Name: Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Keşfedin, memeli iris ve retinal pigment epitel hücrelerinin izolasyonu ve transfeksiyonu için esnek bir protokol. SB100X transposon sistemi kullanılarak yüksek hücre canlılığı ve transfeksiyon verimi elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gregg Sealy ve Alain Conti'ye mükemmel teknik yardımları için bir teşekkürü hak ediyor. Bu çalışma Avrupa Komisyonu tarafından Yedinci Çerçeve Programı, İsviçre Ulusal Bilimler Vakfı ve Schmieder-Bohrisch Vakfı bağlamında desteklenmiştir. Z.I., Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] ve B.M.W.'den Fulbright Araştırma Hibesi ve İsviçre Hükümeti Mükemmellik Bursu'ndan fon aldı.

Hayvanların dahil olduğu protokoller sertifikalı personel tarafından ve kantonel Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), İsviçre'nin Cenevre'deki Domaine de l'expérimentation hayvanı tarafından yetkilendirilmesinden sonra ve ARVO Oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri'ye göre gerçekleştirildi (onay no. GE/94/17). Yetişkin sağlıklı Kahverengi Norveç sıçanları, C57BL / 6 fareler ve Yeni Zelanda beyaz tavşanları,% 0.9 NaCl enjekte edilen intraperitonealde seyreltilmiş aşırı dozda Pentobarbital (150 mg / kg) ile ötenaziye tabi tökezlendi ve gözler fedakarlıktan hemen sonra enucle edildi. Porsin ve sığır gözleri, kurban edildiktan sonraki 6 saat içinde yerel bir mezbahadan elde edildi ve buz üzerinde laboratuvara taşındı.
1. Hazırlık öncesi
<ol><li>Komple ortam hazırlayın (DMEM/Ham'ın F12'si %10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U/mL penisilin / 80 μg/mL streptomisin ve 2,5 μg/mL amfoterisin B ile desteklenmiştir). 37 °C'lik bir su banyosunda orta, 1x PBS ve %0,25 tripsin (gerekirse) ısıtın.</li>
	<li>Aseptik bir çalışma yeri hazırlamak için kaputa steril bir örtü koyun. Kaputun içinde gerekli tüm steril aletleri ve malzemeleri tanıtın. NOT: Sadece gözlerin enükleasyonu ve kalan kas dokusunun ve cildin temizlenmesi kaputun dışında yapılan işlemlerdir, adımların geri kalanı kaputun içinde yapılmalıdır.</li>
</ol>2. Sıçan/fare PE hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>Hayvanı ötenaziden sonra gözleri enükle etmek için kavisli makas ve Colibri tokmakları kullanın. Kalan kas dokusunu ve cildi makas ve tostips (steril olmayan) kullanarak gözlerden temizleyin. NOT: Gözlerin enükleasyonu ve temizlenmesi için kullanılan makas ve forsepslerin boyutu türlere bağlıdır (örneğin, fare ve fare için aletler domuz ve sığır için kullanılanlardan daha küçük olacaktır) (bkz. Şekil S1).<ol>
<li>Gözleri steril olmayan PBS ile dolu 50 mL'lik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın. Gözleri iyot bazlı çözeltiye 2 dakika batırarak dezenfekte edin, ardından steril PBS ile dolu bir Petri kabına aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ampulü açma<ol>
<li>Gözleri steril bir Petri kabına aktardıktan sonra, Colibri veya sivri tostu ile optik sinire sıkıca yakın tutun. 18 G iğne ile iris sınırına yakın bir delik açın (pars plana ve ora serrata arasında). Deliğe küçük makas yerleştirin ve irisin etrafını kesin. Ön segmenti (kornea, lens ve iris) çıkarın ve bir Petri kabına koyun. RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>Lensi çıkarın ve ince toparlamalarla IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çekin. İrisi bir Petri kabına yerleştirin, steril PBS ile yıkayın ve daha fazla iris hazırlanana kadar PBS'de bırakın.</li>
		<li>O gün hazırlanacak tüm gözler için 2.2.1 ile 2.3.1 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>İris başına % 0,25 trypsin 50 μL ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın. Tripsin çıkarın, iris başına 150 μL tam orta ekleyin ve IPE'yi düz bir ateş cilalı Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın; dokuyu hareketsiz hale getirmek için ince tokmaklar kullanın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:3 trypan mavisi ile seyreltilmiş hücre süspansiyonunun10 μL'sini kullanın 34,35.</li>
		<li>Hemen transkripse, tohum 200.000 hücre/kuyu 24 kuyulu bir plakada (100.000 hücre/cm2) 1mL tam orta (%10 FBS) (tohumlama için bkz. Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, % 5 CO2'yekültür edin. NOT: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>İnce sıyrıklarla vitreus mizahı ve retinayı arka segmentten çıkarın. Retina pigment epitelinin zarar görmesinden kaçının.</li>
		<li>Kürenin tamamen açılması ve steril PBS ile yıkanması için segmenti 10 numaralı neşterle ikiye bölün.</li>
		<li>Göz başına %0,25 trypsin 50 μL ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve dünya başına 150 μL tam orta ekleyin ve RPE hücrelerini yuvarlak bir neşterle hassas bir şekilde kazıyın; dokuyu hareketsiz hale getirmek için ince tokmaklar kullanın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın; Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:4'i trypan mavisi ile seyreltin.</li>
		<li>Bkz. adım 2.3.4. NOT: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tavşan PE hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>2.1 ile 2.1.1 arasında olan adımlarda açıklandığı gibi temizlik ve dezenfeksiyon yapın.</li>
	<li>Bir gözünü steril gazlı bez kompresine koyun ve optik sinire sıkıca yakın tutun. Gözü neşter #11 ve makasla yaklaşık 2 mm limbus altında açın. Ön segmenti (kornea, lens ve iris) çıkarın ve bir Petri kabına koyun. RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın.</li>
	<li>IPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>2.3.1 adımlarını gerçekleştirin. Neşter #10 ile keserek siliary gövdeyi iristen çıkarın.</li>
		<li>2 irisin hazırlanmasından sonra, 10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 trypsin 1 mL ile kuluçkaya yatırın; bu süre zarfında, RPE hücreleri yalıtılabilir (bkz. adım 3.4). Tripsin çıkarın ve irise 1 mL tam orta ekleyin ve düz bir ateş cilalı Pasteur pipet ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücreleri pipetleme ile dikkatlice yeniden biriktirin ve hücre süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:3'i trippan mavisi ile seyreltin.</li>
		<li>Bkz. adım 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>2.4.1 adımlarını gerçekleştirin.</li>
		<li>Steril bir gazlı bezi 12 kuyu tabağına koyun ve ampulü gazlı bezin üzerine koyun.</li>
		<li>PBS ile yıkayın ve 2.4.3 adımlarını gerçekleştirin. NOT: Kavisli ateş cilalı Pasteur pipet kullanın.</li>
		<li>Hücreleri 120 x g'da10 dakika santrifüj edin.</li>
		<li>Bkz. adım 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Domuz PE hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>2.1. adımda açıklandığı gibi temizlik gerçekleştirin. PBS ile yıkayın ve iyot bazlı çözeltide 2 dakika batırarak gözleri dezenfekte edin, PBS ile durulayın. 3.2. adıma devam edin.</li>
	<li>IPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>Adım 3.3.1'i gerçekleştirin. 2 irisin hazırlanmasından sonra, 1 mL tam orta ekleyin ve düz bir ateş cilalı Pasteur pipet ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücre süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:4 trypan mavisi ile seyreltin.</li>
		<li>Bkz. adım 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>2.4.1 adımlarını gerçekleştirin. Ampulü bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile yıkayın. Ampulü 1 mL komple orta ile doldurun.</li>
		<li>Kavisli ateş cilalı pasteur pipet kullanarak, RPE hücrelerini dikkatlice çıkarın. Koroid-Bruch'un zar kompleksinden aşağı kaymamak için alttan yukarıya doğru kazıyın. 1.000 μL pipet kullanarak ampul içindeki hücre süspansiyonunu toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:8'i trypan mavisi ile seyreltin.</li>
		<li>Bkz. adım 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Sığır PE hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>2.1. adımda açıklandığı gibi temizlik gerçekleştirin. PBS ile yıkayın ve iyot bazlı çözeltide 2 dakika batırarak gözleri dezenfekte edin, PBS ile durulayın. 3.2. adıma devam edin.</li>
	<li>IPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>Adım 3.3.1'i gerçekleştirin. İki irisin hazırlanmasından sonra, 10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 trypsin 2 mL ile kuluçkaya yatırın. Bu süre zarfında, RPE hücreleri yalıtılabilir (bkz. adım 5.3).</li>
		<li>Tripsin çıkarın ve irise 2 mL tam orta ekleyin ve düz bir ateş cilalı Pasteur pipet ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücre süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 120 x g'da10 dakika santrifüj edin. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:4 trypan mavisi ile seyreltin.</li>
		<li>Hemen transfected değilse, tohum 320.000 hücre / kuyu 3 mL tam orta (10% FBS) 6 kuyulu bir plakada (tohumlama için bkz. Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, % 5 CO2'yekültür edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE hücrelerinin yalıtımı<ol>
<li>2.4.1 adımlarını izleyin. Ampulü bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile yıkayın. 2 göz hazırlanmasından sonra ampulü yaklaşık 3/4 trypsin ile doldurun ve bulbinin üstünde petri kabının kapağı ile 37 ° C'de 25 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Tripsin çıkarın ve 1 mL komple orta ekleyin. 4.3.2 adımlarını gerçekleştirin. Hücreleri 120 x g'da10 dakika santrifüj edin.</li>
		<li>Bkz. adım 5.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Yetiştirme - orta değişim
<ol><li>DMEM/Ham'ın F12'sinde% 10 FBS, 80 U / mL penisilin / 80 μg / mL streptomisin ve 2.5 μg / mL amfoterisin B ile desteklenmiş hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemli bir inkübatörde kültürlendirin. 3-4 gün sonra pipet yukarı ve aşağı yapışmayan hücreleri toplamak ve hacmin yarısını başka bir kuyuya koymak için. Tam orta ile 1 mL'ye kadar doldurun. NOT: Bu, yalıtılmış tüm hücrelerin çıkışı takıp en üst düzeye çıkartacak kadar büyük bir yüzeye sahip olmasını sağlar.</li>
	<li>3-4 gün sonra hücre koleksiyonunu tekrarlayın, ancak bu sefer yapışmayan hücreleri iki kuyudan bir kuyuya (örneğin, C1'deki A1 +B1) bir arada toplayarak. Tüm kuyulara orta ekleyin. Hücreleri gözlemleyin ve ortamı haftada 2 kez değiştirin (6 ve 24 kuyu plakaları için sırasıyla 3 ve 1 mL / kuyu kullanın). Hücreler birleştiğinde, %1 FBS ile komple ortama geçin veya deneyler için hücreleri kullanın (örneğin, transfeksiyon). NOT: RPE ve IPE hücreleri sırasıyla 3-4 ve izolasyondan 4-5 hafta sonra bir arayadır. Hücre kültürü saflığı, Johnen ve meslektaşları tarafından açıklandığı gibi hücre morfolojisi (pigmentli hücreler) ve spesifik belirteçler kontrol ederek doğrulandı36.</li>
</ol>7. Birincil PE hücrelerinin elektroporasyon
<ol><li>1,37'denönce açıklandığı gibi elektroporasyon gerçekleştirin.</li>
	<li>Transfected hücre sayısına bağlı olarak, hücreleri antibiyotik veya antimycotics olmadan ortamda tohumlamak için 6, 24veya 48 kuyu plakaları kullanın (bkz. Tablo 2). Takip eden 2 hafta boyunca haftada iki kez penisilin (80 U/mL), streptomisinin (80 μg/mL) ve amfoterisilin B (2,5 μg/mL) içeren orta içeren damlalar ekleyin. Transfeksiyondan 2 hafta sonra ortamı tamamen değiştirin.</li>
	<li>Hücre büyümesini, transfeksiyon verimliliğini ve protein salgısını belirlemek için, hücreleri haftalık olarak mikroskopi ile izleyin ve batı lekesi ile hücre kültürü üstnatantını analiz edin. Kültürün sonlandırılmasından önce, ELISA ile protein salgısını ölçmek, hücreleri saymak, floresanları görüntü tabanlı sitometri ile ölçmek (Venüs-transfected hücreleri durumunda) üreticilerin talimatlarını izleyerek (bkz. Malzeme Tablosu)24 saat hücre kültürü üstnatantı alın ve RT-qPCR tabanlı gen ekspresyon analizi için hücre peletini toplayın. NOT: Hücrelerin analizini ayrıntılı olarak açıklamak değil, izolasyonlarını açıklamak amaç olduğundan, bu yöntemler mevcut makalede yer almamaktadır. Hücre tohumlama yoğunluğu tüm türler için aynıdır (100.000 hücre/cm2)ancak izole hücrelerin sayısı değiştiğinden farklı plakalar kullanılmıştır. Ek olarak, fareler, sıçan ve tavşan için tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için 2-3 göz havuzu gerekebilir.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tür</td>
			<td>Trypsin tedavisi</td>
			<td>N° IPE hücreleri</td>
			<td>N° RPE hücreleri</td>
			<td>Tohumlama plakası (100.000 hücre/cm2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fare/sıçan</td>
			<td>Evet</td>
			<td>~50.000</td>
			<td>~150.000</td>
			<td>24 kuyulu tabaklar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavşan</td>
			<td>Evet</td>
			<td>~350.000</td>
			<td>~2.500.000</td>
			<td>24 kuyulu tabaklar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Domuz</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>~1.000.000</td>
			<td>~3.000.000</td>
			<td>24 kuyulu tabaklar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sığır</td>
			<td>Evet</td>
			<td>~1.700.000</td>
			<td>~5.000.000</td>
			<td>6 kuyulu tabaklar</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Farklı türlerden gözlerden izole edilmiş birincil PE hücrelerinin sayısı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ad</td>
			<td>Alan</td>
			<td>Birim ortamı</td>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Trypsin'in eylemini durdurmak için hacim ortamı</td>
			<td>Tohumlama yoğunluğu</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 kuyulu tabak</td>
			<td>9,6 cm²</td>
			<td>3,0 mL</td>
			<td>0,5 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>3x105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 kuyulu tabak</td>
			<td>2,0 cm²</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>0,2 mL</td>
			<td>0,8 mL</td>
			<td>5x104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>48 kuyu plakası</td>
			<td>1,1 cm²</td>
			<td>0,5 mL</td>
			<td>0,1 mL</td>
			<td>0,4 mL</td>
			<td>0,5-1x104
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Hücre kültürü hacimleri ve tohumlama yoğunlukları.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

PE hücrelerini izole etmek ve kültüre etmek için standart yöntemlere sahip olmak, retina dejeneratif hastalıklar için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için temeldir. Burada sunulan protokoller ile PE hücreleri farklı türlerden başarıyla izole edilebilir ve uzun süre kültürlenebilir (şimdiye kadar en uzun kültür 2 yıl boyunca korundu1,38); tipik PE hücre morfolojisi, pigmentasyonu ve fonksiyonu gözlenmiştir (Şekil 1, <strong class...

Grubumuz, nöroretinal dejenerasyon, yani AMD'yi RPE ve IPE tabanlı viral olmayan gen tedavisi ile tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımların geliştirilmesine odaklanmaktadır. Bu tür tedavilerin klinik öncesi kurulması, insana aktarılabilir in vitro modelleri gerektirir. Bu nedenle, burada sunulan çalışmanın amacı, birincil RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve genetik mühendisliği için protokoller sunmaktır. PE hücrelerinin birden fazla türden izolasyonunu belirlemenin gerekçesi, yaklaşımın güvenliğini ve verimliliğini sağlam bir şekilde onaylamak ve tekrarlanabilirliğini ve aktarılabilirliğini artırmaktır. Mevcut insan RPE hücre hattı ARPE-19 birincil hücrelerden farklıdır (örneğin, daha az pigmentlidirler) ve bu nedenle, klinik öncesi analizler için sadece sınırlıdeğerdedir 1. Ek olarak, insan olmayan memeli hücreleri daha az maliyetle ve daha büyük miktarlarda satın alınabilir; insan donör dokusu çeşitli Göz Bankalarından elde edilebilir, ancak kullanılabilirliği sınırlı ve pahalıdır. Son olarak, yeni İleri Terapi Tıbbi Ürünlerinin (ATMP, yani hücre, doku veya Gen Terapisi Tıbbi Ürünü) hastalarda test edilmeden önce en az iki farklı türde uygulanması gerekir ve bu in vivo çalışmalar allojenik hücre nakillerinin hazırlanmasını talep eder.
Retinal nörodejeneratif hastalıklar, AMD gibi yaygın hastalıkların yanı sıra retina hücre ölümünün sonunda körlüğe yol açtığı retinitis pigmentosa gibi nadir hastalıklardan oluşan endüstriyel ülkelerde körlüğün önde gelen nedenidir. RPE hücreleri, fotoreceptör ve retinal ganglion hücreleri (RGC) hasarı bazı durumlarda yavaşlatılabilir, ancak şu anda iyileştirici tedavi yoktur. ATMP'ler gen kusurlarını düzeltme, terapötik genleri entegre etme veya dejenere hücreleri değiştirme potansiyeli sunar, böylece AMD gibi hastalıklar için rejeneratif ve iyileştirici tedavilerin geliştirilmesini sağlar; RPE65 mutasyonu ile ilişkili retina dejenerasyonu 2,3tedavisi de dahil olmak üzere13gen tedavisi zaten pazarlama onayı aldı. Yaşlı yetişkinler arasında (>60 yıl), dünya çapında yaklaşık 30 milyon kişi neovasküler (nvAMD) veya avasküler (aAMD) AMD4'denetkilenir. Her iki form da oksidatif hasar, fonksiyon bozukluğu ve RPE hücrelerinin kaybı ve ardından fotoreceptör bozulması dahil olmak üzere yaşa bağlı tetikleyiciler tarafından indüklenir, diğerleri arasında (örneğin genetik risk alelleri, sigara, hipertansiyon)5,6. NvAMD'de patogenez, koroidal neovaskülarizasyona (CNV) neden olan anjiyojenik Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) lehine anjiyojenik ve anti-anjiyojenik faktörlerin dengesizliği ile ağırlaşır. Bugüne kadar, sadece nvAMD, CNV'yi bastırmak için VEGF proteininin inhibitörlerinin aylık intravitreal enjeksiyonları ile tedavi edilebilir; aAMD6,7için henüz etkili bir tedavi mevcut değildir.
Çeşitli çalışmalar anti-VEGF tedavisinin yerini almak için hücre bazlı tedavileri değerlendirdi: nAMD8,9,10ile hastalara taze hasat edilen otolog RPE hücrelerinin nakledildiği Binder ve ark. Son zamanlarda, bir faz I klinik çalışması AMD'yi umut verici sonuçlarla tedavi etmek için embriyonik kök hücre türevi bir RPE yaması kullandı; yani, tedavi edilen 10 hastanın 2'sinde 12 aya kadar RPE yamasının etkinliği, stabilitesi ve güvenliği11. Ek olarak, birkaç grup otolog RPE-Bruch'un membran-koroid yamalarının periferik retinadan toplandığını ve makula12 , 13,14'e nakledildiği çalışmalar yayınladı; ve transplantasyon için indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi RPE yamaları oluşturulmuştur15. AAMD için, kompleman yolunu hedefleyen antikorlar klinik çalışmalarda test edilmiştir6,16 ve coğrafi atrofisi (GA) olan hastalarda CD59 (AAVCAGsCD59) faktörü için geni kodlayan adeno ilişkili viral (AAV) vektörün tek bir intravitreal enjeksiyonu kullanılarak yapılan bir faz I çalışmasıtamamlanmıştır 17; faz II çalışması yakın zamanda başlamış ve ileri aAMD'li 132 hastayı işe almayı ve sonucu 2 yıllık müdahale sonrası18yaşında değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Son olarak, FocuS çalışma grubu, bir insan tamamlayıcı faktörünü kodlayan bir rekombinant çoğalmayan AAV vektörün güvenliğini, doz yanıtını ve etkinliğini değerlendiren bir faz I / II çok merkezli klinik çalışma başlattı19.
Öncelikle, rejeneratif bir AMD tedavisinin amacı, hasar görmüş veya kaybolmuş fonksiyonel RPE hücrelerinin naklidir. Bununla birlikte, IPE ve RPE hücreleri birçok fonksiyonel ve genetik benzerliği (örneğin, fagositoz ve retinol metabolizması) paylaşır ve IPE hücreleri daha uygun bir şekilde hasat edildiği için, RPEikame 20olarak önerilmiştir. IPE hücre naklinin hayvan modelleri21 , 22'defotoreceptör dejenerasyonunu geciktirdiğini ve son evre nvAMD'li hastalarda görme fonksiyonunu stabilize ettiği daha önce gösterilmiş olsa da, bu hastalarda anlamlı bir iyileşme gözlenmedi 23. Etkinlik eksikliği, nakledilen hücrelerin sayısının düşüklüğünden ve/veya nöroprotektif retina faktörlerinin dengesizliğinden kaynaklanabilir. Alternatif bir yaklaşım, retina homeostazını geri yüklemek, kalan RPE hücrelerini korumak ve fotoreceptörleri ve RGC'leri dejenerasyondan korumak için nöroprotektif faktörleri aşırı ifade eden transkrefected pigment epitel hücrelerinin nakledililmesi olacaktır. Sonuç olarak, PEDF, GM-CSF veya insülin benzeri büyüme faktörleri (IGF' ler) gibi nöroprotektif ve anti-anjiyojenik proteinleri salgılamak için genetik mühendislikten geçmiş fonksiyonel RPE veya IPE hücrelerinin naklini içeren yeni bir tedavi öneriyoruz. Bu yaklaşımın hücre hattı, sadece bir tür veya insan dokusu kullanmak yerine birkaç türde geliştirilmesinin ve analiz etmenin avantajı: 1) bağımsız laboratuvarlarda ve farklı türlerde gerçekleştirilen çok sayıda çalışmada gösterildiği gibi sonuçların tekrarlanabilirliğini ve aktarılabilirliğini artırmıştır1,24,25; 2) domuz veya sığır hücreleri, ek hayvanların kurban edilmeden fizibilite olarak tek kullanımlıktır; 3) özellikle domuz ve sığır hücrelerinin mevcudiyeti, büyük test serilerinin sağlam sonuçlar üretmesine izin verir; 4) çoğunlukla kullanılan modellerden hücreleri izole etme, kültür ve genetik olarak değiştirme bilgisi, birden fazla tür24 , 25,26'da in vivo analizlere olanak tanır ve böylece ilk tedavi edilen hastalar için gelişmiş bir risk-fayda oranı sunar; 5) sunulan protokolün esnekliği, çeşitli modellerde ve deneysel kurulumlarda ve genetik mühendisliği olan ve olmayan tüm oküler hücre bazlı tedavilerde kullanılmasına izin verir. Buna karşılık, hücre hatları veya insan dokusu olarak alternatif teknikler sadece sınırlı aktarilebilirlik ve/ veya sınırlı bertaraf edilebilirliktir. ARPE-19 gibi hücre hatları ön deneyler için idealdir; bununla birlikte, düşük pigmentasyon ve yüksek çoğalma birincil hücrelerden önemli ölçüde farklıdır1. İnsan donör dokusundan izole edilen RPE ve IPE hücreleri, transfer edilebilir in vitro deneyler için değerli bir kaynak sunar; bununla birlikte, insan dokusunu bir ABD-Amerikan Göz Bankası'ndan elde ediyoruz, yani doku en az iki günlük (enükleasyondan sonra) ve uzun ve pahalı bir taşıma gerektiriyor, ancak yerel donör dokusu üretken bir araştırma için yeterli miktarda mevcut değil. Birincil hücrelerin kullanımının avantajı, diğer gruplardan27,28.
NvAMD ve aAMD'yi tedavi etmek için PEDF ve/veya GM-CSF için kodlayan genlerle birincil RPE ve IPE hücrelerinin transfeksiyonu için SB100X transposon sistemini kullanan hücre bazlı viral olmayan gen tedavisinin geliştirilmesi için, sırasıyla29,30,31,32, ilk olarak ARPE-19 hücrelerinin transfeksiyonunu kurduk1 . Daha sonra, kolayca erişilebilen sığır ve porcine birincil hücrelerinde izolasyon ve transfeksiyon protokolleri oluşturulmuştur. Şimdi, küçük (fare olarak) büyük memelilerden (sığır olarak) beş farklı türden birincil RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu ve transfeksiyonu oluşturulmuştur. İnsan donör gözlerinden elde edilen primer RPE ve IPE hücrelerinde doğrulandı30. ATMP'nin İyi Üretim Uygulamaları (GMP) uyumlu üretimi, insan donör dokusu kullanılarak da doğrulandı33. Son olarak, yaklaşımın hem güvenliği hem de verimliliği, protokolün uyarlanmış olduğu üç farklı türde in vivo olarak değerlendirildi: fare, sıçan ve tavşan. Klinik kurulumda, hastadan bir iris biyopsisi yapılacak ve IPE hücreleri izole edilecek ve temiz odada trans enfekte edilecektir, hücreler alt olarak aynı hastaya geri nakledilmeden önce. Tüm süreç yaklaşık 60 dakika süren tek bir cerrahi seansta gerçekleşecektir. Tedavi yaklaşımının geliştirilmesi ve verimliliğinin değerlendirilmesi, sağlam ve verimli gen iletim yöntemlerini uygulamak, gen iletiminin verimliliğini, terapötik protein üretimini ve nöroprotektif etkileri analiz etmek ve yaklaşımı test etmek için hücre nakli üretmek için mükemmel in vitro ve ex vivomodelleri talep etti 1,24,25,29,30 . Terapinin Cenevre Kantonunun (no. 2019-00250) araştırılması için etik komisyondan klinik faz Ib / IIa denemesi için etik onay aldığını ve şu anda İsviçre düzenleyici makamları tarafından yetkilendirme için talep edilen son klinik öncesi verilerin sunulan protokol kullanılarak toplandığını belirtmek gerekir. Bu bağlamda, klinik öncesi in vivo veriler CNV ve mükemmel güvenlik 24,25,31'deönemli bir azalma olduğunu göstermiştir.
Burada sığır, domuz, tavşan, sıçan ve fareden RPE/IPE hücrelerinin izolasyonu ve kültürü ile etkili bir gen iletim yöntemi olarak elektroporasyon ile birlikte bütünleştirici SB100X transposon sisteminin kullanımı açıklanmıştır. Özellikle, birincil PE hücreleri aşırı ifade PEDF ve GM-CSF'ye transkripsiyon edildi. Bu protokollerin toplanması, IN VITRO ve in vivo çalışmaların ATMP gelişiminin tüm klinik öncesi aşamalarında gerçekleştirilmelerini sağlar. Ayrıca, kurulum diğer ilgi ve hastalık genlerine adapte olma potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>12 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>48 oyuklu plakalar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bonn mikro forseps düz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri forseps (steril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Sitotoksisite Testi</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Drape (steril)</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon tamponu 3P.14</td><td>3P İlaç</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (farklı boyut) (steril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gazlı bez kompres</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (% 0.9)</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>İğne (18G)&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon kiti 10 & L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet (ateş cilası)</td><td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Tiyopental Inresa)</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF,</td> pFAR4-SB100X<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>,<td>pFAR4-Venüs</td><td></td><td></td><td>Pastor ve diğerleri, 2018. Prof. Scherman ve Prof. Marie</td></tr><tr><td>tarafından sağlanan pSB100X (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute; t&eacute; S ve diğerleri, 2009. Prof. Izsvak</td></tr><tr><td>tarafından sağlanan pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen ve ark., 2012</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His plazmid DNA'sı (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Laboratuvarımızda klonlanmış</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His plazmid DNA'sı (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td><td>Pastor ve ark., 2018</td></tr><tr><td>eşarp no. 10</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>eşarp no. 11</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Keskin-keskin uçlu kavisli Ekstra İnce Bonn Makas (steril)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keskin-keskin uçlu düz Ekstra İnce Bonn Makas (steril)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tali Görüntü Tabanlı Sitometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin %0,25&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin %5/EDTA %2</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas kavisli (steril)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

viral olmayan gen tedavisi için memeli primer pigment epitel hücrelerinin İzolasyonu, kültürü ve genetik mühendisliği

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), dünya çapında yaklaşık 30 milyon kişiyi etkileyen 60 > hastalarda körlüğün en sık nedenidir. AMD, retina pigment epitel (RPE) hücre dejenerasyonu ve ardından fotoreceptör bozulması nedeniyle retinanın fonksiyonel olarak bozulmasına yol açan çevresel ve genetik faktörlerden etkilenen çok faktörlü bir hastalıktır. İdeal bir tedavi, RPE hücre ölümünü ve fotoreceptör dejenerasyonunu önlemek için nöroprotektif faktörleri salgılayan sağlıklı RPE hücrelerinin naklini içerecektir. Fonksiyonel ve genetik benzerlikler ve daha az invaziv biyopsi olasılığı nedeniyle, dejenere RPE'nin yerine iris pigment epitel (IPE) hücrelerinin nakli önerildi. Nöroprotektif faktörlerin düşük sayıda subretinal olarak nakledilen hücre ile salgılanması, pigment epitel türevi faktör (PEDF) ve/veya granülosit makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) için kodlayan genlerle Uyuyan Güzel(SB100X)transposon aracılı transfeksiyon ile elde edilebilir. Kemirgenler, domuzlar ve sığırlar da dahil olmak üzere çeşitli türlerden RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve SB100Xaracılı transfeksiyonunu kurduk. Küreler çıkarılır ve iris ve retinaya erişmek için kornea ve lens çıkarılır. Özel yapım bir spatula kullanılarak, IPE hücreleri yalıtılmış iristen çıkarılır. RPE hücrelerini hasat etmek için, türlere bağlı olarak bir trypsin inkübasyonu gerekebilir. Daha sonra, RPE ile özelleştirilmiş spatula kullanılarak, hücreler orta olarak askıya alınır. Tohumlamadan sonra, hücreler haftada iki kez izlenir ve izdihama ulaştıktan sonra elektroporasyon ile transkripsiyon. Gen entegrasyonu, ekspresyonu, protein salgılanması ve fonksiyonu qPCR, WB, ELISA, immünofluoresans ve fonksiyonel tahliller ile doğrulandı. Türlere bağlı olarak, göz başına 30.000-5 milyon (RPE) ve 10.000-1.5 milyon (IPE) hücre izole edilebilir. Genetiği değiştirilmiş hücreler, oksidatif stresi azaltma kapasitesine sahip önemli PEDF/GM-CSF aşırı ekspresyonu gösterir ve oküler gen tedavisi yaklaşımları geliştirmek için insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için esnek bir sistem sunar.

Farklı memeli türlerinden PE izolasyonu Yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak, IPE ve RPE hücreleri beş farklı türden başarıyla izole edildi ve kültürlendi. Her işlemden elde edilen hücre sayısı gözün türüne ve büyüklüğüne bağlıdır (Tablo 1). Şekil 1'degösterildiği gibi, hücreler tipik PE hücre morfolojisi ve pigmentasyonunu gösterir (gösterilen tavşan hücreleri hariç, albino Yeni Zelanda Beyazı (NZW) tavşanlarından türetilmiştir). İzolasyondan son...

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Protokol, beş memeliden pigment epitel hücrelerinin izolasyonunu ve transfeksiyonunu çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisini incelemek için en uygun sistem olarak gösterdiğinden önemlidir. Bu yöntemin temel avantajı, beş tür ve kullanılan viral olmayan SB100X transposon sistemi nedeniyle esnekliği, aktarilebilirliği, yüksek hücre verimi, canlılığı ve transfeksiyon oranıdır. Bu teknikler, mevcut protokolde izole edilen ve transkre enfekte olan, ancak herhangi bir oküler araştırma için kullanılabilir olan retina ve iris pigment epitel hücrelerini hedefleyen gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için geliştirilmiştir.Prosedürü gösteren gregg Sealy, laboratuvardan bir teknisyen. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, gözleri enükle etmek için kavisli makas ve Kolibri tokmakları kullanın, ardından kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin. Gözleri steril olmayan PBS ile dolu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın.İki dakika boyunca iyot bazlı çözeltiye batırarak dezenfekte edin, ardından gözleri steril PBS ile dolu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir gözünü steril bir gazlı bez kompresine koyun ve gözü optik sinire sıkıca yakın tutun. Daha sonra 11 numaralı neşter ile iris sınırına yakın kesin.Makas kullanarak, irisin etrafını kesin ve ön segmenti çıkarın ve bir Petri kabına koyun, retina pigment epitel veya RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın. İris pigment epitelini veya IPE hücrelerini izole etmek için lensi ince epektlerle çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çekin. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın.% 0.25 tripsin 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın, 500 mikrolitre tam orta ekleyin ve IPE'yi düz, ateş cilalı bir Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun.Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve bir mililitre tam orta ile 24 kuyu plakasında kuyu başına 0.2 milyon hücre tohumlayın. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin. RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı ince torpidolarla arka segmentten çıkarın.Ampulleri 24 kuyu plakasına koyun ve göz başına% 0.25 trypsin 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın, dünya başına 500 mikrolitre tam orta ekleyin ve RPE hücrelerini kavisli, ateş cilalı bir Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun.Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin. Kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin ve gözleri iyot bazlı çözeltide dezenfekte edin ve PBS ile durulayın.IPE hücrelerini izole etmek için lensi çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi irisi çekin. İki iris hazırladıktan sonra, bir mililitre tam orta ekleyin ve düz, ateşle cilalanmış bir Pasteur pipetle çizerek hücreleri izole edin, ardından hücreleri sayın ve tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin.RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus ve retinayı arka segmentten çıkarın ve ampulü bir Petri kabına yerleştirin. Ampulü bir mililitre komple orta ile doldurun. Kavisli, ateş cilalı pasteur pipet kullanarak RPE hücrelerini çıkarın.Hücre süspansiyonunu 1.000 mikrolitre pipet kullanarak ampul içinde toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri sayın ve tohumlayın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi kuluçkaya yatırın. Temizledikten sonra, gözü açın ve ön segmenti çıkarmak için irisin etrafını kesin, ardından bir Petri kabına koyun.RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın. IPE hücrelerini izole etmek için, lens ön segmentle birlikte geliyorsa, lensi çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çıkarmak için ince önps kullanın. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın.Silier gövdeyi 10 numaralı neşterle kesin. İrisleri hazırladıktan sonra, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 0.25 trypsin iki mililitre ile kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve iki mililitre tam orta ekleyin, ardından düz, ateş cilalı bir Pasteur pipet ile çizerek hücreleri izole edin.Hücre süspansiyonu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 120 kez 10 dakika boyunca santrifüjleyin G.Süpernatantı atın ve hücreleri iki mililitrelik tam ortamda yeniden biriktirin. Tohum 0.32 milyon hücre kuyu başına altı kuyu plakasında üç mililitre tam orta. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin.RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı arka segmenttenps ile çıkarın. Retina pigment epitelinin zarar görmesinden kaçının. Ampulü PBS ile yıkayın.Her iki gözü de hazırladıktan sonra, ampulü yaklaşık dörtte üçü trypsin ile doldurun ve ampul gözünün üstünde petri kabı kapağı ile 37 santigrat derecede 25 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve bir mililitre tam orta ekleyin. Kavisli, ateş cilalı pasteur pipet kullanarak RPE hücrelerini çıkarın.Hücre süspansiyonunu ampul içinde toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 120 kez G.Seed 0.32 milyon hücrede üç mililitrelik tam ortamda altı kuyu plakasında santrifüjleyin. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültüre edin.Hücreleri 37 santigrat derecede ve nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksitle kültürlendir. Üç ila dört gün sonra, doğal olmayan hücreleri toplamak için pipet yukarı ve aşağı ve hacmin yarısını başka bir kuyuya koyun. Kuyuyu tam orta ile bir mililitreye doldurun.Üç ila dört gün sonra, hücre koleksiyonunu tekrarlayın, bu sefer doğal olmayan hücreleri iki kuyudan bire bir toplayın. Tüm kuyulara orta ekleyin. Hücreleri gözlemleyin ve ortamı haftada iki kez değiştirin.Hücreler birleştiğinde,% 1 FBS ile komple ortama geçin. Yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak, IPE ve RPE hücreleri beş farklı türden başarıyla izole edildi ve kültürlendi. RPE ekspresyon deseni birincil sığır IPE hücrelerinde RPE65 için immünofluoresans ile doğrulandı.Hücre canlılığı, piyasada bulunan bir sitotoksiklik test kiti ve düğüm elektroporlu kontrolü kullanılarak elektroporasyon tamponunun potansiyel toksisitesini dışlamak için çalışıldı. Hücre canlılığı üzerinde herhangi bir etki gözlenmedi. Farklı türlerden prekültüre pigment epitel hücreleri sarı floresan Venüs proteini ile transfekte edildi.Transfected RPE19 hücreleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Önceden şekillendirilmiş domuz RPE'sinde transfeksiyon verimliliğinin nicelemesi burada gösterilmiştir. Yeni izole edilmiş tavşan pigment epitel hücreleri sarı floresan protein Venüs ile transkred edildi ve mikroskopi ile izlendi.Pigment epitel hücreleri pigment epitel türevi faktör ile transkredasyon edildi ve protein salgısı Batı blot tarafından izlendi. Transfected hücreler için sinyal, çalışılan tüm türler ve günler için transkıpte olmayan hücrelere kıyasla daha yüksekti ve bu süre içinde protein salgısında bir azalma gözlenmedi. Hücreleri keskin aletlerle kazımaktan kaçınmak çok önemlidir.Burada, yuvarlak bir neşter kullanılması gereken küçük fare gözleri dışında ateş cilalı Pasteur pipetler kullanılır. Pigment epitel hücreleri gen tedavisi yaklaşımları geliştirmek ve patolojik durumları simüle etmek için kullanılabilir, örneğin oksidatif stres hasarı. Bu modeller terapötik ilaçları test etmek için de kullanılabilir.

isolation-culture-genetic-engineering-mammalian-primary-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir tavşan modelinden oküler pigment epitel hücreleri elde etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Hücreler, retinal dejeneratif hastalıklar için terapötik stratejiler geliştirmede yardımcı olur.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Tavşan Gözünden Oküler Pigment Epitel Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Teknik

Bu videoda, in vivo ve ex vivo çalışmalar için birincil kültürlerini elde etmek üzere domuz gözlerinden iris ve retina pigment epitel hücrelerini izole etmek için bir tekniği açıklıyoruz. Bu pigment hücreleri, oküler bozuklukları tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımları incelemek için genetik olarak değiştirilebilir.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzolasyonu: İzole Domuz Gözünden Pigmente Epitel Hücreleri Elde Etme Tekniği

Bu video, retina pigment epitel veya RPE hücrelerini ve iris pigment epitel veya IPE hücrelerini hasat edilen sığır gözlerinden izole etme prosedürünü gösterir. İzole edilen hücreler, oküler hastalıkların tedavisindeki rollerini incelemek için kültürlenebilir.

Sığır Gözünden RPE ve IPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Sığır Primer Pigment Epitel Hücrelerinin Hasat ve Kültür Prosedürü

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Keşfedin, memeli iris ve retinal pigment epitel hücrelerinin izolasyonu ve transfeksiyonu için esnek bir protokol. SB100X transposon sistemi kullanılarak yüksek hücre canlılığı ve transfeksiyon verimi elde edilir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Daha fazla video keşfet