Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Bu protokol ile tek molekül seviyesinde restriksiyon endonükleazları ile bölgeye özgü DNA bölünmesini doğrudan gözlemleyebiliyoruz. Çoğullanmış yaklaşımımız, yüzlerce bireysel REaz'ın katalitik döngüyü tamamlaması için geçen süreyi ölçmemizi sağlar. Çoğullama, DNA bölünmesinin mekanizması hakkında bilgi edinmek için gama olasılık dağılımına sığdırabileceğimiz bölünme dağılımları için iyi doldurulmuş bekleme süresi oluşturmamızı sağlar.

Her tüpe 50 mikrolitre oligonükleotid ve 50 mikrolitre taze hazırlanmış DTT çözeltisinde yeniden süspanse edilmiş her oligonükleotit için yeni bir tüp hazırlayarak başlayın, karıştırmak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Her bir numune karışımının tüm hacmini hazırlanmış bir kolona nazikçe pipetleyin ve 750G'de iki dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tiyol gruplarının oksidasyonunu ve disülfür bağlarının oluşumunu önlemek için hemen kullanılmayacak numuneleri 20 santigrat derecede saklayın.

Yapılacak her yapı için 50 mikrolitrelik kuantum nokta stoğundan bir alikotu bir diyaliz cihazına pipetleyin ve pipet ucuyla zara dokunmamaya dikkat edin. 15 dakika boyunca 100 RPM'de karıştırarak numune hacminin en az 1.000 katı olan bir CHES tamponu hacmine karşı diyaliz edin. Bir pipetleyici kullanarak, asılı kuantum noktalarını diyaliz cihazından dikkatlice alın ve bunları eşit hacimde taze hazırlanmış Sulfo-SMCC solüsyonu içeren yeni bir tüpe aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Sulfo-SMCC'nin kuantum noktaları üzerindeki birincil aminlerle reaksiyona girmesine izin vermek için 1.000 RPM'de çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Ardından, her bir numuneyi dikkatli bir şekilde yeni bir diyaliz cihazına aktarmak için bir pipetleyici kullanın. Fazla Sulfo-SMCC'yi çıkarmak için, diyaliz cihazında bulunan hacmin en az 1.000 katı olan bir CHES tamponu hacmine karşı 15 dakika karıştırarak diyalize edin.

Tamponu iki kez değiştirin ve toplamda üç kez taze CHES tamponu ile diyaliz gerçekleştirin, böylece diyalizin her tampon değişiminden sonra 15 dakika devam etmesine izin verin. Daha sonra diyalizi PBS ile tekrarlayın. Bir pipetleyici kullanarak, diyaliz cihazından kuantum noktalarını içeren çözeltiyi dikkatlice geri kazanın ve her bir numuneyi, PBS'de seyreltilmiş eşmolar miktarda dilate oligonükleotid içeren yeni bir tüpe aktarın.

1.000 RPM'de çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Mililitre başına 0,5 miligramlık bir nihai konsantrasyon için her numuneye BSA ekleyin. Ardından, her bir numuneyi dikkatli bir şekilde yeni bir diyaliz cihazına aktarmak için bir pipetleyici kullanın ve depolama tamponuna karşı diyalize girin.

Diyalizden sonra, her numuneyi dikkatlice geri alın ve yeni bir tüpe koyun. Numuneleri 4 santigrat derecede saklayın. Kuantum nokta etiketli oligonükleotidlerin bir örneğini, on kat molar fazla biyotinile oligonükleotid ile birleştirin.

Karışımı bir ısı bloğunda 75 santigrat dereceye ısıtın ve 5 dakika bu sıcaklıkta tutun. Ardından ısı bloğunu kapatın ve karışımın yavaşça soğumasını bekleyin. Tamamlanan yapıyı 4 santigrat derecede saklayın Konik bir elmas uçlu tekerlek ucu ile donatılmış el tipi bir döner çok amaçlı alet kullanarak, giriş ve çıkış görevi görmesi için kuvars sürgünün zıt köşelerine iki delik açın.

Delme sırasında sürgüyü yerine sabitlediğinizden, ucu yağladığınızdan ve sürekli olarak suyla kaydırdığınızdan emin olun. Her deneyden sonra, yapıştırıcıyı ve epoksiyi çözmek için kullanılmış cihazı asetona batırarak hazırlanan kuvars slaytı geri kazanın. Kalan bileşenleri atın.

25 mikrolitre streptavidin çözeltisini 80 mikrolitre PBS ve 20 mikrolitre bloke edici tampon ile birleştirin. PEG ile muamele edilmiş bir lameti bu karışımla kaplayın ve nemli bir ortamda 30 dakika inkübe edin. Kapak kaymasının inkübasyonu sırasında, bir akış kanalı oluşturmak için görüntüleme ara parçasını hazırlayın.

1 inç karelik bir görüntüleme ara parçası parçası kesin, ardından kuvars slaytta açılan deliklerin uçlarına hizalanmış 2 milimetre genişliğinde bir kanalı işaretleyin. Kanalı bir neşter ile ara parça malzemesinden kesin. Önceki deneylerden kalan yapışkan kalıntılarını gidermek için kuvars slaytı asetonla iyice temizleyin.

Desteğin bir tarafını görüntü ara parçasından soyun ve giriş ve çıkış deliklerini kapatmamaya dikkat ederek dikkatlice kuvars slaytın üzerine yerleştirin. Kapak fişini suyla yıkayın ve basınçlı hava ile kurulayın. Desteğin diğer tarafını görüntüleme ara parçasından çıkarın ve düzeneği birbirine bastırmak ve yapıştırıcıdaki hava kabarcıklarını çıkarmak için plastik cımbız kullanarak kuvars slayt ile işlevselleştirilmiş streptavidin kaplı kapak fişi arasına sıkıştırın.

Çözeltinin serbest akışını sağlamak için borunun ucunu belirli bir açıyla kesin. Ardından, kuvars slayttaki her deliğe 30 santimetre uzunluğunda polietilen boru yerleştirin. Tüpleri bir tüp rafı ile yerinde tutun, ardından tüpleri yerine ve monte edilen cihazın kenarlarını kapatmak için epoksi kullanın.

Epoksi ayarlandıktan sonra, kör iğneyi boş bir şırınga üzerine cihazın çıkış borusuna yerleştirin ve giriş borusunun ucunu bloke edici tamponla dolu bir kaba daldırın. Cihazı bloke edici tamponla doldurmak için şırınga pistonunu geri çekin. Ardından, kullanmadan önce cihazı en az 30 dakika inkübe etmeye bırakın.

Mikroakışkan cihazı mikroskop tabla plakasına bantla takın. Objektifi cihazın alt kısmı ile temas ettirin ve objektifi, görüş alanı mikroakışkan kanal içinde olacak şekilde konumlandırın. Çıkış borusunu şırınga pompasına bağladıktan sonra, şırınga pistonunu geri çekerek mikroakışkan kanalı yeni engelleme tamponu ile yıkayın.

Boruda veya kanalda sıkışmış kabarcık olmadığından emin olmak için kontrol edin. Hazırlanan DNA substratının 1 mikrolitresini 1 mililitre bloke edici tampona seyreltin. Giriş tüpünü seyreltilmiş DNA substratına yerleştirin ve 800 mikrolitre substrat solüsyonunu dakikada 200 mikrolitre hızında kanaldan akıtın.

Akış durduktan sonra DNA çözeltisinin kanalda 15 dakika inkübe etmesine izin verin. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış DNA'yı kanaldan durulamak için dakikada 200 mikrolitre hızında kanaldan en az 800 mikrolitre bloke edici tampon akıtın. Mikroskop odağını, yüzeye bağlı kuantum noktaları net bir şekilde görülebilecek şekilde ayarlayın.

Mikroakışkan cihazı, dakikada 200 mikrolitre akış hızında magnezyum içermeyen 800 mikrolitre deneysel tamponla yıkayın. REase'i magnezyum içermeyen bir deney tamponuna ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın. Dakikada 200 mikrolitre akış hızında kanaldan mililitre EcoRV başına 400 birimden 800 mikrolitre akıtın.

Magnezyum ve floresein içeren deneysel tamponu dakikada 200 mikrolitre akış hızında akıtarak deneye başlayın. Şırınga pompasını başlattıktan hemen sonra veri toplamaya başlayın. 800 mikrolitre tampon akıttıktan sonra veri toplamayı durdurun.

DNA substratını akış hücresine soktuktan ve fazla DNA ve kuantum noktalarını yıkadıktan sonra, bir görüş alanında tipik olarak binlerce bireysel kuantum noktası vardır. Cam yüzeye stabil bir şekilde tutturulurlar ve deney boyunca gözle görülür bir karartma veya önemli ağartma geçirmezler. REase, magnezyum yokluğunda kanaldan aktığında, deneyin başında bulunan kuantum noktalarının en az% 95'i gözlem süresinin sonunda hala görülebilir.

Bununla birlikte, magnezyum içeren tampon REaz'dan hemen sonra akıtıldığında, REaz ve magnezyum kanaldan birlikte aktığında gözlemlenene benzer şekilde, gözlem süresinin sonunda kuantum noktalarının yarısına kadar kaybolur. Kuantum nokta kaybolması hızlı bir şekilde gerçekleşir ve yoğunluk yörüngesinde keskin bir azalmaya neden olur ve belirli bir DNA molekülünün parçalanma süresinin net bir göstergesini sağlar. Bu deney, iyi çalışılmış tip II P REase EcoRV ile gerçekleştirildi.

Verilerden n ve beta değerlerini çıkarmak için hem doğrusal olmayan en küçük kareler eğrisi uydurma hem de maksimum olabilirlik parametresi tahmini kullanılmıştır. İki parametreli tahmin yöntemi uyum içindeydi. Doğrusal olmayan en küçük kareler uyumu kullanıldığında, n 3.52 ve beta 5.78 saniye idi.

Maksimum olabilirlik tahminini kullanarak, n 3.41 ve beta 6.06 saniye idi. Bu tahlil, bölünme yolu boyunca ara adımların varlığına dair kanıt sağlayabilir. Bu tahlilin değişen reaksiyon koşulları altında gerçekleştirilmesi, doğrudan gözlemlenemeyen reaksiyon ara ürünlerinin doğasının belirlenmesine yardımcı olabilir.