Hızlı ve Nicel Intravital Chick Chorioallantoic Membran Modeli Kullanılarak Metastatik Regülatörlerin Keşfi

Protokolümüz, izleyicide kanser istilalarını engelleyen gen veya gen kombinasyonlarının etkili bir şekilde tanımlanmasına izin sağlar. kültür üzerinde bakım için gelişmiş hayvan tesisleri gerektirmez. Bir bütün olarak, genel veya genel olarak özel kütüphaneler izleyicide birkaç hafta içinde taranabilir.

Bu tarama sistemi, araştırmacıların kanser metastazlarını engellemek için kullanılabilecek yeni terapötik gen hedeflerini veya gen hedefleri kombinasyonlarını keşfetmelerine yardımcı olacaktır. IV enjeksiyonu için, hücreleri seyreltmek veya yeniden askıya almak için buz gibi 1X PBS kullanarak hücreleri mililitre başına 0,5 ila 1 milyon hücreye konsantre edin. Her 10 embriyo için yaklaşık bir mililitre hücre süspansiyonuna ihtiyaç duyulacağını bekleyin.

Enjeksiyon cihazını monte etmek için şırıngaya bir iğne takın ve ardından şırınga iğnesini üç ila beş santimetre uzunluğunda bir boru parçasıyla uzatın. İnce asalar kullanarak borosilikat iğnesinin ucunu kırın. Şırıngayı kanser hücresi süspansiyonunun 50 ila 200 mikrolitresi ile yükleyin.

Ve borosilikat iğneyi boruya yerleştirin. İğneyi hücre tıkaması ve hava kabarcıkları için inceleyin. Kılcal damar içinde hücre tıkanıklığı görülürse, kılcal damarı çıkarın, hücreleri yeniden askıya alın ve yeni bir kılcal damarla değiştirin.

Kabarcıkları dışarı itmek için pistonu kullanın. Kapak kapağını çıkarın ve embriyoyu stereoskop altında aktarın. NORMALDE borosilikat iğne ucunun çapından sadece biraz daha geniş olan ve embriyo ile tartım çanağı duvarının ortasında bulunan CAM yüzeyine enjekte edilecek uygun damarı tanımlayın.

Damar çatallanmasının hemen bitişiğindeki noktaya enjekte etmek genellikle daha kolaydır. İğnenin ucunu kan damarı duvarına bastırın ve kan akışıyla aynı yönde hafif basınç uygulayın. Gerekirse, enjekte edilen kabın tutturulması veya stabilize edilmesine yardımcı olmak için bir pamuklu çubuk kullanın.

İstenilen hacim enjekte edilene kadar şırınna pistonu 2 ila 10 saniye boyunca hafifçe bastırın. Enjeksiyon yerinde aşırı kanama veya berrak sıvı birikimi görülürse embriyoyu atın. İğneyi CAM'dan çıkarın ve herhangi bir kan veya fazla kanser hücresini çıkarmak için enjeksiyon bölgesini hafifçe pamuklu çubukla dablayın.

Enjekte edilen embriyoyu tartım kabına kapakla örtün ve inkübatöre geri verin. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar prosedürü tekrarlayın. Embriyoları bakteri veya küf kirlenmesi veya ölüm için görsel olarak inceleyin.

Ve laboratuvar imha prosedürlerine göre kontamine embriyoları atın. Metastatik kolonilerin enjeksiyondan sonraki ilk bir ila üç gün boyunca tekdüze göründüğünden emin olun. Ve enjeksiyon sonrası 4 ila 5 gün içinde invaziv veya noninvaziv metastatik kolonileri tanımlayın.

Enjeksiyondan sonraki beşinci günde, embriyoları inkübatörden çıkarın ve embriyo CAL'lerini metastatik koloni dağılımı için inceleyin ve bulun. Diseksiyon mikroskobu altında, metastatik ilgi kolonisini içeren CAM dokusunu ince önpsler kullanarak yukarı doğru hafifçe çekin ve cerrahi makasla kesin. CAM dokuyu boş, steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüp kapağını kapatın.

Tüm ilgi kolonileri ayrı tüplere toplanana kadar eksizyon prosedürünü tekrarlayın. Her koloni için ayrı bir steril 18 gauge iğne kullanarak CAM dokusunu bir mikro santrifüj tüpünde hafifçe kıyın. 100 mikrolitre 1X kollajen-A çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Ortam sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri ve CAM dokusunu 300 kez G'de döndürün. Kollajen-A çözümünü özümseyin ve hücrenin ilgi alanı için tamamlanmamış medyayı yeniden askıya alın. Sonra hücreleri ve dokuyu tekrar döndürün.

Varsa, hücreleri ve doku parçalarını bir mililitre tam ortam ve seçim faktöründe yeniden askıya alın. Daha sonra tek bir 12 kuyu doku kültürü yemeğine iyi aktarın. Önümüzdeki bir ila üç hafta boyunca, kanser hücrelerini her gün büyüme ve kirlenme açısından izleyin.

Hücreler konfluensi% 70 ila 80'e ulaştığında, onları daha büyük hacimli bir kültür yemeğine aktarır. Yeterli kanser hücre sayısına ulaşılır ulaşılmaz sıralamaya veya bir sonraki seçim turuna geçin. Başarısız enjeksiyon nedeniyle kanser hücrelerinin birikmesini gösteren embriyolar, kılcal damarların çoğunda görülebilir.

Optimal hücre konsantrasyonu ve enjeksiyon süresi elde edildiğinde, enjeksiyon sonrası beşinci gün transdüklenmiş hücreler, cam dokusunda dağılmış görünen kanser hücreleri tarafından belirlenen kolonilerin çoğunluğu invaziv olan çok çeşitli koloni fenotipleri üretmelidir. Kompakt görünen ve komşu kolonilerden yeterince uzakta bulunan metastatik kolonilere dikkat edilmelidir, böyleler tops ve makas ve bir parça CAM doku ile ekslenebilirler. İzole edilmiş pozitif ekran vuruşu, yeniden enjeksiyon sırasında kompakt koloni fenotipini göstermelidir.

Kanser hücresi kan damarı temaslarının ölçümü için damar duvarı leke parlaklığına dikkat edilmeli ve damar duvarı sinyali için uygun miktarda lektin enjekte edilmelidir. Bu protokolü denerken enjeksiyon altında veya üzerinde kaçının ve aşırı kanama veya sıvı birikimini giderin. Bu teknik kullanılarak, izleyicide kanser hücre istilasına yol açan birkaç yeni gen tanımlanmıştır.