Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi
2 Şubat 2021
Burada sıçan substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron sayısının yarı nicel belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunuyoruz.
Substantia nigrada dopaminerjik nöron sayısının tahmin edilmesi Parkinson hastalığı araştırmalarında önemli bir sonuç ölçüsüdür. Bu protokol, nöron sayısını tahmin etmek için gereken iş yükünü önemli ölçüde kısaltır. Bu yöntem, dopaminerjik nöron sayısındaki değişiklikleri tespit etmek için zaman verimli ve doğru bir süreç sağlar ve müdahalelerin hücre sağkalımı üzerindeki etkisini belirlemek için uygundur.
Bu yöntem, geleneksel stereolojik yöntemlere göre maliyet ve zaman avantajlarını korurken, farklı beyin bölgelerindeki nöronların doğru sayılarını sağlamak için kolayca uyarlanabilir. IHC görüntülerini yakalamak için yazılımı 10X büyütmede bir konfokal mikroskopla birleştirilmiş olarak kullanın. Toplam 1,5 mikro metre geniş bir düzlemi yakalamak için pim deliğini 1,5 alan birimine açın ve odağı beynin enjekte edilen tarafına ayarlayın.
Edinme sekmesinde döşeme tarama görüntüleme seçeneğini işaretleyin ve boyutları 10'a dört olarak ayarlayın. Alma modu panelinin altında, döşeme tarama görüntüleri arasında dikiş işareti olmaması için yakınlaştırmayı 1,1 olarak ayarlayın. Yüksek kaliteli görüntü alımını sağlamak için çerçeve boyutunu 1024 x 1024 piksel ve ortalamayı ikiye ayarlayın.
Kanallar panelinde bir parçayı Alexa 488'e ve ikinci parçayı Alexa 555'e ayarlayın. Slaydı sahne alanına yükleyin ve güçlü bir TH boyamaya sahip bir bölüm seçin. Satın alma panelinde canlı olarak tıklayın.
Kanallar panelinde lazer gücünü ve kazancını sinyali en üst düzeye çıkaran ve arka plan gürültüsünü sınırlayan seviyelere ayarlayın. Sinyallerin aşırı pozlanmamasını sağlamak için aralık göstergesini kullanın. Bunu birden çok slaytla tekrarlayın.
Edinme sekmesinde pozisyonlar kutusunu işaretleyin. Görüntülemeye başlamak için göz parçasını kullanın ve pozitif TH lekesi gösteren ilk bölümü seçin. Ardından odağı ilgi çekici noktaya ayarlayın ve sahneyi bölümün orta çizgisine taşıyın.
Bu, X, Y ve Z eksenlerindeki konumu kaydeder ve tüm bölümü yakalayan bir döşeme taraması görüntüler. Eklenmemiş bir site de dahil olmak üzere diğer tüm slaytlar için bunu yineleyin. Uygun yazılımı kullanarak görüntü dosyalarını ayırıp otomatik görüntü analiz yazılımına aktarın.
Substantia nigra pars compacta'nın etrafına ek açıklama çizmek için kalem ek açıklama aracını seçerek ilgi çekici bir bölge tanımlayın. Analiz sekmesine gidin ve açılır çözümleme menüsünden gerçek zamanlı ayarlamayı seçin. Bu, bölüm görüntüsünde analiz parametrelerinin gerçek zamanlı olarak değiştirilmesine izin sağlayan ayrı bir pencere açar.
Analiz büyütme bölümünün altında uygun görüntü yakınlaştırmayı seçin. Hücre algılama bölümünün altında TH boyama için kullanılan boya olarak nükleer boyayı seçin. Zaman ayarlama penceresini dikkatle izlerken nükleer kontrast eşiğini, minimum nükleer yoğunluğu, nükleer segmentasyon agresifliğini ve nükleer boyut ayarlarını yapın.
Bu işlemi birden çok örnekle tekrarlayın. Uygun sayıda görüntü örneklendikten ve gerçek zamanlı ayarlama buna göre ayarlandıktan sonra, analiz ayarlarını ayarlar eylemleri açılır menüsüne kaydedin. Analiz edilecek tüm görüntüleri seçin ve analize tıklayın.
Yeni kaydedilmiş analiz ayarını seçin ve analiz penceresinde ek açıklama katmanları kutusunu işaretleyin, sonra birinci katmanı işaretleyin ve çözümle'yi tıklatın. Nesne çözümleme verilerini dışa aktarma seçeneğini belirleyerek tüm bölümlerin özet çözümleme verilerini dışa aktarmayı tamamladıktan sonra. Bu veri kümesi, bir toksine veya terapötik yanıt olarak hücre boyutundaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.
Adeno ilişkili virüs veya AAV enjeksiyonlarından altı hafta sonra, sıçan beynindeki substantia nigra içine mutant A53T alfa sinükleini ifade eden AAV'nin stereotaktik enjeksiyonu dopaminerjik nöronların yoğunluğunda önemli bir azalmaya neden oldu. AAV-A35T enjekte edilen sıçanların substantia nigra'sında kare başına ortalama TH pozitif nöron sayısı, AAV boş vektörü ile enjekte edilen sıçanlara kıyasla önemli ölçüde azaldı. Benzer gözlemler tarafsız stereology kullanılarak yapılmıştır.
Bu protokolü denerken, yazılımın yalnızca eğitilmiş olduğu kadar yararlı olduğunu unutmayın. Bu nedenle tek bir hücrenin tek bir hücre olarak tanımlanmasını sağlamak için zaman ve özen verilmelidir. Yazılım, tedavilerin protein seviyelerini modüle edip edep gösteremeyeceği belirlemek için alfa-sinüklein gibi diğer ilgi alanlarının floresan yoğunluğunu ölçmek için uyarlanabilir.
Bu teknik, birden fazla potansiyel terapötikin dopaminerjik nöron yoğunluğu üzerindeki etkisini test ederken daha fazla verimlilik sağladı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, sıçan substantia nigra pars compacta'da dopaminerjik nöron sayılarının yarı-kantitatif belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunar. Protokol, nöron sayımlarını tahmin ederken iş yükünü önemli ölçüde azaltır ve doğruluğu artırır, bu da Parkinson hastalığı araştırmalarında kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Psikiyatri
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Dopaminerjik nöron sayılarının tahmini, Parkinson hastalığı araştırmaları için hayati öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler zaman alıcı ve daha az doğru olabilir.
- Otomatik yöntemler, zaman verimliliği ve maliyet avantajları sağlayabilir.
- Nöron sayılarındaki kantitatif değişiklikler, terapötik etkileri değerlendirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Dopaminerjik nöron sayılarının verimli ve doğru tespiti için bir yöntem sunmak.
- Araştırmacıların çeşitli müdahaleler nedeniyle nöron sayılarındaki değişiklikleri analiz etmelerini sağlamak.
- Dopaminerjik nöronlar için görüntüleme ve veri analizi sürecini basitleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Konfokal mikroskopiyi kullanan otomatik görüntüleme yöntemi.
- Sıçan modelinde substantia nigra pars compacta'ya odaklanma.
- Protokol, 10X büyütmede belirli görüntüleme ayarlarıyla IHC görüntülerinin alınmasını içerir.
- Otomatik yazılım aracılığıyla gerçek zamanlı nöronel görüntülerin ayarlanması ve analizi.
- Müdahale sonrası nöron yoğunluğundaki değişiklikler için veri analizi dahil edilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Bu yöntem, mutant A53T alfa-sineklein ifade eden AAV enjeksiyonlarını takiben TH pozitif nöron yoğunluğunda önemli azalmalar göstermiştir.
- Sonuçlar, kontrol gruplarına kıyasla dopaminerjik nöron sayılarında bir azalma olduğunu göstermiştir.
- Bulguları doğrulamak için önyargısız stereoloji kullanılmıştır.
- Terapi uygulamalarına yanıt olarak morfolojik değişikliklerin tespit edilmesini sağlar.
Sonuçlar
- Çalışma, dopaminerjik nöronları kantitatif olarak belirlemeye yönelik verimli bir yöntemi doğrular.
- Bu teknik, Parkinson hastalığı modellerinde nöron kaybı hakkındaki anlamayı geliştirir.
- Sunulan yöntemler, terapötik etkilerin nöron yoğunluğu üzerindeki etkisini araştırmayı kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
