Name: Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Öğrenin, restriksiyon endonükleazların tek moleküllü DNA bölünme mekanizmalarını çoklu ölçüm yaklaşımıyla incelemeyi. Bu yöntem, yüzlerce enzimin katalitik döngüsünü gözlemleyerek detaylı bekleme süresi dağılımları oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden CME'ye verilen K12GM074869 Numaralı Ödül ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

<ol><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li>
<li>Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+of+the+DNA+cutters%3A+a+short+history+of+the+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).</li>
<li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBASE--a+database+for+DNA+restriction+and+modification%3A+enzymes%2C+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 298-299 (2015).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+and+jumping+of+single+EcoRV+restriction+enzymes+on+non-cognate+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).</li>
<li>Huang, C. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+DNA+recognition+by+restriction+endonuclease+EcoRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI.</a> Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).</li>
<li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+biomolecular+nanoarrays+for+parallel+single-molecule+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations.</a> Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).</li>
<li>Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+plasmon+coupling+to+reveal+the+dynamics+of+DNA+bending+and+cleavage+by+single+EcoRV+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).</li>
<li>van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-tension+dependence+of+restriction+enzyme+activity+reveals+mechanochemical+properties+of+the+reaction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway.</a> Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).</li>
<li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li>
<li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li>
<li>Loparo, J. J., van Oijen, A. Single-molecule enzymology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoparo%2C+JJ+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22">Handbook of Single-Molecule Biophysics</a>. Hinterdorfer, P., Oijen, A. , Springer. New York, NY. 165-182 (2009).</li>
<li>Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoRV+restriction+endonuclease+binds+all+DNA+sequences+with+equal+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity.</a> Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529(2009).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689(2010).</li>
<li>Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reaction+analysis+of+the+catalytic+cycle+of+the+EcoRV+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).</li>
<li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li>
<li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated%2C+Au%2FAg+striped+nanowires+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur

Bu tahlil için DNA substratı, sulfo-SMCC kullanılarak iki aşamalı bir reaksiyon şeması kullanılarak bir kuantum noktası ile etiketlenir. Bu iki işlevli çapraz bağlayıcı, bir birincil amin ile reaksiyona girebilen bir NHS ester kısmından ve bir sülfhidril grubu20 ile reaksiyona girebilen bir maleimid kısmından oluşur. Substratı hazırlamak için kullanılan tiyollü oligonükleotidler, oksitlenmiş formda gönderilir. Kuplaj prosedürüne devam etmeden önce bunları açıklandığı gibi azaltmak ve saflaştırmak ...

Restriksiyon endonükleazları (REazlar), DNA'da diziye özgü çift iplikçik kırılmalarını etkileyen enzimlerdir. 1970'lerde REazların keşfi, rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesine yol açmıştır ve bu enzimler artık genetik modifikasyon ve manipülasyon için vazgeçilmez laboratuvar araçlarıdır1. Tip II REazlar, DNA'yı tanıma dizileri içinde veya yakınında sabit bir yerde parçaladıkları için bu sınıfta en yaygın kullanılan enzimlerdir. Bununla birlikte, Tip II REazlar arasında çok fazla varyasyon vardır ve evrimsel ilişkilerine göre sınıflandırılmak yerine belirli enzimatik özelliklere dayalı olarak birkaç alt tipe ayrılırlar. Her bir alt tip arasında, sınıflandırma şemasında sık sık istisnalar vardır ve birçok enzim birden fazla alt tipeaittir 2. Binlerce Tip II REaz tanımlanmıştır ve yüzlercesi ticari olarak temin edilebilir.
Bununla birlikte, Tip II REazlar arasındaki çeşitliliğe rağmen, çok az REase ayrıntılı olarak incelenmiştir. 1975 yılında Sir Richard Roberts tarafından kurulan rebase enzim veri tabanı REBASE'e göre,bu enzimlerin 20'den azı için yayınlanmış kinetik veriler mevcuttur. Ayrıca, bazı REazlar, tanıma dizileri 4,5,6,7 ile karşılaşmadan ve bağlanmadan önce DNA boyunca yayılırken doğrudan tek molekül düzeyinde gözlemlenmiş olsa da, bölünme reaksiyonu kinetiğine ilişkin çok az tek molekül çalışması vardır. Mevcut çalışmalar ya tek bölünme olaylarının meydana geldiği zamanlardaki değişimin ayrıntılı analizini yapmak için yeterli istatistik rapor etmemektedir 8,9,10 ya da bölünme sürelerinin tam dağılımını yakalayamamaktadır11. Bu tür bir analiz, nispeten uzun ömürlü kinetik ara ürünlerin varlığını ortaya çıkarabilir ve REaz aracılı DNA bölünmesinin mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
Tek molekül düzeyinde, biyokimyasal süreçler stokastiktir - sürecin tek bir örneğinin gerçekleşmesi için bekleme süresi, τ, değişkendir. Bununla birlikte, birçok τ ölçümünün, gerçekleşen sürecin türünün göstergesi olan bir olasılık dağılımına, p(τ) uyması beklenebilir. Örneğin, bir enzimden bir ürün molekülünün salınması gibi tek adımlı bir süreç, Poisson istatistiklerine uyacak ve p(τ) negatif bir üstel dağılım şeklini alacaktır:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
burada ortalama bekleme süresi β. İşlem oranının, k'nin, ortalama bekleme süresinin tersi olan 1/β'ye eşit olacağını unutmayın. Birden fazla adım gerektiren süreçler için, p(τ), her bir adım için tek üstel dağılımların evrişimi olacaktır. Aynı ortalama bekleme sürelerine sahip N tek üstel bozunma fonksiyonunun evrişimi için genel bir çözüm, β, gama olasılık dağılımıdır:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
Burada Γ(N), N-1'in faktöriyelinin N'nin tamsayı olmayan değerlerine enterpolasyonunu tanımlayan gama fonksiyonudur. Bu genel çözüm, bireysel adımların ortalama bekleme süreleri benzer olduğunda bir yaklaşım olarak kullanılabilse de, nispeten hızlı adımların varlığının, önemli ölçüde daha uzun bekleme sürelerine sahip adımlar tarafından maskeleneceği anlaşılmalıdır. Başka bir deyişle, N değeri,12 adımlarının sayısında bir alt sınırı temsil eder. Yeterli sayıda bekleme süresi ölçümü ile, β ve N parametreleri, olayların gruplandırılması ve gama dağılımının elde edilen histograma uydurulması veya maksimum olabilirlik tahmin yaklaşımı kullanılarak tahmin edilebilir. Bu nedenle, bu tür bir analiz, topluluk tahlillerinde kolayca çözülemeyen kinetik adımların varlığını ortaya çıkarabilir ve parametreleri doğru bir şekilde tahmin etmek için çok sayıda gözlem gerektirir12,13.
Bu makale, yüzlerce bireysel REaz aracılı DNA bölünme olayını paralel olarak gözlemlemek için kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu kullanmak için bir yöntemi açıklamaktadır. Testin tasarımı, birkaç deneyin sonuçlarını bir araya getirmeyi mümkün kılar ve binlerce olay içeren bekleme süresi dağılımları oluşturabilir. Kuantum noktalarının yüksek fotostabilitesi ve parlaklığı, deneyin başlamasından birkaç dakika sonra bile meydana gelen bölünme olaylarını gözlemleme yeteneğinden ödün vermeden 10 Hz'lik bir zaman çözünürlüğüne izin verir. İyi zamansal çözünürlük ve geniş bir dinamik aralık, büyük bir veri seti toplama yeteneği ile birleştiğinde, 1 dakika-1 aralığında devir oranlarına sahip REase'lerin bölünme yollarında çoklu kinetik adımların varlığını ortaya çıkarmak için bekleme süresi dağılımlarının doğru karakterizasyonuna izin verir. EcoRV durumunda, tümü başka yollarla tanımlanmış olan üç kinetik adım çözülebilir ve bu da tahlilin bu tür adımların varlığına duyarlı olduğunu doğrular.
İlgilenilen tanıma dizisini içeren dubleks DNA substratları, biyotinillenmiş bir oligonükleotidin, tek, kovalent olarak bağlı yarı iletken nanokristal kuantum noktası ile etiketlenmiş tamamlayıcı bir zincire tavlanmasıyla üretilir. Bu substratlar, yüzeyine kovalent olarak bağlanmış yüksek moleküler ağırlıklı polietilen glikol (PEG) moleküllerinden oluşan bir çim ile bir cam lamel üzerine inşa edilmiş bir akış kanalına sokulur. DNA substratları, serbest uçlarında bir biyotin bulunan PEG moleküllerinin bir kısmı tarafından bir biyotin-streptavidin-biyotin bağlantısı yoluyla yakalanır. TIRF mikroskobunda, cam-sıvı arayüzünden uzaklaştıkça katlanarak azalan bir buharlaşma dalgası aydınlatma sağlar; Penetrasyon derinliği, kullanılan ışığın dalga boyu sırasına göredir. Bu koşullar altında, yalnızca işlevselleştirilmiş cam yüzey üzerinde yakalanan bir DNA molekülü tarafından yüzeye bağlanan kuantum noktaları uyarılacaktır. Çözeltide serbest olan kuantum noktaları, aydınlatılan bölge içinde kısıtlanmayacak ve bu nedenle ışıldamayacaktır. Bir kuantum noktasını yüzeye bağlayan DNA parçalanırsa, bu kuantum noktası yüzeyden yayılmak için serbest kalacak ve floresan görüntüsünden kaybolacaktır.
Birçok Tip II REaz'ın magnezyum14 yokluğunda DNA'yı bağladığı bilinmesine rağmen, hepsi DNA bölünmesine aracılık etmek için magnezyum gerektirir15. Bu REazlar, magnezyum yokluğunda yüzeyde hareketsiz hale getirilmiş DNA'yı bağlayabilir. Magnezyum içeren tampon, DNA'ya REaz önceden bağlanmış bir kanaldan aktığında, kuantum noktalarının kaybolmasıyla gösterildiği gibi bölünme hemen başlar. REaz moleküllerinin önceden bağlanması ve ardından magnezyum eklenerek DNA bölünmesinin başlatılmasıyla elde edilen senkronizasyon, bir deneyde gözlemlenen enzim popülasyonundaki her molekül için bağımsız olarak DNA bölünmesinin tamamlanmasına kadar geçen gecikme süresinin ölçülmesini kolaylaştırır. Floresein, magnezyumun görüş alanına gelişini belirtmek için magnezyum içeren tampona izleyici bir boya olarak dahil edilir. Magnezyum içeren tamponda hiçbir enzim bulunmadığından, magnezyum içeren tamponun gelişinden her bir kuantum noktasının kaybolmasına kadar geçen gecikme süresi, DNA'ya zaten bağlı olan bir REaz'ın DNA'yı parçalaması ve kuantum noktasını cam yüzeyden serbest bırakması için geçen süreyi gösterir. Kuantum nokta kaybolması hızlı bir şekilde gerçekleşir ve yoğunluk yörüngesinde keskin bir azalmaya neden olur ve belirli bir DNA molekülünün parçalanma süresinin net bir göstergesini sağlar. Olay sürelerinin belirlenmesi, yoğunluk yörüngelerinin matematiksel analizi ile gerçekleştirilir ve tipik bir deney, yüzlerce tanımlanabilir bölünme olayıyla sonuçlanır. Birden fazla deneyin sonuçları, doğrusal olmayan en küçük kareler veya maksimum olabilirlik analizi ile N ve β parametrelerinin tahminine izin vermek için yeterli istatistikler sağlamak üzere bir araya getirilebilir.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropiltrietoksisilan (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>Kurutucu kutusunda saklayın</td></tr><tr><td>5 Dakika Epoksi</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>mikroakışkan cihazı sızdırmaz hale getirmek için kullanın</td></tr><tr><td>aseton</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>lamelleri temizlemek için kullanın</td></tr><tr><td>banyo sonikatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPXH Model 2800</td><td>katalog numarası 15-337-410</td></tr><tr><td>Beher, cam, 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Süksinimidil Valerate (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>Süksinimidil valerat, süksinimidil karbonattan daha uzun bir yarı ömre sahiptir</td></tr><tr><td>biyotinillenmiş oligonükleotid</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel - tasarım hususları için protokole bakın</td><td>İstek 5' Biyotin modifikasyonu ve HPLC saflaştırma</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>, 10 mg / mL'lik bir çözelti (sulu) hazırlayın ve 95 ° C'ye ısıtın; C</td></tr>, <tr><td>Centri-Spin-10'u kullanmadan önce, Boyut Dışlama Sıkma Sütunları</td>, <td>Princeton Ayrımları</td><td>CS-100 veya CS-101</td>, <td>disülfid bağını indirgedikten sonra tiyollenmiş oligonükleotidleri saflaştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri 1.5. mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lameller, 1 inç kare cam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamel tutucular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elmas nokta tekerleği</td><td>Dremel</td><td>7134</td><td>kuvars akış hücresi kabında delik delmek için kullanım</td></tr><tr><td>ditiyotreitol (DTT)Thermo</td> <td>Scientific</td><td>A39255</td><td>Tartımsız Format, 7,7 mg/flakon</td></tr><tr><td>matkap presi döner alet iş istasyonu standı</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>kuvars sondajını kolaylaştırır</td></tr><tr><td>EcoRV (örnek veri oluşturmak için kullanılan REase)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195T veya R0195M</td><td>Fazla gliserol eklemekten kaçınmak için 100.000 birim/mL stok kullanın Diğer REases etanol tedarikçileri için REBASE'i kontrol edin</td></tr><tr><td></td><td>çeşitli</td><td>CAS 64-17-5</td><td>denatüre veya %95 kabul edilebilir, lamellerin temizlenmesi için kullanın</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra, susuz, kurutucu kutusunda saklayın</td></tr><tr><td>Pire Mikro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>3 mm x 10 mm boyut, lamel rafın altına sığacak</td></tr> şekilde <tr><td>floresein</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>deneysel tamponlar yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>yerçekimi konveksiyonlu fırın</td><td>Binder</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>el tipi döner çok amaçlı el aleti</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>kuvars akışında delik delmek için kullanın</td></tr><tr><td>hücre kabı ImagEM X2 EM-CCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>hava soğutması bu deney için yeterlidir, kontrol etmek için HCImage yazılımı veya benzerini kullanın</td></tr><tr><td>Görüntüleme ara parçası, çift taraflı, yapışkan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kavanoz, vidalı kapaklı cam, (yaklaşık 50 mm çapında ve 50 mm yüksekliğinde)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP214-500</td>, magnezyum MATLAB yazılımı <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ile deneysel tampon yapmak için kullanın</td><td>Veri analizi</td></tr><tr><td>metal cımbız</td><td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>metoksi-PEG-Süksinimidil Valerate (MW 5.000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>Reaksiyon hızının tutarlı olması için her iki PEG de aynı NHS esterine sahip olmalıdır</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>çok konumlu manyetik karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>N-sikloheksil-2-aminoetansülfonik asit (CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9,</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpleri için CHES tampon orbital çalkalayıcı ve ısıtıcı yapmak için</td> kullanın <td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td>, <td>24 x 2.0 mL veya 15 x 0.5 mL tüpler için 1808-1061 adaptörlü</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 Polietilen boru (iç çap 0.76 mm, dış çap 1.22 mm)</td><td>Intramedic</td><td>6258917</td><td>22 G künt iğneler bu boru boyutu için iyi bir seçimdir</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>1x mukavemette</td></tr><tr><td>potasyum hidroksitte</td> kullanın <td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9262</td><td>lamellerin temizlenmesi için 1 M'lik bir çözelti kullanın</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars Slayt, 1 inç kare, 1 mm kalınlığında</td><td>Elektron Mikroskobu Sciences</td><td>72250-10</td><td>giriş ve çıkış boruları için köşelerde delikler açılmalıdır, boru yerleştirme</td></tr><tr><td>takviyeli plastik cımbız</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>, lamelleri işlemek ve mikroakışkan cihaz oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>, SecureSeal Yapışkan Levhalar</td>, <td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td>, <td>mikroakışkan cihaz için ara parça oluşturmak üzere kesilir</td></tr>, <tr><td>Mikroakışkanlar için tek kanallı şırınga pompası</td><td>Yeni Çağ Pompa Sistemleri</td><td></td><td>50 mL şırınga ve 22 G künt iğne ile donatılmış</td>NE-1002X-US</tr><tr><td>Slide-a-Lyzer MINI Diyaliz Cihazları, 10 kDa MWCO, 0.1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 veya 69572</td>, DNA sodyum bikarbonata <td>kuantum nokta eşleşmesi sırasında tampon değişimi için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td>, <td>yüzey işlevselleştirmesi için tampon yapmak için kullanılır; 100 mM, pH 8</td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td>deneysel tamponlar yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik çözelti (BioUltra, suda 0,5 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>100 mM sodyum fosfat tamponu yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik çözelti (BioUltra, suda 5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>100 mM sodyum fosfat tamponunun pH'ını ayarlamak için kullanın</td></tr><tr><td>Streptavidin Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>1 mg / mL'de çözün ve 25 mL aliqouts'u -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Sülfosüksinimidil-4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (sülfo-SMCC)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>Ağırlıksız Format, 2 mg / flakon</td></tr><tr><td>Künt 21 G iğne</td><td></td><td></td><td></td>ile donatılmış şırınga Şırınga</tr><tr><td>pompası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tiyollü oligonükleotid</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel - tasarım hususları</td> <td>için protokole bakınİstek 5 'Tiyol Değiştirici C6 SS ve HPLC arıtıcı</td></tr><tr><td>488 nm lazer aydınlatmalı TIRF görüntüleme sistemi</td><td>çeşitli</td><td></td><td>özel yapım</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>T60050</td><td>deneysel tamponlar yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>JT Baker</td><td>4101</td><td>deneysel tamponlar yapmak için</td></tr><tr><td>kullanın Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>engelleme yapmak için kullanın tampon</td></tr><tr><td>Ultrasaf su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>girdap karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Lamel Rafı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>70366-16</td><td>lamellerin yüzey işlevselleştirilmesi için kullanılır</td></tr></tbody></table>

restriksiyon endonükleaz aracılı dna bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Bu yeni toplam yansıma floresan mikroskobu tabanlı tahlil, tek bir deneyde yüzlerce ayrı kısıtlama endonükleaz (REase) molekülü için katalitik döngünün uzunluğunun aynı anda ölçülmesini kolaylaştırır. Bu tahlil protein etiketlemesi gerektirmez ve tek bir görüntüleme kanalı ile gerçekleştirilebilir. Ek olarak, birden fazla bireysel deneyin sonuçları, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir havuzda toplanabilir. Elde edilen bekleme süresi dağılımlarının analizi, doğrudan gözlemlenemeyen kinetik adımların varlığını ortaya çıkararak DNA bölünme mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olabilir. İyi çalışılmış REase ile bu test kullanılarak toplanan örnek veriler, EcoRV - palindromik dizi GAT↓ATC'yi (burada ↓ kesilen bölgedir) parçalayan bir dimerik Tip IIP kısıtlama endonükleazı - önceki çalışmalarla uyumludur. Bu sonuçlar, EcoRV'nin yokluğunda DNA'yı bağlamasından sonra magnezyumun eklenmesiyle başlatılan ve her adım için ortalama 0.17 s-1 oranıyla DNA bölünmesine giden yolda en az üç adım olduğunu göstermektedir.

Akış hücresi, objektif TIRF görüntüleme için lazer aydınlatması ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde yüksek sayısal açıklıklı yağa daldırma 60x büyütme objektifine doğrudan bağlanır (Şekil 5A). DNA substratını tanıttıktan ve fazla DNA ve kuantum noktalarını yıkadıktan sonra, bir görüş alanında tipik olarak binlerce bireysel kuantum noktası vardır (Şekil 5B). Bu kuantum noktaları, cam yüzeye kararlı bir şekilde tutturulur ve deneyin zaman ölçeği b...

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Bu protokol ile tek molekül seviyesinde restriksiyon endonükleazları ile bölgeye özgü DNA bölünmesini doğrudan gözlemleyebiliyoruz. Çoğullanmış yaklaşımımız, yüzlerce bireysel REaz'ın katalitik döngüyü tamamlaması için geçen süreyi ölçmemizi sağlar. Çoğullama, DNA bölünmesinin mekanizması hakkında bilgi edinmek için gama olasılık dağılımına sığdırabileceğimiz bölünme dağılımları için iyi doldurulmuş bekleme süresi oluşturmamızı sağlar.Her tüpe 50 mikrolitre oligonükleotid ve 50 mikrolitre taze hazırlanmış DTT çözeltisinde yeniden süspanse edilmiş her oligonükleotit için yeni bir tüp hazırlayarak başlayın, karıştırmak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Her bir numune karışımının tüm hacmini hazırlanmış bir kolona nazikçe pipetleyin ve 750G'de iki dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tiyol gruplarının oksidasyonunu ve disülfür bağlarının oluşumunu önlemek için hemen kullanılmayacak numuneleri 20 santigrat derecede saklayın.Yapılacak her yapı için 50 mikrolitrelik kuantum nokta stoğundan bir alikotu bir diyaliz cihazına pipetleyin ve pipet ucuyla zara dokunmamaya dikkat edin. 15 dakika boyunca 100 RPM'de karıştırarak numune hacminin e

single-molecule-dwell-time-analysis-restriction-endonuclease-mediated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA'dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

DNA'ın sistemleri tarafından Rad51 aracılı Satım tepki strand floresans rezonans enerji transferi tabanlı gerçek zamanlı gözlem için geliştirilmiştir. Burada sunulan iletişim kurallarını kullanarak, biz tepki ara ürün ve ayrıca reaksiyon enzimatik kinetik analiz ederken onların dönüşüm ürünlerde, oluşumu tespit edebiliyoruz.

Rad51 tarafından aracılı DNA Strand Exchange tepki gerçek zamanlı gözlem

Burada sunulan HJ çözünürlüğü çalışma için tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi gerçekleştirmek için bir protokoldür. Dissosilasyon sabitlerini belirlemek için iki renkli alternatif uyarma kullanılır. Tek renkli zaman atlamalı smFRET daha sonra HJ çözünürlüğünden önce çalışma süresi dağılımını elde etmek için gerçek zamanlı dekolte tahlillerinde uygulanır.

HOLLIday Kavşak Çözünürlüğünün GEN1 Tarafından Gerçek Zamanlı İncelenmesi için Tek Moleküllü Förster Rezonans Enerji Transfer Yöntemleri

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Öğrenin, restriksiyon endonükleazların tek moleküllü DNA bölünme mekanizmalarını çoklu ölçüm yaklaşımıyla incelemeyi. Bu yöntem, yüzlerce enzimin katalitik döngüsünü gözlemleyerek detaylı bekleme süresi dağılımları oluşturur.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Daha fazla video keşfet