Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama
16 Haziran 2021
Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.
Bu yöntem, oosit olgunlaşması sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurları tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. In-vitro oosit olgunlaşması boyunca muhabir birikimini değerlendirmek için zaman atlamalı mikroskopi uyguladık. Bu, oosit olgunlaşması sırasında çevirisel aktivasyonun veya baskının gerçekleştiği zamanı doğru bir şekilde tespit eder.
Başlamak için, 26 kalibrelik bir iğne ile folikül duvarında küçük bir kesim yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağızla çalışan bir cam pipet kullanarak birkaç kat kümülüs hücresi ile bozulmamış COC'leri izole edin. Daha küçük bir pipet kullanın ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak denude edin.
Denuded oositleri epire edin ve bir mikromolar cilostamid ile desteklenmiş olgunlaşma ortamına sahip bir petri kabına yerleştirin. Oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulması için yemeği iki saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Enjeksiyon iğneleri hazırlamak için mekanik bir çekme makinesine 10 santimetre uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirin.
En iyi enjeksiyon için ısıtılmış bir filament kullanarak iğne ucunu 45 derecelik bir açıyla bükün. Temel oosit toplama ortamının 20 mikroliter damlacığını bir polistiren kabına yerleştirin ve damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün. Her biri Ypet UTR ve mCherry mikroliteri başına 12,5 mikrogram ekleyerek daha büyük hacimli bir muhabir karışımı hazırlayın.
Bunlardan aliquots eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çözdükten sonra, aliquot'ı 20.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin, ardından yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 mikrolitre muhabir karışımı ile yükleyin.
Tutma pipetini ve enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığı içine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini tutma pipetine hafifçe dokunarak açın. Oositleri temel toplama ortamının bir damlasına yerleştirin ve muhabir karışımının beş ila 10 pişolitresini enjekte edin.
mCherry sinyalinin platoya girmesine izin vermek için oositleri ve olgunlaşma ortamını 16 saat boyunca bir mikromoler cilostamid ile kuluçkaya bırakın. Zaman atlamalı mikroskopi için, enjekte edilen her muhabir için iki adet 20 mikroliter olgunlaşma ortamı damlacıklı bir Petri kabı, profaz I-arrested oositleri kontrol etmek için bir mikromolar cilostamidli bir damlacık ve olgunlaşan oositler için cilostamid içermeyen bir damlacık hazırlayın. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.
Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve cilostamid olmadan olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Bazı oositleri olgunlaşma ortamında bir mikromoler cilostamid ile profaz I oosit kontrol grubu olarak tutun. Enjekte edilen oositleri daha önce hazırlanmış zaman atlamalı mikroskop kabındaki ilgili damlacıklarına aktarın.
Kayıt sırasında hareketlerini önlemek için oositleri kapalı bir cam pipetle kümeleyin. Metnin el yazmasında belirtilen parametreleri kullanarak, çanağı ışık yayan diyot eliminasyon sistemi ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte tutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Uygulamalar'a ve ardından Çok Boyutlu Edinme'ye tıklayarak zaman atlamalı deneme için uygun ayarları girin.
İlk sekme Ana'yı seçin ve zaman atlamalı, birden çok aşama konumu ve birden çok dalga boyu seçin. Denemenin kaydedileceği konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin. Ardından, zaman noktası, süre ve zaman aralığı sayısını girmek için Zaman Atlama sekmesini seçin.
Yeni bir pencere açıp Canlı Al, Al ve Göster'i seçerek Sahne Alanı sekmesini seçin, brightfield'ı açın ve oositlerin konumunu bulun. Oositler bulunduktan sonra, çok boyutlu alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için artı tuşuna basın. Dalga Boyları sekmesini seçin ve brightfield, YFP ve mCherry için üç farklı dalga boyu ayarlayın.
Ypet ve mCherry için pozlamayı ayarlayın, ardından Acquire'e tıklayarak zaman atlamalı denemeyi başlatın. Ypet üç asal UTR çevirisinin analizi için, her oosit için iki bölge ölçümü, elips bölgesine tıklayarak oosit kendisi ve dikdörtgen bölgeye tıklayarak arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'i çevreleyen küçük bir bölge gerçekleştirin. Günlüğü Aç'ı ve ardından Verileri Günlüğe Kaydet'i tıklatarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.
Her bir oosit ve ölçülen tüm zaman noktaları için, arka plan bölgesi ölçümünü YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Profaz I ve olgunlaşan oositlerde mCherry ve YFP ifadesi 39 oositte kaydedilmiş, bunlardan 30'u olgunlaşmış ve dokuzu profaz I'de negatif kontrol olarak tutuklanmıştır. Profaz I-arrested ve olgunlaşan oositlerin sinyalleri için bireysel YFP ila mCherry oranları, YFP sinyalini profaz I-arrested ve olgunlaşan oositler için son 10 zaman noktasının ortalama mCherry sinyaline bölerek enjekte edilen hacim için düzeltildi.
Muhabir YFP'nin çeviri oranları, YFP'yi profaz I'deki mCherry oranlarına uyan eğri ile ve ilk sıfır ila iki saat boyunca veya doğrusal regresyon kullanılarak cilostamid salınımı sonrası sekiz ila 10 saat boyunca olgunlaşan oositlerde ölçüldü. Muhabirin birikimi, cilostamid salınımı sonrası sıfır ila iki saat ile sekiz ila 10 saat arasındaki çeviri oranlarında önemli bir farkla belirtildiği gibi doğrusal bir desen izlemez, bu da oksilat miyotik olgunlaşma sırasında interlökin 7 çevirisinin aktivasyonunu gösterir. Bu protokolü denerken, kaydın başında pozlama süresinin yeterli olduğundan emin olun.
Oosit meiotik yeniden başlaması sırasında çeviri etkinleştirilirse sinyalin zaman kursu sırasında doyabileceğini unutmayın. MRMA'nın stabilitesi, YFP için astarlar kullanılarak PCR ile doğrulanabilir. Çevirideki değişiklikleri onaylamak için, Batı şişkinliğini bir V5 teknolojisine karşı bir antikorla kullanabilirsiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir raportör tahlili tanımlar. Yöntem, bu süreç sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici elemanların tanımlanmasına ve karakterize edilmesine izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- mRNA çevirisini anlamak gelişim süreçleri için kritik öneme sahiptir.
- Oosit olgunlaşması üreme biyolojisinde önemli bir aşamadır.
- Düzenleyici elemanlar çeviri kontrolünde önemli bir rol oynar.
- Zaman aralıklı mikroskopi, dinamik biyolojik süreçler hakkında içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Oosit olgunlaşması sırasında çeviri aktivasyonunun veya baskılamasının zamanlamasını değerlendirmek.
- mRNA çevirisi düzenlemesini incelemek için bir raportör tahlili kullanmak.
- Oosit gelişimini yöneten moleküler mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Raportör birikimlerini izlemek için zaman aralıklı mikroskopi.
- Antralkan foliküllerden sağlam cumulus-oositler kompleksleri (COCs) izole etmek.
- Pipetleme teknikleri kullanılarak COCs'lerin mekanik olarak soyulması.
- In vitro olgunlaşma sırasında çeviri kontrolünün değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Çeviri düzenlemesi için önemli zaman noktalarının belirlenmesi.
- Çeviri etkileyen düzenleyici elemanların karakterizasyonu.
- Oosit çalışmalarında raportör tahlilinin başarılı bir şekilde uygulanması.
- Olgunlaşma sırasında mRNA çevirisinin dinamiği hakkında içgörüler.
Sonuçlar
- Raportör tahlilinin oositlerde mRNA çevirisini incelemek için etkili olduğu.
- Zaman aralıklı mikroskopinin çeviri düzenlemesi hakkında değerli veriler sağladığı.
- Bulguların oosit olgunlaşma süreçlerinin anlaşılmasına katkıda bulunduğu.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding maternal mRNA translation dynamics during oocyte maturation provides critical insights into developmental competence and early embryogenesis, which are foundational for reproductive toxicology and fertility-related drug discovery. This single-oocyte reporter assay enables precise temporal mapping of translational activation or repression, supporting mechanistic de-risking in preclinical models of gametogenesis and embryo viability. The approach offers a scalable, quantitative framework for evaluating how small molecules or genetic perturbations influence post-transcriptional gene regulation in a physiologically relevant germ cell system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific 3' UTR elements to translational control during a defined developmental window.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct measurement of mRNA translation rates in individual oocytes, reducing reliance on indirect transcriptional readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized, ratiometric readouts (YFP/mCherry) that correct for injection variability, enabling robust compound screening in oocytes.
- Operational Value: Establishes a standardized, time-lapse-based workflow for assessing translational kinetics across multiple conditions and time points.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of translational regulation to functional outcomes in oocyte maturation, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by providing a conserved readout of post-transcriptional regulation applicable across mammalian models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where it supports hypothesis testing of RNA-binding proteins or regulatory non-coding elements influencing maternal mRNA fate, and feeds into lead identification by identifying modulators of translation with potential impact on developmental endpoints.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking by pinpointing when and how specific mRNAs are translationally activated or repressed during meiotic maturation.
- Screening: Delivers quantitative, normalized translation rates that allow comparison of test conditions against controls using linear regression of ratiometric signals.
- Analytics: Provides time-resolved, background-subtracted fluorescence measurements that support statistical comparison of translational dynamics across experimental groups.
- Translational Research: Offers a conserved assay format to assess whether identified regulatory elements translate across species, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: The core reporter strategy (fluorescent protein fused to target 3' UTR with co-injected control) is adaptable to other mRNAs and species, promoting platform-level application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in post-transcriptional regulation by providing direct, real-time visualization of translation in single cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through internal normalization (mCherry) and standardized oocyte handling, minimizing technical noise.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in fertility-related programs by offering early insight into compounds that disrupt essential translational programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their influence on oocyte developmental competence via mRNA translation control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oocyte handling, micromanipulation, and fluorescence microscopy.
- Dependent on microinjection systems, time-lapse capable microscopes with environmental control, and image analysis tools for region-based quantification.
- Necessitates standardization across laboratories for oocyte collection, injection volume control, and background subtraction protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of reporter construct stability and injection parameters.
- Signal saturation and phototoxicity must be managed during prolonged time-lapse imaging, particularly when translation is strongly activated.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Aspiration of Denuded Oocyte and its Microinjection
3:18
Time-lapse Microscopy and Analysis of Ypet-3 UTR Translation
6:00
Results: Statistical Analysis of the Expression for Reporter-YFP and mCherry in Prophase I and Maturing Oocytes
7:19
Conclusion
