Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Bu Odonata elektroporasyon aracılı RNA girişim yöntemi için bir video protokolüdür. Yusufçuklar ve damselflies, sipariş Odonata üyeleri, en atalarının böcekler arasında yer alıyor. Yetişkin Odonata vücut renkleri ve desenleri dikkate değer bir çeşitlilik göstermek, ve birçok ekolojik ve davranışsal çalışmalar yapılmıştır.

Ancak, Odonata üzerinde moleküler genetik çalışmalar eksik olmuştur, gen fonksiyonel analizi çok zordur çünkü. Örneğin, geleneksel RNAi yöntemi Odonata türlerinde etkili değildir. Son zamanlarda, in vivo elektroporasyon ile birlikte bir RNM yöntemi kurdu.

Burada, hem yusufçuk hem de damselflies elektroporasyon aracılı RNAi için bir video protokolü sağlar. Temsili türlerimiz olarak mavi kuyruklu barajı güvenle kullanırız. Ischnura senegalensis.

Bu en yaygın damselfly türlerinden biridir ve genellikle Japonya'da güneşli göletlerde bulunur. İlk olarak, bir damselfly, Ischnura senegalensis karın hedefleyen RNAi protokolü gösterir. Prothorax her iki tarafında iki iğne buz gibi anestezi sonra ve sabit bir stand için larva düzeltmek.

Pull ve yedinci ve sekizinci karın segmenti arasında inter-segmental membran germek forceps kullanarak. Segmentler arası membranı elle gererek tutun. Hazırlanan kılcal damarın ucunu gerilmiş intersegmental membrana takın.

1 mikrolitre siRNA veya dsRNA çözeltisi enjekte edin. Forceps kullanarak larva yüzeyine ultrason jel iki damlacık uygulayın. Ultrason jel üzerine elektrotlar yerleştirin, enjeksiyon tarafında pozitif elektrot ile.

Bir elektroporatör kullanarak 10 kat elektroporasyon darbeleri oluşturun. Kalan jeli yüzeydeki kağıt havlu ile silin. Böcek pimleri çıkarın ve iyileşme için yaklaşık bir gün boyunca ıslak bir kağıt havlu üzerinde tedavi larvaları tutun.

Sonra, bir damselfly, Ischnura senegalensis toraks hedefleyen RNAi protokolü gösterir. Buz gibi anestezi den sonra prothorax'ın her iki tarafına iki iğne takın ve larvayı sabit bir standa sabitle. El kullanarak prothorax ve synthorax arasındaki intersegmental membrançekin ve gerin.

Hazırlanan kılcal damarın ucunu gerilmiş intersegmental membrana takın. Bir mikrolitre siRNA veya dsRNA çözeltisi enjekte edin. Forceps kullanarak larva yüzeyine ultrason jel iki damlacık uygulayın.

Ultrason jel üzerine elektrotlar yerleştirin, enjeksiyon tarafında pozitif bir elektrot ile. Bir elektroprolator kullanarak 10 kez elektroporasyon darbeleri oluşturun. Kalan jeli yüzeydeki kağıt havlu ile silin.

Böcek pimleri çıkarın ve iyileşme için yaklaşık bir gün boyunca ıslak bir kağıt havlu üzerinde tedavi larvaları tutun. Temsili bir yusufçuk türü olarak Pied yağsız yusufçuk kullanıyoruz. Pseudothemis zonata.

Bu en yaygın yusufçuk türlerinden biridir ve genellikle Japonya'da gölgeli havuzlarda bulunur. Son olarak, bir yusufçuk, Pseudothemis zonata karın hedefleyen RNI protokolü göstermektedir. İntersegmental membranı dördüncü ve beşinci karın segmenti arasında uzatın.

Dördüncü ve beşinci karın segmenti arasında ince bir iğne ile küçük bir delik olun. Hazırlanan kılcal damarın ucunu hazırlanan deliğe yerleştirin. Bir mikrolitre siRNA veya dsRNA çözeltisi enjekte edin.

Larvayı pimleri kullanarak sabit bir standa sabitle. Forceps kullanarak larva yüzeyine ultrason jel iki damlacık uygulayın. Enjeksiyon tarafında pozitif elektrot ile ultrason jel elektrotlar yerleştirin.

Bir elektroporatör kullanarak 10 kat elektroporasyon darbeleri oluşturun. Kalan jeli yüzeydeki kağıt havlu ile silin. Böcek pimleri çıkarın ve iyileşme için yaklaşık bir gün boyunca ıslak bir kağıt havlu üzerinde tedavi larvaları tutun.

Burada hedef gen olarak bir melanin sentez geni MCO2 ve negatif kontrol hedefi olarak EGFP veya bla seçtik. MCO2 çeşitli böceklerde siyah renk oluşumu için gereklidir. Önce Ischnura senegalensis'in karnında sonuçları gösteriyoruz.

Beyaz ok uçları, pozitif elektrotun elektroporasyon üzerine yerleştirildiği bastırılmış siyah pigmentasyon bölgelerini gösterir. Pigmentasyon inkübatasyonu hem siRNA tedavisi hem de dsRNA tedavisi ile gözlendi. RNI fenotipinin büyüklüğü ve yeri bireyler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir.

Elektroporasyon olmadan bu türde Elektroporasyonun RNI için gerekli olduğunu gösteren RNI fenotipleri gözlenmedi. Daha sonra, Ischnura senegalensis toraks sonuçları gösterir. Benzer şekilde pozitif elektrotun elektroporasyon üzerine yerleştirildiği bölgede de siyah pigmentasyon inhibisyonu gözlenmiştir.

Son olarak, Pseudothemis zonata karın sonuçları gösterir. Beklendiği gibi, pozitif elektrotun elektroporasyon üzerine yerleştirildiği bölgede RNI fenotip saptendi. Elektroproration aracılı RNAi yönteminin Odonata'da çok yararlı olduğunu doğruluyoruz.

Yerel gen baskılanmasına neredeyse %100 verim sağlayabilir. En azından epidermiste, uygun gelişim evrelerini seçtiğimizde. Bu yöntem CRISPR/Cas9 yöntemi üzerinde birkaç vardır.

Örneğin, RNAi fenotiplerinin göründüğü bölge, elektrasyon üzerine pozitif elektrotun konumu ile kontrol edilebilir ve RNA fenotipleri aynı bireyde kontrol fenotipleri ile kolayca karşılaştırılabilir. Ayrıca, bu yöntem küçük yumurta içine mikroenjeksiyon gerektirmez. Bu nedenle, fenomenipin CRISPR/Cas9 yönteminden daha hızlı gözlemlenebilmeleri çok daha kolay ve hızlıdır.

Ayrıca, bu yöntem yeni yumurtlayan yumurtatoplamak zor olan böcekleriçin uygulanabilir. Örneğin, Pseudothemis zonata dişileri uçuş sırasında yumurtlarlar. Bu yüzden yeni yumurtlanan yumurtalarını toplamak çok zordur.

Konvansiyonel RNI verimli çalışmadığında bu protokolün genellikle model olmayan organizmalar için geçerli olmasını bekliyoruz.