Name: Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Keşfedin: Tek bir oosit reporter tahlili kullanarak in vitro olgunlaşma sırasında maternal mRNA çeviri programını tanımlama yöntemini öğrenin. Bu teknik, çeviri düzenleyici elemanları belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R01 GM097165, GM116926 ve Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 tarafından Marco Conti'ye desteklenmiştir. Enrico M. Daldello, Lalor Vakfı'ndan bir burs, Natasja G. J. Costermans ise Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO) rubicon bursu ile desteklendi.

Hayvanları içeren deneysel prosedürler, San Francisco'daki Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (an182026 protokolü) tarafından onaylandı.
1. Medyanın hazırlanması
<ol><li>Temel oosit toplama ortamını ve oosit olgunlaşma ortamını yapmak için Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm bileşenleri ekleyin. Temel toplama ortamı için pH'ı 7,4 olarak ayarlayın. Hem toplama hem de olgunlaşma ortamı için, kullanım gününde 3 mg/mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 μM cilostamid ekleyin.</li>
</ol>2. Ypet-3' UTR ve mCherry için mRNA kodlamasının hazırlanması
<ol><li>İlgi çekici mRNA'ların 3′ UTR dizilerini elde edin. NOT: Bu çalışma için daha önce fare oosit cDNA'sından diziler elde edilmiştir.</li>
	<li>Hedef 3' UTR'leri oosit cDNA'dan ve pcDNA 3.1 vektörün Ypet kodlama dizisi, V5-epitop etiketi ve T7 promotörü içeren bölümlerinden yükseltmek için astarlar tasarlayın.</li>
	<li>Yüksek kaliteli bir DNA polimeraz kiti kullanarak güçlendirin. Parçaların doğru boyuta sahip olup olmadığını kontrol etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerini bir jel üzerinde çalıştırın, bantları kesin ve üreticinin talimatlarına göre jel çıkarma kiti kullanarak jelden DNA'yı çıkarın.</li>
	<li>PCR klonlama kiti kullanarak PCR parçalarını bir vektörle bire bir edin. NOT: PCR parçaları daha verimli bir rekombinasyon işlemini kolaylaştırmak için buz üzerinde 4 saat boyunca inkübe edildi. Bu, sadece 45 dakikalık bir kuluçka süresi öneren üreticinin talimatlarına aykırıdır.</li>
	<li>PCR parçalarını yetkin 5-α Escherichia coli bakterisine dönüştür.<ol>
<li>Karışımı ekleyin ve bakterilere plazmid ekleyin ve 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatın.</li>
		<li>Karışımı 45 s için 42 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek karışımı ve plazmid'i ısı şokuna uğratır ve hemen 3 dakika boyunca buz üzerinde soğutun.</li>
		<li>Katabolit baskı (SOC) ortamına sahip 500 μL Süper Optimal et suyu ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>2 dakika boyunca 7000 × g'da aşağı dön ve süpernatantların çoğunu çıkarın. Uygun seçim antibiyotik ile luria suyu (LB) agar plakası üzerinde resuspend ve plaka. NOT: Bu çalışmada karbenisilin kullanılmıştır.</li>
		<li>37 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın. Kolonilerden birine pipet ucuna hafifçe bastırarak ve 100 μg/ mL karbenisilin ile 3 mL LB ortamına yerleştirerek kolonileri izole edin. 37 °C'de 12-24 saat kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Plazmid DNA izolasyon kitini kullanarak plazmidlerin DNA'sını üreticinin talimatlarına göre çıkarın ve DNA dizileme yoluyla dizileri onaylayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ypet/3' UTR için:<ol>
<li>In vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu üretin. Ypet dizisinin yukarı doğru bir ileri astarını ve 20 ek timin kalıntısına sahip bir ters astar kullanın. Ypet/IL-7 3' UTR dizisi ve ileri ve ters astar dizileri için Tablo 2'ye bakın. NOT: Bu ek timin kalıntıları in vitro transkripsiyondan sonra lineer mRNA'ya oligo(A)ekler.
</li>
		<li>
In vitro, ÜRETICInin talimatlarına göre bir T7 transkripsiyon kiti kullanarak PCR ürününü yazıya dökebilir.</li>
		<li>Elde edilen tamamlayıcı RNA'yı (cRNA) üreticinin talimatlarına göre bir transkripsiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın.</li>
		<li>RNA içermeyen suda arıtılmış cRNA'yı boşaltın, konsantrasyonu ölçün ve agarose elektroforezi ile bütünlüğü değerlendirin. −80 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>mCherry için:<ol>
<li>Yüksek doğrulukta bir kısıtlama enzimi kullanarak in vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu üretin; bu örneği çoğaltıyorsanız mfEI-HF kısıtlama enzimini kullanın. 37 °C'de bir gecede sindirim tamponunda sindirin.</li>
		<li>Numuneyi arındırmak için bir jel çalıştırın ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanarak doğrusal DNA'yı çıkarın.</li>
		<li>
In vitro, ÜRETICInin talimatlarına göre bir T7 transkripsiyon kiti kullanarak PCR ürününü yazıya dökebilir.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına göre bir poli(A) atık kiti kullanarak cRNA'yı (150-200 nükleotit) poliadenillatın.</li>
		<li>Elde edilen cRNA'yı, üreticinin talimatlarına göre bir transkripsiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın.</li>
		<li>Arıtılmış cRNA'yı RNA içermeyen suda boşaltın, mRNA konsantrasyonlarını ölçün ve jel elektroforezi ile mesaj bütünlüğünü değerlendirin. −80 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Deneysel prosedür
NOT: Şekil 1'de oosit mikro enjeksiyonu ve sonraki zaman atlamalı mikroskopinin şematik bir özeti verilmiştir.
<ol><li>1. Gün<ol>
<li>İntraperitoneally 21 günlük fareler ile 5 IU hamile kısrak serum gonadotropin antral evre11folikül büyümesini teşvik etmek için enjekte.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>Oosit koleksiyonu<ol>
<li>Yumurtalıkları toplamak için astarlamadan sonra fareleri 44-48 saat kurban edin ve temel oosit toplama ortamına sahip plastik bir Petri kabına yerleştirin.</li>
			<li>Folikül duvarında 26 G'lık bir iğne ile küçük bir kesim yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağzıyla çalışan bir cam pipet kullanarak birkaç kat kümülüs hücresi ile bozulmamış kümülüs kapalı oositleri (COC' ler) izole edin.</li>
			<li>Daha küçük bir pipet kullanın (oosit çapından biraz daha büyük) ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak devre dişine haline getirdiğinde. NOT: Alternatif olarak, sağlam COC'lere mikro enjeksiyon gerçekleştirin.</li>
			<li>Daha büyük bir pipet kullanarak, denuded oositleri aspire edin ve meiotik olgunlaşmanın yeniden başlamasını önlemek için fosfodideraz inhibitörü, cilostamid 1 μM ile desteklenmiş olgunlaşma ortamı ile bir Petri kabına yerleştirin12. Oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulması için yemeği 2 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Oosit mikro enjeksiyonu<ol>
<li>Mekanik bir çekme makinesine 10 cm uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirerek enjeksiyon iğnelerini hazırlayın. Optimum enjeksiyon için, iğne ucunu ısıtılmış bir filament kullanarak 45° açıyla bükün.</li>
			<li>Temel oosit toplama ortamının 20 μL damlacıkları ile polistiren yemekler hazırlayın ve damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün.</li>
			<li>12,5 μg/μL Ypet-3' UTR ve 12,5 μg/μL mCherry ekleyerek bir muhabir karışımı hazırlayın. Daha büyük bir hacim hazırlayın ve benzer muhabir konsantrasyonlarını sağlamak için gelecekteki deneyler için aliquots yapın. Bu aliquotları -80 °C'de saklayın. Çözdükten sonra, ilk önce aliquot'ı 20.000 x g'da2 dakika santrifüj edin ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Bu santrifüj, enjeksiyon iğnesinin muhabir karışımındaki potansiyel agregalar tarafından tıkanmasını önleyecektir.</li>
			<li>Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 μL muhabir karışımı ile kapillarite ile yükleyin.</li>
			<li>Tutma pipetini ve yüklü enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığı konumuna getirin. Ortamın bir kısmını tutma pipetine emiş.</li>
			<li>Enjeksiyon iğnesini tutma pipetine hafifçe dokunarak açın.</li>
			<li>Oositleri temel toplama ortamının bir damlasına yerleştirin ve muhabir karışımının 5-10 pL'lik kısmını enjekte edin.</li>
			<li>MCherry sinyalinin platoya girmesine izin vermek için olgunlaşma ortamındaki oositleri 16 saat boyunca 1 μM cilostamid ile kuluçkaya bırakın.</li>
			<li>Enjekte edilen her muhabir için en az iki adet 20 μL olgunlaşma ortamı damlacıklı zaman atlamalı mikroskopi için kullanılacak bir Petri kabı hazırlayın: profaz I-arrested oositleri kontrol etmek için 1 μM cilostamidli bir damlacık ve olgunlaşan oositler için cilostamid içermeyen bir damlacık. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Zaman atlamalı mikroskopi<ol>
<li>Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve cilostamid olmadan olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Profaz I-arrested oosit kontrol grubu olarak 1 μM cilostamid ile olgunlaşma ortamında bazı oositleri saklayın.</li>
			<li>Enjekte edilen oositleri daha önce hazırlanmış zaman atlamalı mikroskop kabındaki ilgili damlacıklarına aktarın. Kapalı bir cam pipet kullanarak oositleri kümele (ucu birkaç saniye alevde tutarak kapalı bir pipet hazırlanabilir). NOT: Oositlerin kümelenmesi, kayıt sırasında hareketlerini önlemeye yardımcı olur.</li>
			<li>Çanağı ışık yayan diyot aydınlatma sistemi ve 37 °C ve% 5 CO2'detutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Bu çalışmayı çoğaltmak için aşağıdaki parametreleri kullanın: filtre kümesi: dikroik ayna YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP kanalı (Excitation (Örn. ): S500/20 × 49057; Emisyon (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanalı (Örn: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).</li>
			<li>Zaman atlamalı deneme için uygun ayarları girin (bkz. Bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosu): Uygulamalar | Çok Boyutlu Edinme. İlk sekmeyi seçin Main ve zaman dilimini, birden çok sahne konumunuve birden çok dalga boyunuseçin.</li>
			<li>Denemenin kaydedileceği konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin.</li>
			<li>Zaman noktası, süre ve zaman aralığı sayısını girmek için Zaman Çakışması sekmesini seçin. NOT: Oosit meiotik olgunlaşmanın zamanlaması türler arasında farklılık göstererek, zaman atlamalı deneyin süresi çalışılan hayvan türlerine bağlıdır. Fare oositleri ile yapılan bu deneyde, oositler 16 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedildi.</li>
			<li>Aşamasekmesini seçin. Brightfield'ı açın ve Edin | seçerek yeni bir pencere açarak oositlerin konumunu bulun | edin Canlı Göster. Oositler bulunduktan sonra, Çok Boyutlu Alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için + tuşuna basın.</li>
			<li>Dalga Boylarısekmesini seçin ve brightfield (pozlama 15 ms), YFP (pozlama 150 ms Ypet/IL7 3' UTR için pozlama) ve mCherry (Ypet/IL7 3' UTR için pozlama 75 ms) için 3 farklı dalga boyu ayarlayın. NOT: Her Ypet/3' UTR muhabiri için pozlamayı muhabir birikimi seviyesine ve enjekte edilen hacme göre ayarlayın. Çevirinin etkinleştirilmesi durumunda hafife almayı veya doygunluğu önlemek için YFP sinyalinin denemenin başlangıcında algılama aralığının merkezine düştüğünden emin olun. mCherry için, sinyal poliadenilasyon prosedürü sırasında eklenen adenin nükleotitlerinin sayısına bağlı olduğu için her bir mCherry grubu için pozlamayı ayarlayın. Poliadenilasyon verimliliğindeki değişim nedeniyle, deneyler arasında daha iyi bir karşılaştırma için farklı deneylerde aynı mCherry grubunu kullanın.</li>
			<li>Edin 'e tıklayarak zaman atlamalı denemeyi başlatın. Tek bir oositte zaman atlamalı kayıt örneği için Şekil 2 ve Ek Dosya'ya bakın.</li>
		</ol></li>
		<li>Ypet-3' UTR çevirisinin analizi<ol>
<li>Bu analiz için (bkz. Bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosu), her oosit için iki bölge ölçümü yapın: oosit kendisi elips bölgesini tıklatın ve oosit'i ve arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'e yakın küçük bir bölgeyi çevrele-dikdörtgen bölgeyetıklayın. NOT: Zaman atlamalı kayıt sırasında oositlerin seçili bölgenin dışına çıkmamasını sağlayın. Bölge ölçümünün kutup gövdesi ekstrüzyonu etrafına yerleştirilmesine özellikle dikkat edin, çünkü bu durum oositte harekete neden olur ve kaydı bozabilir.</li>
			<li>Veri çözümleme yazılımını vermek için önce Açık Günlük'ü ve ardından Günlük Verileri'ni tıklatarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.</li>
			<li>Her bir oosit ve ölçülen tüm zaman noktaları için arka plan bölgesi ölçümünü oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Bunu YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı yapın.</li>
			<li>Daha sonra başvurmak için germinal vezikül arızası (GVBD) ve polar gövde ekstrüzyonunun (PBE) zamanlamasını kaydedin. NOT: GVBD 2 saati aştığında olgunlaşan fare oositlerini hariç tutun.</li>
			<li>Aykırılıkları denetlemek için her oosit için zaman içinde YFP ve mCherry ifadesini çizin. NOT: Bu pürüzsüz bir eğri olmalıdır, eğer değilse, bu kayıt sırasında oosit hareket ettiğini gösterebilir.</li>
			<li>Her bir oosit için, kaydın son on zaman noktası için ortalama mCherry ifadesini hesaplayın. Her zaman noktası için, her bir oosit için her zaman noktasında bir YFP/mCherry oranı elde etmek üzere eklenen birimi düzeltmek için YFP ifadesini ortalama mCherry ifadesine bölün.</li>
			<li>Eğrinin eğimini doğrusal regresyona göre sığdırarak belirli bir zaman aralığı için çeviri oranlarını hesaplayın. İstatistiksel çıkarım kullanarak çeviri oranlarındaki farklılıkları değerlendirin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li>
<li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portrait+of+an+oocyte%3A+our+obscure+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li>
<li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConti%2C+M+%22Posttranscriptional+Mechanisms+in+Endocrine+Regulation%22">Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation</a>. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).</li>
<li>Dai, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+code+for+mRNA+3%27UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li>
<li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li>
<li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399(2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li>
<li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li>
<li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li>
<li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+growth%3A+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li>
<li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li>
<li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).</li>
<li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development%3A+A+model+for+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li>
<li>Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).</li>
<li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+mRNAs+with+distinct+3%27+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive%2C+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+3%27+uridylation+and+poly%28A%29+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li>
<li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Sunulan yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde hedef mRNA'nın aktivasyonunu ve çevirisinin baskısını incelemek için bir stratejiyi açıklar. Oosit-kümülüs hücre iletişimi8,13,bu yöntemi tanımlamak amacıyla oosit tarafından salınan bir sitokin olan IL-7 seçildi. IL-7'nin oosit olgunlaşması8 sırasında giderek daha fazla çevrildiğini ve bu yöntemi kullanarak çevirisel aktivasyonun iyi görselleştirilmesin...

Tamamen büyümüş bir memeli oosit, döllenmeye ve totipotency kazanımı için hazırlıkta hızlı değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler döllenme sonrası embriyonik gelişimi sürdürmek için gereklidir. Nükleer olgunlaşma ile ilişkili olaylar nispeten iyi tanımlanmış olsa da, oosit sitoplazmasındaki moleküler süreçler ve yollar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşmasının son aşamalarında, oositler transkripsiyonel olarak sessizdir ve gen ekspresyonu tamamen mRNA çevirisi ve bozulmasına bağlıdır1,2. Bu nedenle, gelişimsel yeterlilik için kritik proteinlerin sentezi, oosit büyümesi sırasında daha önce sentezlenen uzun ömürlü mRNA'ların zamanlanmış çevirisi programına dayanır1,3. Meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde yürütülen bu maternal mRNA çevirisi programını tanımlamaya odaklanan bu makale, in vitro meiotik olgunlaşma sırasında hedef maternal mRNA'ların tek oositlerde çevirisinin aktivasyonunu ve baskısını incelemek için bir strateji sunun bir parçası olarak sunulmaktadır.
Bu yöntemde, YPet açık okuma çerçevesi, ilgi dökümünün 3' UTR'sının yukarı akışında klonlanır. Daha sonra, bu muhabiri kodlayan mRNA'lar, enjekte edilen hacmi kontrol etmek için poliadenillenmiş mRNA'lar kodlama mCherry ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. İn vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak muhabir birikimi ölçülür. Sarı floresan protein (YFP) ve mCherry birikimi bireysel oositlerde kaydedilir ve YFP sinyalleri birlikte enjekte edilen mCherry'nin platolu seviyesi ile düzeltilir. Veri toplama işleminden sonra eğrinin montajla elde edilen eğrinin eğimi hesaplanarak in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı zaman aralıkları için çeviri oranları hesaplanır.
Bu yaklaşım, seçilen endojen mRNA'ların çevirislerindeki değişiklikleri deneysel olarak onaylamak için bir araç sağlar. Ek olarak, bu yöntem, hedef mRNAs4,5,6'nın3' UTR'sının cis düzenleyici unsurlarını manipüle ederek oosit meiotik olgunlaşma sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurların karakterizasyonunu kolaylaştırır. Poli(A) kuyruk uzunluğunun manipülasyonu ayrıca oositlerde adensilaz / deadenylaz aktivitesi hakkında fikir verir5. Cis etkili elementlerin mutajenisi veya RNA immün önksezisi, konyak RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri incelemek için kullanılabilir6,7. Ek olarak, bu yöntem, azaltılmış oosit kalitesi 8,9,10ile ilişkili modellerde hedef 3' UTR çevirisini ölçerek oosit gelişimsel yeterliliği için kritik olan çeviri programının temel bileşenlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem makalesi, 21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded oositlerinin IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış bir Ypet muhabiri ile mikro enjekte edildiği temsili bir deney sunun. Oosit enjeksiyonu, zaman atlamalı kayıt ve veri analizi için kurulum ve protokol açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Ortamın hazırlanması< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Tozu Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL-A3311</td><td></td></tr><tr><td>Silostamid</td><td>EMD Millipore</td><td>231085</td><td></td></tr><tr><td>MEM alfa</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta Kartal&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2645</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin 100x Solüsyonu, Steril Filtreli</td><td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat&nbsp;</td><td>JT-Baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf damıtılmış su</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> YFP/3' UTR ve mCherry kodlayan mRNA'nın hazırlanması</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-102QD</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Choo-Choo Klonlama Kiti</td><td>McLab</td><td>CCK-20</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Tamponu (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>DNA yükleme boyası (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Çözeltisi</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA merdiveni</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plakaları 100 & g/mL Karbenisilin, Teknova&nbsp;</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>LB Orta (Kapsüller)</td><td>MP Biyomedikal</td><td>3002-021</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Transkripsiyon Temizleme Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MfeI-HF kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R3589</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) Atık kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. orta</td><td>Thermo Fisher</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>TAE tamponu&nbsp;</td><td>Apex Biyomedikal&nbsp;</td><td>20-193</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf Etidyum Bromür Çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Oosit toplama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş mikro pipetler için aspiratör tüpü tertibatı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş mikro pipetler</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSG- 5000</td><td>Mybiosource</td><td>MBS142665</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğne 26 G x 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Oosit mikro enjeksiyon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Çanak | No. 0 Lamel | 20 mm Cam Çapı | Kaplamasız</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Hızlandırılmış mikroskopi için</td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo Kültürü için Yağ</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon için</td><td>Petri Kabı</td><td>Falcon</td><td>351006</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Çanak</td><td>Falcon</td><td></td><td>353001 Oosit inkübasyonu için</td></tr><tr><td>VacuTip Holding Capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5195000036</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Şekil 1S</td></tr><tr><td>MetaMorph Hazırlanması, sürüm 7.8.13.0&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>&nbsp; Hızlandırılmış mikroskopi için, 3' UTR çevirisinin analizi&nbsp;</td></tr></tbody></table>

tek bir oocyte reporter tahlil kullanarak in vitro olgunlaşma sırasında maternal mrna Çeviri programını tanımlama

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Oosit nükleer olgunlaşması ile ilgili olaylar iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, döllenmeye ve totipotency kazanımı için sitoplazmada gerçekleşen moleküler yollar ve süreçler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşması sırasında, gen ifadesindeki değişiklikler transkripsiyon yerine sadece anne haberci RNA'ların (mRNA'lar) çevirisine ve bozulmasına bağlıdır. Bu nedenle, çeviri programının yürütülmesi, embriyo gelişimini sürdürmek için oosit gelişimsel yeterliliğinin oluşturulmasında kilit bir rol oynar. Bu makale, meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde gerçekleşen maternal mRNA çeviri programını tanımlamaya odaklanılmasının bir parçasıdır. Bu yöntem makalesinde, in vitro oosit olgunlaşması sırasında hedef mRNA'ların çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir strateji sunulmuştur. Burada, bir Ypet muhabiri, ilgi geninin 3' çevrilmemiş bölgesine (UTR) kaynaştırıldı ve daha sonra enjekte edilen hacmi kontrol etmek için mCherry için poliadenillenmiş mRNA kodlaması ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. Muhabir birikimini ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak, oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde çeviri oranları hesaplanır. Burada, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR muhabiri örnek olarak kullanılarak, oosit izolasyonu ve enjeksiyonu, hızlandırılmış kayıt ve veri analizi protokolleri açıklanmıştır.

21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded prophase I-arrested oositlerine, IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış Ypet muhabirini kodlayan mRNA ve mRNA kodlama mCherry içeren bir muhabir karışımı enjekte edildi. YFP ve mCherry ifadesi 39 oositte kaydedildi, bunlardan 30'u olgunlaştı ve 9'u prophase I'de negatif kontrol olarak tutuklandı. Üç olgunlaşan oosit, gecikmiş bir GVBD'ye (N=2) sahip oldukları veya kayıt sırasında çanağa taşındıkları için analiz için hariç tutuldu (N=1). Şekil 3'te profaz I ve ol...

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Bu yöntem, oosit olgunlaşması sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurları tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. In-vitro oosit olgunlaşması boyunca muhabir birikimini değerlendirmek için zaman atlamalı mikroskopi uyguladık. Bu, oosit olgunlaşması sırasında çevirisel aktivasyonun veya baskının gerçekleştiği zamanı doğru bir şekilde tespit eder.Başlamak için, 26 kalibrelik bir iğne ile folikül duvarında küçük bir kesim yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağızla çalışan bir cam pipet kullanarak birkaç kat kümülüs hücresi ile bozulmamış COC'leri izole edin. Daha küçük bir pipet kullanın ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak denude edin.Denuded oositleri epire edin ve bir mikromolar cilostamid ile desteklenmiş olgunlaşma ortamına sahip bir petri kabına yerleştirin. Oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulması için yemeği iki saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Enjeksiyon iğneleri hazırlamak için mekanik bir çekme makinesine 10 santimetre uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirin.En iyi enjeksiyon için ısıtılmış bir filament kullanarak iğne ucunu 45 derecelik bir açıyla bükün. Temel oosit toplama ortamının 20 mikroliter damlacığını bir polistiren kabına yerleştirin ve damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün. Her biri Ypet UTR ve mCherry mikroliteri başına 12,5 mikrogram ekleyerek daha büyük hacimli bir muhabir karışımı hazırlayın.Bunlardan aliquots eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çözdükten sonra, aliquot'ı 20.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin, ardından yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 mikrolitre muhabir karışımı ile yükleyin.Tutma pipetini ve enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığı içine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini tutma pipetine hafifçe dokunarak açın. Oositleri temel toplama ortamının bir damlasına yerleştirin ve muhabir karışımının beş ila 10 pişolitresini enjekte edin.mCherry sinyalinin platoya girmesine izin vermek için oositleri ve olgunlaşma ortamını 16 saat boyunca bir mikromoler cilostamid ile kuluçkaya bırakın. Zaman atlamalı mikroskopi için, enjekte edilen her muhabir için iki adet 20 mikroliter olgunlaşma ortamı damlacıklı bir Petri kabı, profaz I-arrested oositleri kontrol etmek için bir mikromolar cilostamidli bir damlacık ve olgunlaşan oositler için cilostamid içermeyen bir damlacık hazırlayın. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve cilostamid olmadan olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Bazı oositleri olgunlaşma ortamında bir mikromoler cilostamid ile profaz I oosit kontrol grubu olarak tutun. Enjekte edilen oositleri daha önce hazırlanmış zaman atlamalı mikroskop kabındaki ilgili damlacıklarına aktarın.Kayıt sırasında hareketlerini önlemek için oositleri kapalı bir cam pipetle kümeleyin. Metnin el yazmasında belirtilen parametreleri kullanarak, çanağı ışık yayan diyot eliminasyon sistemi ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte tutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Uygulamalar'a ve ardından Çok Boyutlu Edinme'ye tıklayarak zaman atlamalı deneme için uygun ayarları girin.İlk sekme Ana'yı seçin ve zaman atlamalı, birden çok aşama konumu ve birden çok dalga boyu seçin. Denemenin kaydedileceği konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin. Ardından, zaman noktası, süre ve zaman aralığı sayısını girmek için Zaman Atlama sekmesini seçin.Yeni bir pencere açıp Canlı Al, Al ve Göster'i seçerek Sahne Alanı sekmesini seçin, brightfield'ı açın ve oositlerin konumunu bulun. Oositler bulunduktan sonra, çok boyutlu alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için artı tuşuna basın. Dalga Boyları sekmesini seçin ve brightfield, YFP ve mCherry için üç farklı dalga boyu ayarlayın.Ypet ve mCherry için pozlamayı ayarlayın, ardından Acquire'e tıklayarak zaman atlamalı denemeyi başlatın. Ypet üç asal UTR çevirisinin analizi için, her oosit için iki bölge ölçümü, elips bölgesine tıklayarak oosit kendisi ve dikdörtgen bölgeye tıklayarak arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'i çevreleyen küçük bir bölge gerçekleştirin. Günlüğü Aç'ı ve ardından Verileri Günlüğe Kaydet'i tıklatarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.Her bir oosit ve ölçülen tüm zaman noktaları için, arka plan bölgesi ölçümünü YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Profaz I ve olgunlaşan oositlerde mCherry ve YFP ifadesi 39 oositte kaydedilmiş, bunlardan 30'u olgunlaşmış ve dokuzu profaz I'de negatif kontrol olarak tutuklanmıştır. Profaz I-arrested ve olgunlaşan oositlerin sinyalleri için bireysel YFP ila mCherry oranları, YFP sinyalini profaz I-arrested ve olgunlaşan oositler için son 10 zaman noktasının ortalama mCherry sinyaline bölerek enjekte edilen hacim için düzeltildi.Muhabir YFP'nin çeviri oranları, YFP'yi profaz I'deki mCherry oranlarına uyan eğri ile ve ilk sıfır ila iki saat boyunca veya doğrusal regresyon kullanılarak cilostamid salınımı sonrası sekiz ila 10 saat boyunca olgunlaşan oositlerde ölçüldü. Muhabirin birikimi, cilostamid salınımı sonrası sıfır ila iki saat ile sekiz ila 10 saat arasındaki çeviri oranlarında önemli bir farkla belirtildiği gibi doğrusal bir desen izlemez, bu da oksilat miyotik olgunlaşma sırasında interlökin 7 çevirisinin aktivasyonunu gösterir. Bu protokolü denerken, kaydın başında pozlama süresinin yeterli olduğundan emin olun.Oosit meiotik yeniden başlaması sırasında çeviri etkinleştirilirse sinyalin zaman kursu sırasında doyabileceğini unutmayın. MRMA'nın stabilitesi, YFP için astarlar kullanılarak PCR ile doğrulanabilir. Çevirideki değişiklikleri onaylamak için, Batı şişkinliğini bir V5 teknolojisine karşı bir antikorla kullanabilirsiniz.

defining-program-maternal-mrna-translation-during-vitro-maturation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, bir fosfodiester inhibitörünün varlığında, oosit hücre döngüsünün faz-I'de durdurulduğunu ve bu sırada transkribe edilen mRNA'ların translasyon yokluğunda depolandığını gösteriyoruz. İnhibitörün serbest bırakılmasından sonra, oosit olgunlaşması devam eder ve hücreler metafaza girer. Metafaz-I'de hedef gen ile kaynaşmış raportör mRNA'nın sinyali, translasyonel mekanizmanın ve protein ekspresyonunun aktivasyonunu gösterir.

İn Vitro Tek Oosit Raportör Testi: In Vitro Oosit Olgunlaşması Sırasında Hedef mRNA Translasyon Regülasyonunu İncelemek İçin Bir Teknik

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Anne gen ürünlerinin işlenmesi için kullanılan zebra balığı oositlerin in vitro olgunlaşması için optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro döllenme ve ardından blastosist evresine kadar embriyo kültürü prosedürlerini açıklar.

Fare Oositleri In Vitro Olgunlaşma, Döllenme ve Preimplantasyon Embriyolarının Kültürü

Keşfedin: Tek bir oosit reporter tahlili kullanarak in vitro olgunlaşma sırasında maternal mRNA çeviri programını tanımlama yöntemini öğrenin. Bu teknik, çeviri düzenleyici elemanları belirlemeye yardımcı olur.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Daha fazla video keşfet