Floresan Etiketli Sarkom Proteinleri kullanılarak Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerin Sarkomer Kısaltılması.

Pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositlerde sarkomer fonksiyonunu az gelişmiş ve dağınık sarkomerleri nedeniyle değerlendirmek zordur. Floresan etiketli sarkom proteinlerini kullanarak artık sarkom kısaltmaya erişebiliriz. Sarkomları görselleştirebilir ve kök hücreden türetilmiş kardiyomiyositler ve floresan etiketli sarkomere proteinleri kullanarak in vitro işlevlerini değerlendirebiliriz.

AAV tabanlı transdüksiyon kullanarak, yöntemi herhangi bir hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreye genişletebiliriz. Bu yöntem kardiyomiyopati tedavisinin gelişimine genişletilebilir, çünkü hastalığa bağlı sarkom disfonksiyon in vitro'yu doğrudan değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntem pediatrik kardiyoloji çalışması da dahil olmak üzere kardiyoloji alanında yararlıdır.

Bununla birlikte, miyopati gibi iskelet kas disfonksiyonu çalışmasına da uygulanabilir. Diferansiyon indüksiyonunun eksi dört gününde, PBS'de 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon ve% 5 karbondioksit için seyreltilmiş santimetrekare başına 0,5 mikrogram laminin-511 E8 ile altı kuyulu bir plakayı kaplar. Kuluçkanın sonuna yaklaşırken, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri rekombinant tripsin ile 37 santigrat derecede üç dakika boyunca tedavi edin.

Hücreler ayrıldığında, hücreleri sayım için% 10 FBS ile desteklenmiş ortama hasat edin ve hücreleri santrifüjlemeden sonra laminin-511 E8 ve ROCK inhibitörü ile desteklenmiş iki mililitre AK02N ortamı başına 1,25 çarpı 10'da beşinci hücrelere yeniden biriktirin. Daha sonra, altı kuyu plakasının her kuyusundan kaplama çözeltisini epire edin ve her kuyuya iki mililitre hücre tohumlayın. Plakayı hücre kültürü inkübatörüne döndürün.

Dört gün sonra, hücreler% 80 izdiah eder. Farklılaşmayı teşvik etmek için kuyu başına GSK-3 inhibitörü ile desteklenmiş insülin ortamı olmadan her kuyudaki süpernatantı iki mililitre RPMI artı B27 ile değiştirin. İki günlük farklılaşmadan sonra, iyi başına kirpi inhibitörü ile desteklenmiş insülin ortamı olmadan ortamı iki mililitre RPMI artı B27 ile hafifçe değiştirin.

Hücreler %100 konfluense ulaşmalıydı. Farklılaşmanın dördüncü gününde, süpernatantları kuyu başına insülin olmadan iki mililitre RPMI artı B27 ile hafifçe değiştirin. Hücreler yüksek yoğunlukta kalmalı ve bazıları yüzmeye başlamış olabilir.

Farkların yedinci ve dokuzuncu gününde, her kuyudaki süpernatantı iki mililitre RPMI artı B27 ile seçici pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyosit kültürü için püromisitin ile desteklenmiş insülin ile değiştirin. Bu noktada kültürler içinde dayak hücreleri gözlemlenmelidir. Desenli pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyosit kültürünü ayarlamak için, önce özel yapım PDMS damgasının yüzeyindeki tozları temizlemek için ondalık bant kullanın ve damgayı kısaca% 70 etanol içine batırın.

Etanol'ü damga yüzeyinden çıkarmak için bir hava tozlayıcı kullanın ve yüzeyi% 0,5 MPC polimer ve etanolden beş ila 10 mikrolitre ile muamele edin. Polimer tamamen kuruduğunda, damgayı 35 milimetrelik bir görüntüleme kabındaki polimer kapak kapağına yerleştirin ve damgaya bir ağırlık yerleştirin. 10 dakika sonra, desenin kapak kılıfına aktarıldığını onaylamak için hafif bir mikroskop kullanın ve kabı ve örtü kapağı pbs ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, kapak sapını oda sıcaklığında iki ila dört saatlik bir inkübasyon için% 0,1 jelatin ile seyreltilmiş santimetrekare laminin-511 E8 santimetrekare başına 0,5 ila bir mikrogramla kaplayın. Farklılaşmanın 10. gününde, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından 37 santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca kuyu başına bir mililitre rekombinant tripsin ile tedavi edin. Saydıktan sonra, hücreleri 2,5 ila beş çarpı 10'da RPMI artı B27 mililitresi başına beşinci hücrelere puromycin konsantrasyonu ile desteklenmiş insülin ile yeniden depolayın ve 37 santigrat derecede bir gecede inkübasyon için bir mililitre hücreyi tabağa tohumlayın.

Ertesi sabah, süpernatantı taze RPMI artı B27 ile puromycin ile desteklenmiş insülinle değiştirin ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün, görüntüleme için 21 ila 28 gün arasında haftada iki ila üç kez ortayı yenileyin. PCCSM kültürlerinde sarkom kısaltmasının hızlandırılmış görüntülemesi için, floresan konfokal mikroskobun 100 kat objektif lensine yağ uygulayın ve ilgili yazılımda canlı görüntüleme koşullarını seçin. İyi temsili veriler elde etmek için en yüksek kare hızını seçin, deklanşörü açılacak şekilde ayarlayın ve zaman atlamalı görüntüleme sırasında görüntüler arasında en kısa aralıkları elde etmek için alım alanının bir mahsulüne dörte dört binning uygulayın.

Hücrelerin dayak oranı düşükse, hücreleri elektrik alanı stimülasyonu ile uyandırın ve görüntüleme sırasında görüntülenen alanın odakta kalmasına dikkat ederek zaman atlamalı kaydı başlatın. Görüntüleme süresinin sonunda, zaman atlamalı görüntüleri uygun bir klasöre kaydedin. Zaman atlamalı görüntüleri analiz etmek için ImageJ'e bir dizi zaman atlamalı görüntü açın ve sarkom deseni net bir şekilde gözlemleninceye kadar görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.

Diğer Araçlar menüsünde SarcOptiM'i seçin ve programı kalibre etmek için yönergeleri kullanmak için Control Shift P'ye ve araç çubuğundaki bir mikron düğmesine basın. Daha sonra sarkom kısaltmasını ölçmek için kullanılacak sarkanın bölgesi boyunca bir çizgi çizin ve sarkom kısaltma analizine başlamak için Tek Hücreli AVI'yi tıklayın. Sarkom etiketli, desenli pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositlerin zaman atlamalı görüntülemesi, farklı zaman noktalarında sarkom kısaltmasını ölçmek için kullanılabilir.

Tipik olarak desenli pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit kültürlerinde gözlenen sarkom disorganizasyonunun üstesinden gelmek için, desenli olmayan bir alanda kültürlenen hücrelere kıyasla uzun bir hücre şeklini ve daha düzenli bir sarkom desenini destekleyen çizgili bir desende desenli pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositleri kültüre etmek için belirli PDMS pulları kullanılabilir. Desenli kültürler ayrıca daha iyi bir hücre kasılmasını teşvik eder ve desen olmayan kültürlü hücrelere kıyasla pürüzsüz bir sarkom uzunluğu profili sağlar. AAV-transdüklenmiş desen pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, transdüksiyon sonrası üç gün kadar erken bir zamanda desenli pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler boyunca sarkolerik GFP sinyallerini ifade eder ve sarkode kasılma profillerini ölçmek için de kullanılabilir.

Ayrıca, transdüksiyon sırasında blastisidin dirençli genin eklenmesi, desenli pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit seçimini% 90'ın üzerinde bir saflığa kolaylaştırmak için de kullanılabilir Daha kolay ve daha kaliteli bir görüntü analizini kolaylaştırmak için, doğrusal olarak hareket eden sarkomlara sahip bir alanın tanımlanması ve en yüksek kare hızında görüntü elde edilmesi esastır. Bu yöntemi kullanarak, hastalığa özgü, hasta kaynaklı iPS hücrelerinden elde edilen laboratuvar kardiyomiyositinde sarkom disfonksiyonunu incelemek için sarkom proteinlerinde olgunlaşmanın rolünü değerlendirebiliriz.