Uyuyan Güzel Transposon Transposon Transfected İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinde Oksidatif Stresin İndüksiyonu ve Analizi

Hidrojen peroksit modeli, yaşa bağlı makula dejenerasyonu veya benzer nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde yararlı olabilecek faktörlerin antioksidan etkilerini değerlendirmek için basit ve etkili bir yaklaşımdır. Oksidan ajan olan hidrojen peroksit, tek bir darbede verilir, bu da hidrojen peroksit işleminin birkaç gün boyunca tekrarlanması gereken modellere göre daha hızlı ve daha basit hale getirir. Ekilen hücre sayısı tedavinin oksidatif etkisini etkilediğinden, hücrelerin kültürlerinden önce dikkatlice sayılması önemlidir.

Prosedürü göstermek, Gabriele Thumann'ın laboratuvarından doktora sonrası bir öğrenci olan Thais Bascuas olacak. Şartlandırılmış ortam hazırlığı için, PEDF, GM-CSF veya her ikisi ile transfeksiyondan 28 gün sonra, insan ARPE-19 hücre hattı T-75 şişelerini mililitre tam ortam konsantrasyonu başına 500.000 hücreden tohumlayın. Hücreler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, süpernatanı taze tam ortamla değiştirin ve 24 saat sonra yeni süpernatanı toplayın.

Histidin etiketli GM-CSF ve PEDF proteinlerini saflaştırmak için, kalan potansiyel hücreleri ortadan kaldırmak için süpernatanı santrifüjleyin ve numuneyi bir kenara koyun. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir tüpe 30 mikrolitre nikel NTA çözeltisi ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, nikel NTA akışını atın ve peleti yıkama başına 200 mikrolitre 1X inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, peleti 40 mikrolitre 4X inkübasyon tamponunda ve 900 mikrolitre santrifüjlenmiş, şartlandırılmış ortamda yeniden süspanse edin. Şartlandırılmış ortam çözeltisini oda sıcaklığında bir saat ve dakikada 70 dönüş inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numuneyi santrifüjleyin ve peleti yıkama başına 175 mikrolitre 1X inkübasyon ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, oda sıcaklığında dakikada 70 devirde 20 dakikalık bir inkübasyon için 20 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. İnkübasyonun sonunda, numuneyi santrifüjleyin. Süpernatanı bir kenara bırakın ve standart protokollere göre BCA protein tahlili tarafından ayrıştırılan toplam proteini ölçün.

Transfekte edilmemiş retina pigment epitel hücrelerinin şartlandırılmış ortam ve hidrojen peroksit ile tedavisi için, hücre kültürü inkübatöründe 24 saatlik inkübasyon için 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre tam ortamda 3000 hücre tohumlayın. Ertesi sabah, süpernatanları oyuk başına 200 mikrolitre şartlandırılmış ortamla değiştirin ve hücreleri 10 gün boyunca hücre kültürü inkübatörlerine geri koyun. Kültürün 11. gününde, hücreleri 24 saat boyunca tam ortamda 350 mikromolar hidrojen peroksit ile tedavi edin.

Transfekte edilmemiş RPE hücrelerinin saflaştırılmış veya ticari PEDF ve / veya GM-CSF ile tedavisi için, mililitre başına 500 nanogram rekombinant PEDF ve / veya mililitre başına 50 nanogram rekombinant ile desteklenmiş 200 mikrolitre tam ortamda 3000 hücreyi tohumlayın hücre kültürü inkübatöründe 48 saatlik bir inkübasyon için kuyu başına GM-CSF'ye. İnkübasyonun sonunda, süpernatantları 350 mikromolar hidrojen peroksit ve mililitre başına 500 nanogram PEDF ve / veya 24 saat boyunca oyuk başına mililitre GM-CSF başına 50 nanogram içeren tam ortam ile değiştirin. Transfekte edilmiş RPE hücrelerinin hidrojen peroksit muamelesi için, hücrelerin gösterildiği gibi 350 mikromolar hidrojen peroksit ile muamele edilmesinden önce, hücre kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca kuyu başına 200 mikrolitre tam ortamda 5.000 transfekte hücre kültürü.

PEDF ve/veya GM-CSF'yi aşırı eksprese eden transfekte edilmiş hücrelerde veya hidrojen peroksit muamelesinden sonra büyüme faktörü ile ön işleme tabi tutulmuş transfekte edilmemiş hücrelerde üretilen glutatyon seviyelerini ölçmek için, her bir oyuktaki süpernatanı 100 mikrolitre taze hazırlanmış 1X reaktif karışımı ile değiştirin oyuk başına ve hücreleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde dakikada 500 devirde 14 saniye boyunca bir reaktif karışımı ile karıştırın. Çalkaladıktan sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre sulandırılmış lusiferin tespit reaktifi eklemeden önce plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi çalkalayıcı üzerinde 15 saniye karıştırın, ardından oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon yapın.

İnkübasyonun sonunda, plakayı bir plaka okuyucuya yükleyin ve Düzeni Değiştir'i seçin. Temel Parametreler sekmesi altında, 96 oyuklu plaka ve Üst optik seçilmeli ve konumlandırma gecikmesi 0.1'e, Ölçüm başlangıç zamanı sıfıra, Ölçüm aralığı süresi bire ve Sonuçları normalleştirme süresi sıfıra ayarlanmalıdır. Boşlukları, standartları ve örnekleri tanımlayın ve Ölçümü başlat'a tıklayın.

Ardından verileri bir elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın ve standart eğrinin enterpolasyonu ile her numunedeki glutatyon konsantrasyonunu hesaplayın. Hücre canlılığını ölçmek için, her bir oyuktaki süpernatanı, oyuk başına% 1 FBS ile takviye edilmiş 100 mikrolitre tam ortamla değiştirin ve hücreleri analize kadar hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kültürden işlenmemiş ARPE-19 hücrelerini topladıktan sonra,% 1 FBS konsantrasyonu ile desteklenmiş DMEM Hams F-12 ortamında hücreleri mililitre başına 100.000 hücrede yeniden askıya alın.

Daha sonra,% 1 FBS ile desteklenmiş 200 mikrolitre ortamda yedi seri 1: 1 seyreltme hazırlayın ve her standardın 100 mikrolitresini iki kopya halinde 96 oyuklu bir plakanın uygun kuyucuklarına aktarın. Tüm kuyucuğa 50 mikrolitre taze hazırlanmış reaktif karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmeden önce hücreleri karışımla çalkalayıcı üzerinde 15 saniye karıştırın. Kuluçka süresinin sonunda, gösterildiği gibi lüminesansı ölçün.

Ölçümü elde ettikten sonra, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa 50 mikrolitre lizis reaktifi ekleyin, ardından lüminesansı tekrar ölçün ve canlı hücrelerin yüzdesini hesaplamak için formülü kullanın. 50 ve 100 mikromolar hidrojen peroksit ile 24 saatlik tedavi, hücre içi glutatyon üretimini etkilemezken, hücreler 350-500 veya 700 mikromolar hidrojen peroksit ile muamele edildiğinde glutatyonda önemli bir azalma gözlenir konsantrasyon. Morfolojik olarak, hidrojen peroksit ile muamele edilmiş hücreler, bileşiğin artan konsantrasyonları ile daha az yayılmış ve daha yuvarlak görünür.

Bu etki, hidrojen peroksit ile muamele edilen PEDF ve GM-CSF ile transfekte edilmiş hücreler için daha az belirgindi. Hücre sayısının hidrojen peroksit aracılı oksidatif stresi etkilediğine dikkat etmek önemlidir, çünkü glutatyon seviyesi sadece 5.000 hücre ile ekilen kuyucuklarda hidrojen peroksit işleminden sonra istatistiksel olarak önemli ölçüde azalmıştır. PEDF ve/veya GM-CSF'yi eksprese etmek için tedavi edilen veya transfekte edilen hücreler, oksidatif koşullar altında tedavi edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha fazla glutatyon üretir.

Ek olarak, PEDF ve GM-CSF ile transfekte edilmiş hücrelerde UCP2 gen ekspresyonu seviyesi, artış istatistiksel olarak anlamlı olmasa da, hidrojen peroksitten sonra artar. Hidrojen peroksite maruz kalan GM-CSF ile transfekte edilmiş hücrelerin bir lizatından fosforile AKT'nin Western blot analizi, tedavi edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla fosforilizasyonda sadece küçük bir azalma gösterir, bu da GM-CSF'nin hücreleri oksidatif stres hasarından koruyabileceğini gösterir. Hücreleri doğru yoğunluklarda tohumlamak, taze hidrojen peroksit çözeltisi kullanmak ve ortama taze proteinler eklemek önemlidir.

Büyüme faktörlerinin antioksidan etkisi hidrojen peroksit modeli kullanılarak doğrulandıktan sonra, faktörler oksidatif stresle ilişkili bir oküler hastalık modelinde test edilebilir. Mevcut hidrojen peroksit oksidatif stres modeli, farklı faktörlerin sahip olabileceği antioksidan etkilerin değerlendirilmesine izin verir ve bu nedenle yeni gen tedavilerinin geliştirilmesini destekler.