donör şablonuna sahip HDR yolundan darbeler veya ifade muhabirleri gibi daha karmaşık genom düzenleme stratejileri için. Kum sineklerinde, phlebotomus papatasi4'teNHEJ aracılı CRISPR aracılığıyla immün yanıt faktörü Relish'in boş mutant alelleri üretildi. Kum sineği embriyoları da başka bir çalışmada Sarı kodlayan geni hedefleyen crispr/cas9 karışımı ile enjekte edildi. Yine de, mutasyonu taşıyan hiçbir yetişkin üretilmedi18. Burada, protokolün kritik bir adımı olan embriyo mikroenjeksiyonuna odaklanarak NHEJ aracılı CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen ayrıntılı bir kum sineği hedefli mutagenezi yöntemini açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Siyah Filtre Kağıdı 4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Yaklaşık 46 X 22 mm dikdörtgenler halinde kesin. Bunlar lamel ile lamel arasına yerleştirilir ve enjeksiyon sırasında embriyolar için nemli bir taban tabakası görevi görür.</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Embriyoları hizalamak için</td><td>herhangi bir marka</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Mikroenjeksiyon kurulumunun taban tabakası Şekil 2A</td></tr><tr><td>Böcek kafesi</td><td>özel yapım veya çeşitli ticari seçenekler</td><td></td><td>Avukat, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton ve Petr Volf'u tutan ve çiftleşen yetişkinler için polikarbonat kafes. &ldquo; Flebotomin Kum Sineklerinin (Diptera, Psychodidae) Laboratuvar Kolonizasyonu ve Toplu Yetiştirme." Parazit 24. Erişim tarihi: 6 Ağustos 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Larva yemi</td><td>özel olarak tavşan</td> yemi ve tavşan dışkısı karışımını yaptı <td></td><td>Avukat, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton ve Petr Volf. " Flebotomin Kum Sineklerinin (Diptera, Psychodidae) Laboratuvar Kolonizasyonu ve Toplu Yetiştirme." Parazit 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Mikro kapaklar 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Mikroenjeksiyon iğnelerini geri doldurmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Ağız aspiratörü</td><td>John W. Hock Company</td><td>Model 612</td><td>HEPA filtreli ağız aspiratörü</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Mikroenjeksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge şirketi</td><td></td><td>ovipotlar, 125 ml veya 500 ml'lik dar kenarlı plolipropilen kavanozlardan, altta 2,5 cm'lik delikler açılarak modifiye edilmiş ve 1 cm'lik Paris sıvası ile doldurulmuştur. Avukat, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton ve Petr Volf. &ldquo; Flebotomin Kum Sineklerinin (Diptera, Psychodidae) Laboratuvar Kolonizasyonu ve Toplu Yetiştirme." Parazit 24. Erişim tarihi: 6 Ağustos 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Boya Fırçası 6-0</td><td>Herhangi Bir Sanat Malzemeleri Şirketi</td><td>n/a</td><td>Embriyoları hizalamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Propiyonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>antifungal ajan</td></tr><tr><td>Standart Cam Kılcal Damarlar</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Mikroenjeksiyon iğneleri yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Trio-MPC100 Denetleyici ve MP845 Manipülatör</td><td>Sutter Aletleri Mikroenjeksiyon</td><td></td><td>Kontrol Cihazı ve Mikromanipülatör</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 mutagenesis için kum sineği (phlebotomus papatasi) embriyo mikroenjeksiyonu

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Kum sinekleri, leishmania türleri için doğal vektörlerdir, protozoan parazitler, fetüs lezyonlarından viseral patolojiye kadar geniş bir semptom spektrumu üretir. Vektör / parazit etkileşimlerinin doğasının deşifre edilmesi, leishmania iletiminin konaklarına daha iyi anlaşılması için birincil öneme sahiptir. Kum sineği vektör yeterliliğini kontrol eden parametreler arasında (yani patojenleri taşıma ve iletme yetenekleri), bu böceklere içsel parametrelerin kilit rol oynadığı gösterilmiştir. Örneğin, böcek immün yanıtı, Leishmania'yakum sineği vektör yeterliliğini etkiler. Bu tür parametrelerin incelenmesi, bu model olmayan organizmalarda kullanılmak üzere uyarlanmış gen ekspresyon modifikasyon yöntemlerinin eksikliği ile sınırlanmıştır. Küçük müdahale RNA 'sı (siRNA) ile gen küçültme mümkündür, ancak teknik olarak zorlayıcı olmasının yanı sıra, susturma, nesilden nesile bulaşamayan sadece kısmi bir işlev kaybına yol açar. CRISPR/Cas9 teknolojisi ile hedeflenen mutagenesis yakın zamanda Phlebotomus papatasi kum sineğine uyarlandı. Bu teknik, özellikle seçilmiş bir lokusta aktarılabilir mutasyonların üretilmesine yol açarak ilgi genlerinin incelenmesine izin verir. CRISPR/Cas9 sistemi, daha sonra Homolog Olmayan Sonlandırma Birleştirme (NHEJ) veya Homology Driven Repair (HDR) tarafından onarılan hedeflenen çift iplikli DNA molalarının indüksiyonuna dayanır. NHEJ, kesmenin basit bir şekilde kapatılmasından oluşur ve sık sık küçük ekleme/silme olaylarına yol açar. Buna karşılık HDR, homolojiyi hedef DNA ile paylaşan bir donör DNA molekülünün varlığını onarım için bir şablon olarak kullanır. Burada, bugüne kadar kum sineği vektörlerine uyarlanmış tek genom modifikasyon tekniği olan NHEJ kullanılarak CRISPR/Cas9 tarafından hedeflenen mutajensis için bir kum sineği embriyo mikroenjeksiyon yöntemi sunuyoruz.

Kum sineği mutantları üretmek için burada açıklanan CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon protokolü önceki bir yayında oluşturulmuştur4. Bu yaklaşım, 540 kişiden 11'i prosedürden sağ çıktığı ve 9'unun mutant olduğu için yüksek verimli mutajensis üretti. CRISPR/Cas9 mutasyonu için kılavuzlar tasarlarken, kritik bir ilk adım, hedeflenecek alanın etrafındaki bölgeyi sıralamaktır. Sıralama şablonu, enjeksiyon için embriyo kaynağı olarak kullanılacak suştan olmalıdır. Kılavuz tasarlamak için yalnızca yayınlanan ...

Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Hedeflenen mutajenez ancak son zamanlarda kum sineklerine uyarlanmıştır ve bu vektör böceklerde ilgilenilen genlerin rolünü ve işlevini anlamak için çok önemli bir tekniktir. Embriyo mikroenjeksiyonu, böcek genomu düzenlemede çok önemli bir adımdır, ancak üzerinde çalıştığınız türlere, bizim durumumuzda kum sineklerine uyarlanması gerekir. Diğer böcek türleri ile karşılaştırıldığında, kum sineği embriyoları çok küçüktür.Gelişmesi uzun zaman alır ve özellikle nem seviyesine karşı hassastır. Enjeksiyondan beş gün önce, rutin koloni bakımı için dişi kum sineklerini kanla besleyin. Beslenmeden bir gün sonra, kanla beslenen dişileri 100 ila 150 kişilik gruplar halinde yan portlu alçı bölmelerde yakalayın ve sinekleri% 30 sükroz çözeltisi ile besleyin.Kan beslemesinden sonraki beşinci günde, yumurtlama haznesine beyaz bir parça nemli filtre kağıdı yerleştirin. Ve alçı bölmesinden yaklaşık 10 dişiyi toplamak ve yumurtlama odasına aktarmak için bir ağız aspiratörü kullanın. 30 ila 60 dakika sonra Petri kabını ve filtre kağıdını yumurta haznesinden çıkarın.Buna dikkat ederek, filtre kağıdı nemli kalır ve bu süre boyunca yeni dişi ve embriyo grupları toplamaya devam eder. Tüm embriyolar toplandığında, yaklaşık 50 embriyoyu tek tek nemli siyah filtre kağıdı parçalarına dikkatlice aktarmak için bir stereo mikroskop ve çok ince bir boya fırçası kullanın, mikroskop slaytlarına yerleştirin, üzerine slayt başına tek bir kapak kayması. Embriyoları yüzmeden veya kapak fişlerinin altına emilmeden nemli tutmak için her filtre kağıdına yeterince su ekleyin ve embriyoları kapak fişlerine karşı hizalayın.Yumurta toplamanın başlamasından iki ila üç saat sonra, diseksiyon mikroskobu altına bir slayt yerleştirin ve filtre kağıdının arka ucuna dikkatlice su eklemek için boya fırçasını kullanın. 0,5 ila bir mikrolitre yük enjeksiyon karışımını bir mikro enjeksiyon iğnesine geri yükleyin ve iğneyi, mikroskop altında inç kare başına 30 pound'a ayarlanmış bir pnömatik enjeksiyon kontrolörüne monte edin. İğne ucundaki havayı dışarı atmak için tetiğe basın.Hava serbest bırakıldığında, tutma basıncını yavaşça artırın. Enjeksiyon materyali akmaya başladığında, iğneden akan enjeksiyon karışımının noktasının hemen altına gelene kadar tutma basıncını azaltın ve iğneyi ilk embriyonun yanına yerleştirin. Embriyonun arkasındaki kapak kızağını geri durdurucu olarak kullanarak, iğneyi nazikçe çıkarmadan önce embriyoya az miktarda enjeksiyon karışımı verin.İğneyi çıkardıktan hemen sonra, iğne ucundan geri doldurulmuş herhangi bir materyali çıkarmak için enjektöre basın ve bir sonraki embriyoya geçin. Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, çalışan bir çetele tutmak için enjekte edilen embriyoların sayısını sayın ve kapak kaymasının yüzmesi için filtre kağıdına su ekleyin. Ardından, kapak kaymasını embriyolardan çekerken filtre kağıdını yerinde tutmak için bir prob kullanın.Ve kaydıraktaki fazla suyu temizlemek için filtre kağıdıydı. Filtre kağıdını yeni bir Petri kabındaki nemli filtre kağıdı yığınına aktarın ve her embriyoyu kalabalık olmadan nemlendirilmiş, küçük boyutlu alçı bölmelerine manuel olarak aktarın. Ardından bölmeleri bir ekranla örtün ve bölmeleri 26 derecelik bir inkübatörde% 70 nemde saklayın.En başarılı mikroenjeksiyon protokollerinde olduğu gibi, enjekte edilen embriyoya uygun iyi bir mikroenjeksiyon iğnesi önemlidir. İyi keskin iğneler, materyalin enjeksiyon sonrası kaçmasına izin vermeden embriyoya kolayca nüfuz edebilir. Çekilen iğneler çok uzun bir konikliğe sahip olmamalıdır.Aksi takdirde, iğnenin lümeni, konikliğin büyük bir kısmı için çok daralır ve enjeksiyon basıncının, malzemeyi iğneden geçirmeye yetecek kadar yüksek olmasını zorlaştırır. Enjeksiyon sonrası sağlıklı olan yetiştirilen embriyolar korunmalı, hasarlı mantar kontamine olmuş, kurumuş veya deforme olmuş embriyolar atılmalıdır. Enjeksiyon sonrası yetiştirilen bireylerde potansiyel mutant aleller, beklenen kesme bölgelerini çevreleyen bölgenin PCR analizi ile tanımlanabilir.Enjekte edilen embriyolar kullanılarak mutant hat oluşturulduktan sonra, genotipleme PCR, homozigot mutant kardeş çaprazlamalarının tanımlanmasına izin verir. Nazik olmak ve embriyoları manipüle etmek ve enjekte etmek için iyi bir iğneye sahip olmak çok önemlidir. Ve tüm prosedür boyunca embriyoların hidratlandığından emin olmak için.Bazı sineklerde genom düzenlemesi daha yeni başlıyor. Bu teknik, daha karmaşık genom modifikasyon stratejileri tarafından takip edilmesi gereken bir ilk adımdır.

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Burada, Nasonia vitripennis'te etkili pupal ve yetişkin enjeksiyonları için yöntemleri embriyo mikroenjeksiyonuna erişilebilir alternatifler olarak tanımlıyoruz ve RNA paraziti (RNAi) yoluyla RNA susturma veya CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi yoluyla gen nakavt kullanarak ilgi genlerinin fonksiyonel analizini sağlıyoruz.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Burada, CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenlemesi yoluyla genomlarını değiştirmek veya germline dönüşümü yoluyla işaretli transpoze edilebilir elementlerin eklenmesi amacıyla hücre öncesi mısır planthopper embriyolarının toplanması ve mikroenjekte edilmesi için protokoller bulunmaktadır.

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

Bu yazıda, Oryantal meyve sineği Bactrocera dorsalis'in CRISPR / Cas9 mutagenezi için adım adım protokoller sunulmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokol tarafından sağlanan ayrıntılı adımlar, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmaları için mutant sineklerin üretilmesi için yararlı bir rehber görevi görecektir.

CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Öğrenin Phlebotomus papatasi kum sineği embriyolarına CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyonu ile hedefli mutagenez yöntemini. Bu teknik vektör böceklerinde gen fonksiyonlarını incelemek için genetik mühendisliğinde kullanılır.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Daha fazla video keşfet