Name: Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Keşfedin, izotermal nükleik asit amplifikasyonu için düşük maliyetli açık kaynaklı minyatür florometre kurulumunu. Bu yöntem, elektronik bilgisi olmayan araştırmacıların gerçek zamanlı moleküler tanı cihazı inşa etmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Örnek hazırlama konusundaki yardımları için Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul ve Christopher Goh'a özel teşekkürler. Yazarlar caroline Noxon'a makale revizyonu için teşekkür eder. Bu çalışma için AMERIKAN halkından USAID tarafından IAVI ve USAID arasında AID-OAA-A16-00032 ödülü kapsamında CCID 9204 IAVI araştırma hibesi ile fon sağlanmıştır.

1. Hazırlık adımları: 3D baskı ve lehimleme
NOT: Bu protokolde açıklanan optik sistem standart bir kuru blok ısıtıcı için tasarlanmıştır.
<ol><li>İlk yapılandırmayı oluşturmak için, 3D sırasıyla Ek Dosyalar 1, 2 ve 3 olarak sağlanan CAD dosyalarını yazdırın:</li>
	<li>İkinci yapılandırmayı oluşturmak için, 3D sırasıyla Ek Dosyalar 3, 4 ve 5olarak sağlanan CAD dosyalarını yazdırın: NOT: Bu parçalar desteklerle yazdırılacak şekilde tasarlanmıştır. Bu kılavuzda, 110 ° C'ye kadar sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra formunu koruyabilen siyah bir polikarbonat filament kullanılır. Genel olarak, önemli bir deformasyon olmadan istenen izotermal reaksiyonun sıcaklığına ısıtılabilen herhangi bir malzeme kullanılabilir. İç yansımaların ve ortam ışığı parazitinin etkisini en aza indirmek için siyah veya başka bir koyu renkte bir malzeme önerilir.</li>
	<li>İki numunenin paralel izlenmesi için iki ışıktan dijitale sensör değerlendirme modüllerini hazırlayın. Sensör test panolarından birinde, R4 direncini çıkarın ve PCB'deki R4 alanının sağ pedinden PCB'deki R1 alanındaki üst pedine bir jumper teli lehimleyin. Bu, sensörün I2C adresini değiştirecek ve böylece her iki sensörün de aynı anda ölçülecek. NOT: Kullanılan sensör iki PCB'den oluşur: bir USB adaptör kartı ve ışık sensörünü içeren bir sensör test kartı; bu cihaz için sadece sensör test kartı gereklidir.</li>
	<li>İki Işık Yayan Diyot'un (LED) her birine lehim telleri. LED'de "1" etiketli ped için kırmızı bir tel (pozitif) ve LED'de "2" etiketli ped üzerinde siyah bir tel (negatif) bağlayın. LED'in arkasına ince bir termal yapıştırıcı tabakası uygulayın, LED'i bir uç kapağın üstüne yerleştirin ve termal yapıştırıcı kürleyene kadar bekleyin. Uç kapağın diğer tarafına bir ısı emici ekleyin. NOT: LED'leri muhafazaya kapatılmadan önce test ederken, uygun bir mavi ışık engelleyici göz koruması taktığından emin olun.</li>
	<li>İkinci konfigürasyonu oluşturmak için, mavi bir heyecan folyo levhadan iki adet 1/4 inç çapında daire ve makas veya jiletle sarı emisyon folyo levhadan dört adet 1/4 inç çapında daire kesin.</li>
	<li>'LCD_Screen_Holder.stl' kısmının eğimli kısmındaki dört deliğin her birine M2.5 onaltılık şekilli bir kesici uç basın.</li>
</ol>2. Optik montaj
<ol><li>'Optics_Enclosure_Bottom.stl' kısmının üstündeki deliğe 3/16 inç uzunluğunda 4-40 dişli bir kesici uç yerleştirin. Şekil 2A'dagösterildiği gibi 3D baskılı parçanın diğer tüm deliklerine 1/4 inç uzunluğunda 4-40 dişli bir kesici uç yerleştirin.</li>
	<li>Sensör test tahtasını, beş pim cihazın orta eksenine en yakın ve üstüne bakacak şekilde muhafazanın üst boşluğuna yerleştirin. Sensör test kartındaki delikten 3/16 inç uzunluğunda 4-40 vida ile emniyete alın(Şekil 2B).</li>
	<li>20 mm odak uzaklığı lenslerinden birini sensör test panosunun altındaki bölüme dışbükey tarafı cihazın altına bakacak şekilde ve test kartından uzağa yerleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>İlk konfigürasyonu oluşturmak için, uzun geçiş filtresini önceki adıma yerleştirilen 20 mm odak uzaklığı lensinin(Şekil 2D)altındaki bir sonraki bölüme yerleştirin. İkinci konfigürasyonu oluşturmak için lensin altındaki bölüme iki sarı emisyon filtresi folyosu yerleştirin.</li>
	<li>İlk yapılandırmayı oluşturmak için, dikroik aynayı, üretici tarafından belirtilen filtre yönünü gözlemlerken, encasement merkezinin yakınındaki köşegen bölüme yerleştirin (Şekil 2E). İkinci konfigürasyonu oluşturmak için kiriş ayırıcıyı çapraz bölüme yerleştirin. Işın ayırıcı için belirli bir yönlendirmeye gerek yoktur.</li>
	<li>İkinci bir 20 mm odak uzaklığı lensini dikroik aynanın (veya yapılandırmaya bağlı olarak ışın ayırıcının) altındaki bölüme, dışbükey tarafı cihazın üst kısmına doğru işaret edecek şekilde yerleştirin (Şekil 2F).</li>
	<li>İlk yapılandırmayı oluşturmak için, eksitasyon filtresini dikroik aynanın sağındaki bölüme yerleştirin ve okun dikroik aynaya işaret etmesini sağlayın (Şekil 2G). İkinci konfigürasyonu oluşturmak için, kiriş ayırıcının sağındaki bölüme bir mavi heyecan filtresi folyosu yerleştirin.</li>
	<li>15 mm odak uzaklığı lensini, dışbükey tarafı dikroik aynaya bakacak şekilde eksitasyon filtresinin sağına yerleştirin (Şekil 2H).</li>
	<li>Led dikroik aynaya (veya konfigürasyona bağlı olarak ışın ayırıcıya) bakacak şekilde, baskının kalan bölümüne bir LED yerleştirin. LED'den gelen iki kablonun girintili kanallara yerleştirildiğinden emin olun, böylece baskı sıkıca kapanır.</li>
	<li>3D baskılı parçanın diğer tarafı için 2.3-2.9 adımlarını yineleyin (Şekil 2I).</li>
	<li>Kaplamanın üst yarısının ekstrüde edilmiş kısımlarını, kaplamanın alt yarısının girintili oluklarına yerleştirerek baskının üstündeki boş tarafını optik bileşenlerle kapatın. Yazdırılan iki parçayı 3/8 inç uzunluğunda 4-40 vida ile birlikte sabitleyin (Şekil 2J). NOT: Yazdırılan iki parça tamamen kapalı değilse, başıboş heyecan ışığı optik muhafazadan kaçabilir. Uygun bir conta elde edilene kadar uygun mavi ışık engelleyici göz korumasının takıldığından emin olun. Fazla ışık kaçmayana kadar muhafazayı yeniden yapıştırın.</li>
</ol>3. Elektronik ve dokunmatik ekran montajı
<ol><li>İki mini ekmek tahtasını birbirine bağlayın ve ardından mikrodenetleyiciyi ekmek tahtalarından birine yerleştirin. Mikrodenetleyicinin microUSB bağlantı noktasının dışa dönük olduğundan emin olun.</li>
	<li>LED modülasyonunu bağlamak için, LED (+) sürücüsünün CTL pimini mikrodenetleyicinin dijital pimine ve LED sürücüsünün LED (-) pimini mikrodenetleyicinin GND pimine bağlayın.</li>
	<li>Ekmek tahtalarının arkadaki plastik kapakları çıkarın. Birleşik ekmek tahtalarını 'LCD_Screen_Holder.stl' baskılı parçanın arka kısmının içine takmak için ekmek tahtalarının yapışkan arkasını 3D baskılı kısma bastırın.</li>
	<li>Sıvı kristal ekran (LCD) ekran tutucuyu, bir inç uzunluğunda 4-40 vidalı bölüm 2'de monte edilmiş optik muhafazaya monte edilmiş ekmek tahtalarıyla sabitleyin.</li>
	<li>LED güç kaynağını bağlamak için, LED sürücüsünün LED (+) pimini ilk LED'in pozitif teli ile bağlayın. İlk LED'in negatif telini ekmek tahtasındaki ikinci LED'in pozitif teli ile bağlayın. İkinci LED'in negatif telini LED sürücüsünün LED (-) pimine bağlayın. NOT: Birinci veya ikinci LED'in sırası rasgeledir.</li>
	<li>LED sürücü güç kaynağını bağlamak için, 10 V güç kaynağının pozitif ve negatif kablolarını sırasıyla LED sürücüsünün VIN+ ve VIN pimlerine bağlayın. (İki pimli adaptöre bir varil jakı kullanıldı.)</li>
	<li>Sensör test kartı güç kaynağını ve veri aktarımını bağlayın. Sensör test kartında yalnızca dört pim kullanılır: SCK, SDA, VDUT ve GND. 4 pimli dişiden erkek jumper teli alın ve hafiften dijitale sensör test panolarındaki pimleri LCD Tutucu baskısının sağ üst kısmındaki boşluktan mini ekmek tahtasına bağlayın.</li>
	<li>Ekmek tahtasında, aşağıdakiler arasındaki bağlantıların yerinde olduğundan emin olun: mikrodenetleyicinin 3.3 V pini ve her iki test panosunun VDUT pimi; mikrodenetleyicinin GND pimi ve her iki test tahtasının GND pimi; mikrodenetleyicinin analog 4 (A4) pimi ve her iki test tahtasının SDA pimi; ve mikrodenetleyicinin analog 5 (A5) pimi ve her iki test tahtasının SCK pimi. NOT: Işık sensörleri için I2C iletişim kullanıldığından, her iki sensörün SCK ve SDA pimleri mikrodenetleyicinin aynı pimlerine yönlendirilebilir.</li>
	<li>Tek kartlı bilgisayarı dört M2,5 vida ile LCD Ekran tutucusuna sabitleyin. Tek kartlı bilgisayarın HDMI ve güç adaptörü bağlantı noktalarının yukarı doğru olduğundan ve tek kartlı bilgisayarın 3D baskılı parçaya ortaıldığından emin olun.</li>
	<li>Dokunmatik ekran talimatlarına göre dokunmatik ekranı tek kartlı bilgisayara bağlayın ve ardından tek kartlı bilgisayarın HDMI bağlantı noktasını dokunmatik ekranın HDMI bağlantı noktasına bağlayın.</li>
</ol>4. Yazılım yükleme
<ol><li>Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanan özel çizim "MiniFluorimeter_2Diode.ino"yu mikrodenetleyiciye yüklemek için web düzenleyicisini yükleyin ve kullanın. "ClosedCube OPT3002" kitaplığının Kitaplık Yöneticisi kullanılarak yüklendiğinden emin olun.</li>
	<li>değişken led_A_pin adım 3.3'te (Elektronik ve dokunmatik ekran montaj bölümü) kullanılan dijital pim sayısıyla değiştirin.</li>
	<li>Pozlama Süresi değişkeninin değerini değiştirerek floresan ölçümleri alırken LED'in açık olduğu milisaniye sayısını ayarlayın. Değişkenin değerini değiştirerek LED pozlamaları arasındaki milisaniye sayısını ayarlayın led_A_Interval.</li>
	<li>Pozlamalar sırasında LED'lerin parlaklığını ayarlamak için değişken led_Power sıfır ile bir arasında bir sayıya değiştirin. Sıfır maksimum parlaklık miktarını, bir parlaklık ise en düşük parlaklığı verir.</li>
	<li>3,5 inç ekranla birlikte verilen üreticinin yönergelerini izleyerek ekranı dokunmatik ekran üzerinden kontrol etme özelliğini açın. NOT: İstenirse, 3,5 inç ekran dokunmatik ekran özellikleri olmayan bir monitör olarak kullanılabilir ve tek kartlı bilgisayarın kontrolü için tek kartlı bilgisayarın USB bağlantı noktalarına bir klavye ve fare takılabilir.</li>
	<li>"MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" dosyasını Ek Kodlama Dosyası 2'den tek kartlı bilgisayarda istediğiniz bir konuma indirin.</li>
	<li>Python'un çalışan bir sürümünün tek kartlı bilgisayara yüklendiğinden emin olun. Python 3.7 sağlanan Python modülünde kullanıldı, ancak sağlanan komut dosyasında uygun değişikliklerle herhangi bir kararlı Python sürümü kullanılabilir. Python programı için gereken kitaplıkları tek kartlı bilgisayara yükleyin.</li>
	<li>Değişken measurement_time ölçüm yapmak için istenen süreye değiştirin. Program, istenen süre geçtikten sonra alıma son eder ve kapanır. GUI ayrıca kullanıcı arabirimindeki bir düğme aracılığıyla edinmenin sona erdirilmesine izin verir.</li>
	<li>SerialPort değişkenini bağlı mikrodenetleyicinin seri adresiyle değiştirin.</li>
</ol>5. Gerçek zamanlı floresan verilerinin kaydedilme
<ol><li>Ticari ısı bloğunu açın ve istenen sıcaklığa ulaşmasını sağlar.</li>
	<li>Tek kartlı bilgisayarı, çoğu tek kartlı bilgisayar satın alımında sağlanan standart 5 V güç kaynağıyla güç sağlayın. Tek kartlı bilgisayarı mikroUSB -USB kablosuyla mikrodenetleyiciye bağlayın.</li>
	<li>Dokunmatik ekranı kullanarak, sağlanan Python komut dosyasını açın. measurement_time ve serialPort değişkenlerini istenen değerlerle değiştirin. outputFilepath değişkenini programın oluşturduğu veri dosyasının adıyla değiştirin. Dosya adının '.xlsx' ile sona erdiğinden emin olun.</li>
	<li>Isı bloğuna izlenecek reaksiyonları içeren iki PCR tüpü yerleştirin. PCR tüplerinin yerleştirilmesinin, ısı bloğuna yerleştirildikten sonra florometrenin optik kanallarıyla hizalendiğinden emin olun.</li>
	<li>Florometreyi, flormetrenin her optik kanalından ekstrüde olan dört mandal arasında ortalanmış PCR tüpleri ile ısı bloğunun üzerine yerleştirin. Optimum ölçümler için, 3D baskılı florometrenin ısı bloğunun kuyularına güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.</li>
	<li>Florometreyi güvenli bir şekilde takın, LED'ler için güç kaynağı adaptörünü takın.</li>
	<li>Python programını başlatmak için dokunmatik ekranı kullanın. LCD ekranda bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) görünür ve gerçek zamanlı floresanları ölçar.</li>
	<li>GUI'de kullanıcıya gösterilen her iki PCR tüpü için zaman içinde gerçek zamanlı floresan ölçümlerini gözlemleyin.</li>
	<li>Kullanıcı tarafından belirlenen deneme süresi geçtikten sonra edinme sona erer. Kullanıcı tanımlı konuma kaydedilen çıktı veri dosyasındaki ölçümleri görüntüleyin. Ölçümleri erken sonlandırmak için kullanıcı arabiriminde "Edinmeyi Durdur" etiketli düğmeye tıklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications.</a> Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+Amplified+Detection+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA.</a> Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).</li>
<li>Giuffrida, M. C., Spoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Isothermal+Amplification+Methods+in+Microfluidic+Devices%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances.</a> Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).</li>
<li>Gill, P., Ghaemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Isothermal+Amplification+Technologies-A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides%2C+Nucleotides+and+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review.</a> Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).</li>
<li>Richards-Kortum, R., Oden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+Low-Resource+Health+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Devices for Low-Resource Health Care.</a> Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).</li>
<li>Katzmeier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-Cost+Fluorescence+Reader+for+in+vitro+Transcription+and+Nucleic+Acid+Detection+with+Cas13a%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a.</a> PLOS One. 14 (12), e0220091(2019).</li>
<li>Safavieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification-Based+Microchip+and+Microdevice+Technologies+for+Nucleic+Acid+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).</li>
<li>Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYTO9+and+SYBR+Green+I+for+Real-Time+Polymerase+Chain+Reaction+and+Investigation+of+the+Effect+of+Dye+concentration+on+Amplifcation+and+DNA+Melting+Curve+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis.</a> Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Parra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Low-Cost+Point-of-Care+Technologies+for+Cervical+Cancer+Prevention+Based+on+a+Single-Board+Computer%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Translational+Engineering+in+Health+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer.</a> IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Colorimetric+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+Speed+and+Sensitivity+with+Guanidine+Chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride.</a> Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).</li>
<li>Rabe, B. A., Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+Detection+Using+an+Isothermal+Amplification+Reaction+and+a+Rapid%2C+Inexpensive+Protocol+for+Sample+Inactivation+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).</li>
<li>Snodgrass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable+Device+for+Nucleic+Acid+Quantification+Powered+by+Sunlight%2C+a+Flame+or+Electricity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Burada açıklanan, izotermal amplifikasyon reaksiyonlarının nicel floresan tespiti için açık kaynaklı, düşük maliyetli, modüler, taşınabilir bir florometredir. Açık kaynaklı projeler, hazır yedek parçalarla hızlı ve ucuz bakım sağlar ve kullanıcılara sistemi modüler tasarıma göre ihtiyaçlarına göre uyarlama esnekliği sağlar. Bu protokol, mekanik, optik ve elektrik bileşenlerinin montajı ve optik performansın doğrulanarak gerçekleştirildi. Ayrıca, florometrenin RPA exo ve RT-LAMP olmak üzere önemli ölçüde farklı sıcaklık, hacim ve floresan gereksinimlerine sahip iki farklı tipte izotermal amplifikasyon testini izleme esnekliği gösterilmiştir. RPA, floresan üretimi için sıraya özgü FAM etiketli prob kullanan 50 μL reaksiyonlarda 39 °C'de, RT-LAMP ise 25 μL reaksiyon hacminde 65 °C'de gerçekleştirilir ve güçlendirilmiş DNA'nın varlığını bildirmek için bir intercalating boya kullanır. Floresan ölçümleri düz kapaklı PCR tüplerinin üstünden yapıldığından, florometre her iki test hacminden floresan tespit edebilir ve ısı gereksinimleri sadece seçilen ticari ısı bloğu ile sınırlıdır. Ayrıca, RT-LAMP'de üretilen floresan yoğunluğu, floresan sinyal üretiminin boyaya karşı prob tabanlı yöntemleri nedeniyle neredeyse RPA'da üretilenden daha büyük bir büyüklüktedir. Bununla birlikte, seçilen optik sensörün dinamik aralığı hem sinyalleri algılayabilir hem de ölçebilir ve temel çıkarma algoritmaları güvenilir floresan okumaları üretmek için bu farklılıkları hesaba katmaktadır.
Teknolojinin yayılmasını kolaylaştırmak ve potansiyel bakım maliyetini en aza indirmek için, farklı ortamlarda yaygın olarak bulunan ısıtıcılarla uyumlu modüler bir tasarım kullanılmıştır. Mevcut protokolde, ortak bir kuru blok ısıtıcı kullanıldı; aynı optik ve elektriksel tasarım, piyasada bulunan diğer ısıtıcılar için kolayca uyarlanabilir. Başka bir kuru blok ısıtıcı kullanılacaksa, 3D gövde tasarımında minimum değişiklik gerekecektir. Özellikle, optik muhafaza STL dosyalarının alt mandalları, diğer ticari ısı bloklarının kuyularıyla uygun hizalamayı sağlamak için değiştirilmelidir. Örneklerde gösterilen muhafazalar nispeten düşük uçlu bir 3D yazıcıya yazdırılırken (bkz. Malzeme Tablosu),yazıcı çözünürlüğünün ve/veya yazdırma toleranslarının optik bileşenlere ve dişli kesici uçlara uyum sağlamak için yeterli olduğundan emin olunmalıdır. Sağlanan STL dosyalarında, üretici firma tarafından belirtilen boyutlara göre radyal ve eksenel yönde optik bileşenlerin her iki tarafına 0,01-0,02 inç tolerans eklenmiştir. Bu, tüm optik bileşenlerin baskıya güvenli bir şekilde oturmasını ve kasanın fazla ışığın girmesini veya kaçmasını tamamen engellemesini sağlar. Dişli kesici uçlar için uygun bir pres sağlamak için, CAD dosyasındaki üretici tarafından sağlanan çaptan 0,01-0,02 inçlik benzer bir tolerans çıkarılır.
RPA reaksiyonları ilk florometre konfigürasyonu kullanılarak başarıyla izlenirken, RT-LAMP reaksiyonları her iki konfigürasyon kullanılarak da izlenebilir. RPA reaksiyonlarında florojenik prob tarafından üretilen düşük floresan seviyelerini izlemek için ilk konfigürasyonun geliştirilmiş başıboş ışık reddi gerekliydi. Buna karşılık RT-LAMP, sinyal üretimi için bir araya getiren bir boya kullanır ve bu da fotoğrafik filtre folyoları kullanarak ikinci konfigürasyonun alt dinamik aralığıyla uyumlu daha yüksek bir floresan yoğunluğu sağlar. Kullanıcılar, testlerinin element-intercalating boya veya florojenik prob üreten floresan sinyali ile eşleşen florometre konfigürasyonunu seçmelidir.
Bu sistemin bir sınırlaması, ısıtmanın standart bir duvar prizinden güç alan ticari olarak mevcut bir ısı bloğu tarafından sağlanmasıdır. Bu sistem, diğer gruplar tarafından gösterildiği gibi taşınabilir ve şarj edilebilir pil paketlerini dahil ederek elektriğe güvenilir erişimden yoksun alanlarda kullanılmak üzere daha da geliştirilebilir12. Diğer bir sınırlama, aynı anda sadece iki numunenin aynı anda floresan ölçümüne izin veren sistemin nispeten düşük verimidir. Kasanın birden fazla baskısı, verimi artırmak için aynı ısı bloğunun üzerine yerlenebilir; ancak, kullanılan ışık sensörü sadece dört benzersiz I2C adresine sahiptir. Bu, aynı anda dörtle ölçülebilen maksimum örnek sayısını kısıtlar. Verimi daha da artırmak için daha fazla sayıda benzersiz I2C adresine sahip farklı bir ışık sensörüne ihtiyaç vardır.

İszotermal amplifikasyon teknolojileri nükleik asitlerin tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Termosiklisleme gerektiren geleneksel PCR yaklaşımlarına kıyasla, izotermal amplifikasyon nükleik asit amplifikasyonunun tek bir sıcaklıkta gerçekleşmesini sağlar, böylece daha hızlı sonuç alma süresi ve inhibitörlerin daha iyi toleransını sağlar1,2. İzotermal amplifikasyonun bir diğer temel faydası da enstrümantasyon karmaşıklığının azalmasıdır. Çoğu izotermal amplifikasyon reaksiyonu sadece bir ısı bloğu ve algılama yöntemi gerektirir- floresan izleme veya uç nokta tespiti yoluyla gerçek zamanlı algılama, örneğin yanal akış veya jel elektroforezi3,4. Gerçek zamanlı floresan tespiti, çift iplikli DNA varlığında aktive olan boyaların veya belirli çift iplikli DNA dizilerinin varlığında aktive olan söndürülen floresan probların interkalasyon yoluyla üretilen floresan tespiti ile gerçekleştirilir.
Ticari olarak mevcut tezgah üstü izotermal florometreler mevcut olsa da, birçoğu tahlil uygulaması için özelleştirmeden yoksundur. Örneğin, birçok cihaz belirli veya şirket tarafından sağlanan sarf malzemeleri gerektirir, tercih edilen satıcıları önerir veya reklamı yapılan sonuçları elde etmek için özel mülk yazılım kullanır. Bu sistemlerin çoğu 5.000 ABD Dolarının üzerinde bir maliyete sahiptir ve bu da kaynak sınırlı ortamlarda yaygın kullanım için önemli bir engel teşkil eder. Buna ek olarak, düşük kaynak ayarlarındaki kullanıcılar, zorlu çevre koşulları, yedek parçalar için zayıf tedarik zincirleri ve bakım ve onarım için gerekli özel araçlar nedeniyle yüksek kaynak ayarları için tasarlanmış ekipmanı korumak için zorluklarla karşıkarşıyadır 5. Bu ihtiyacı karşılamak için, burada açıklanan, iki isteğe bağlı konfigürasyona sahip kompakt bir 3D baskılı gövdeye(Şekil 1A-C)eklenmiş raf dışı bileşenlerden üretilen modüler ve düşük maliyetli bir florometrenin tasarımı ve montajıdır. Bu cihazın ilk konfigürasyonu, aşırı arka plan ışığını engellemek için piyasada bulunan cam filtreler ve dikroik bir ayna kullanır ve toplam montaj maliyeti 830 USD'dir. Bu filtreler floresan bazlı görüntüleme sistemlerinde yaygın olarak kullanılırken, pahalı yüksek dereceli optik filtre folyolarının değiştirilmesinin daha önce nükleik asit tespitine izin verdiği gösterilmiştir6. Flormetrenin ikinci konfigürasyonu bu ucuz filtreleri içerir ve dikroik aynaları φ1/2" ışın ayırıcılarla değiştirerek sistemin toplam maliyetini 830 $ 'dan 450 USD'ye düşürür.
Montajın temsili görüntüleri Şekil 1 ve Şekil 2'deilk yapılandırma için gösterilir, ancak ikinci yapılandırma için benzer görüntüler Ek Dosya 6'da bulunabilir. Özel optik hizalamaya ihtiyaç duymamak için optik sistem, her optik bileşeni yerleştirmek için belirlenmiş alanlara sahiptir ve nispeten düşük uçlu bir 3D yazıcı ile yapılabilir ve tasarımın yaygın olarak kullanılmasına izin verir. İki konfigürasyon için inşaat ve montajdaki tek fark, 3D baskı için kullanılan dosyalar ve kasaya yerleştirilen optik bileşenlerdir. Her iki sistem için 3D baskılı muhafazanın dış boyutları aynıdır. İki sistemin maliyet karşılaştırması Tablo 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1A'dagösterildiği gibi, küçük bir form faktörünü korumak için florometre, PCR tüpünün üstünden sinyali ölçmek için yerleştirilen kompakt aydınlatma ve algılama ile birleştiğinde Φ1/2" (~12,5 mm) optikten oluşur. Şekil 1'deki sistem, FITC ve SYBR ve SYTO-9 gibi yakın ilişkili boyalar da dahil olmak üzere sırasıyla 490 nm ve 525 nm'ye yakın tepe ekscitasyon ve emisyon dalga boylarına sahip boyaları tespit etmek için tasarlanmıştır, bunlar genellikle gerçek zamanlı nükleik asit amplifikasyon reaksiyonlarında muhabir olarak kullanılır7,8. Heyecan kaynağı, optik filtreler ve dedektör, farklı floresan boyalarla uyumlu bileşenler için kolayca değiştirilebilir. Nükleik asit amplifikasyon reaksiyonları tipik olarak PCR tüplerinde gerçekleştirilir ve florometre, izotermal reaksiyonların gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan PCR tüplerini (Şekil 1D)tutan ticari olarak mevcut herhangi bir ısı bloğunun üzerine yerleştirilmek üzere tasarlanmıştır. Uygun ısı blokları çoğu biyomedikal laboratuvarda mevcuttur ve 500 USD'den daha düşük bir fiyatla satın alınabilir.
Görüntüleme teknolojilerini kontrol etmek için düşük maliyetli, bakım noktası alternatifi sağlamak için tek kartlı bilgisayarların kullanımı daha önce gösterilmiştir9. Bu işi inşa ederek, bu protokolde, gerçek zamanlı veri günlüğünü ve bakım noktasında sonuçların görüntülenmesini kolaylaştırmak ve bir dizüstü bilgisayarın verileri işlemesi veya görselleştirmesi ihtiyacını ortadan kaldırmak için tek kartlı bilgisayar destekli bir grafik kullanıcı arayüzü (Şekil 1D)kullanılır. Floresan ölçümleri I2C protokolü ile ışık sensörlerinden mikrodenetleyiciye aktarıldı ve daha sonra seri iletişim yoluyla tek kartlı bilgisayarın kullanımına sunuldu. Aydınlatma ve veri aktarımı için elektrik bağlantıları, minyatürleştirilmiş ekmek tahtalarında basitleştirilmiş kablolama ve lehimleme yoluyla sağlanarak özel baskılı devre kartlarına (PCB) olan ihtiyaç karşılanmıştır. Florometreyi çalıştırmak için gereken yazılım açık kaynaklı yazılım çerçeveleri aracılığıyla kullanılabilir ve cihazı çalıştırmak için gereken kod ek kodlama dosyalarındasağlanır. Komple florometre 450 ila 830 USD arasında bir araya getirilebilir ve sonuçlar, nükleik asitlerin gerçek zamanlı izotermal amplifikasyonlarını izlemek için doğru ve güvenilir floresan ölçümleri sağladığını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>1/4 inç uzunluğunda 4-40 dişli uç</td><td>McMaster-Carr</td><td>90742A116</td><td>3D baskılı optik muhafazanın iki tarafını birbirine sabitlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>10v güç kaynağı</td><td>GlobTek, Inc.</td><td>WR9HU1800CCP-F(R6B)</td><td>AC/DC Duvara Montaj Adaptörü 10V 18W</td></tr><tr><td>15 mm odak uzaklığı lensi</td><td>Thorlabs</td><td>LA 1074</td><td>Florimetre için toplam iki adet kullanılır. Bu lens, LED aydınlatmayı odaklamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>1 inç uzunluğunda 4-40 vida</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mm odak uzaklığına sahip lens</td><td>Thorlabs</td><td>LA 1540</td><td>Florimetre için toplam dört adet kullanılır.</td></tr><tr><td>2x WarmStart LAMP Master Mix</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>E1700</td><td>Master karışımı, Şekil 3C'de gösterilen LAMP reaksiyonlarını oluşturmak için</td></tr><tr><td>kullanıldı 3.5" Dokunmatik Ekran</td><td>Uctronics</td><td>BO10601</td><td></td></tr><tr><td>3/16 inç uzunluğunda 4-40 vidalı</td><td>McMaster-Carr</td><td>90128A105</td><td></td></tr><tr><td>3/16 inç uzunluğunda 4-40 dişli uç</td><td>McMaster-Carr</td><td>90742A115</td><td>OPT3002 test kartını 3D baskılı muhafazaya sabitlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>3/8 inç uzunluğunda 4-40 vida</td><td>McMaster-Carr</td><td>90128A108</td><td>3D baskılı optik muhafazanın iki tarafını birbirine sabitlemek için kullanılır'dir.</td></tr><tr><td>3D yazıcı filament</td><td>3D Universe</td><td>UMNFC-PC285-SİYAH</td><td>Siyah veya başka bir koyu renk tercih edilen</td></tr><tr><td>3D yazıcı kullanılan</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 2+</td><td></td></tr><tr><td>8 tüplü PCR şeritleri</td><td>BioRad</td><td>#TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş Mini Kuru Blok Isıtıcı</td><td>VWR International</td><td>10153-320</td><td>Aşağıdaki ısı blokları, optik düzeneğin yeniden tasarlanmasına gerek kalmadan kabul edilebilir ikamelerdir: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS ve 949VWMHLEU</td></tr><tr><td>namlu jakı - iki pimli adaptör</td><td>SparkFun Electronics</td><td>1568-1238-ND</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Uyarma Filtresi Folyosu</td><td>LEE</td><td>LE071S</td><td>FITC ile kullanım için seçilmiştir - diğer floresan boyalar farklı filtreler gerektirebilir.</td></tr><tr><td>Mavi LED - 460 nm</td><td>Mouser</td><td>LZ1-30DB00-0100</td><td>FITC ile kullanım için seçilmiştir - diğer floresan boyalar farklı parçalar gerektirebilir</td></tr><tr><td>Dikroik Ayna</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505T</td><td>FITC ile kullanım için seçilmiştir - diğer floresan boyalar farklı parçalar gerektirebilir</td></tr><tr><td>Emisyon Filtresi</td><td>Edmunds Optics</td><td>OG-515</td><td>FITC ile kullanım için seçilmiştir - diğer floresan boyalar farklı parçalar gerektirebilir. Parça üzerindeki ok, aydınlatma kaynağından uzağa işaret eder.</td></tr><tr><td>Uyarma Filtresi</td><td>Omega Filtreleri</td><td>490AESP</td><td>FITC ile kullanım için seçilmiştir - diğer floresan boyalar farklı parçalar gerektirebilir</td></tr><tr><td>LED Sürücü</td><td>LEDdynamics</td><td>3021-D-I-700</td><td></td></tr><tr><td>M2.5 Altıgen Şekilli uç</td><td>McMaster-Carr</td><td>91292A009</td><td>Raspberry Pi'yi 3D baskılı LCD Ekran Tutucuya sabitlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikrodenetleyici</td><td>Arduino</td><td>Nano Mini</td><td></td></tr><tr><td> Breadboard</td><td>Adafruit</td><td>65</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı mineral yağ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69794</td><td></td></tr><tr><td>OPT3002EVM - Işıktan Dijitale Sensör</td><td>Texas Instruments</td><td>OPT3002EVM:</td> <td>Işıktan dijitale sensör kullanıldı. İki PCB'den oluşur: bir SM-USB_DIG kartı ve OPT3002 test kartı; Bu cihaz için sadece OPT3002 test kartı gereklidir.</td></tr><tr><td>Satın alınan oligonükleotidler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPA kiti pozitif kontrol DNA'sı</td><td>TwistDx Limited</td><td>CONTROL01DNAE</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 RNA Kontrolü</td><td>Twist Biosciences</td><td>MN908947.3</td><td></td></tr><tr><td>Tek kartlı bilgisayar</td><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi 3</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp RPA exo kiti</td><td>TwistDx Limited</td><td>TAEXO02KIT</td><td></td></tr><tr><td>Ultra şeffaf düz kapaklar</td><td>BioRad</td><td>#TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Sarı Emisyon Filtre Folyosu</td><td>LEE</td><td>LE767S</td><td>FITC ile kullanım için seçilmiştir - diğer floresan boyalar farklı parçalar gerektirebilir</td></tr></tbody></table>

kaynak sınırlı ortamlarda gerçek zamanlı İzotermal nükleik asit amplifikasyon reaksiyonlarını İzlemek için açık kaynaklı minyatür florometre

Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings

Nükleik asitleri tespit etmek ve ölçmek için geleneksel yöntemler polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanır ve ampliconların entegre floresan tespiti ile pahalı termosikler kullanılmasını gerektirir. İzotermal nükleik asit amplifikasyon teknolojileri termal bisiklet ihtiyacını ortadan kaldırır; bununla birlikte, gerçek zamanlı, nicel sonuçlar için ürünlerin floresan bazlı tespiti hala gereklidir. Entegre floresan algılamalı birkaç taşınabilir izotermal ısıtıcı artık ticari olarak mevcuttur; ancak, bu cihazların maliyeti, kaynak sınırlı ortamlarda yaygın olarak benimsenmesinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan, raf dışı bileşenlerden üretilen modüler, düşük maliyetli bir florometrenin tasarımı ve montajı için bir protokoldür. Kompakt bir 3D baskılı muhafazaya yerleştirilmiş olan florometre, PCR tüpü tutan piyasada bulunan bir ısı bloğunun üzerine yerleştirilecek şekilde tasarlanmıştır. Burada açıklanan florometre floresan izotiyosiyanat (FITC) boyasını tespit etmek için optimize edilmiştir, ancak sistem gerçek zamanlı nükleik asit amplifikasyon reaksiyonlarında muhabir olarak yaygın olarak kullanılan boyalarla kullanılmak üzere değiştirilebilir. Sistemin klinik uygulanabilirliği, iki izotermal amplifikasyon teknolojisi ile gerçek zamanlı nükleik asit tespiti yapılarak gösterilmiştir: ticari bir kitte sağlanan pozitif kontrol DNA'sının tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve sars-CoV-2 RNA'nın klinik olarak anlamlı seviyelerinin tespiti için ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP).

Bir araya getirildikten sonra, florometre performansı fitc boya bir seyreltme serisinden floresan ölçülerek doğrulanabilir. Şekil 3A'da,florometrenin ilk konfigürasyonunun her iki kanalında da 1x PBS olarak hazırlanan 0, 20, 40, 60 ve 80 pg/μL konsantrasyonlarında FITC boya ölçümleri gösterilmiştir. Her örnek, 20 s aralıklarla 1,5 sn LED pozlaması ile üç kez ölçüldü. Florometrenin her iki kanalı da istenen aralıkta doğrusal bir yanıt gösterir.
Florometrenin klinik uygulanabilirliği, sistemi iki izotermal amplifikasyon teknolojisiyle amplifikasyon yapmak için piyasada bulunan bir kuru ısı bloğu ile birlikte kullanarak daha da gösterilmiştir: RPA ve RT-LAMP.
Şekil 3B, standart bir ticari kit içinde sağlanan ve üreticinin talimatlarına göre hazırlanan kit pozitif kontrol DNA'sı için 50 μL gerçek zamanlı RPA pozitif ve negatif kontrol reaksiyonlarının 39 °C amplifikasyonu sırasında ölçülen floresan temel olarak çıkarılan zaman seyrini göstermektedir. Nispeten düşük bir floresan seviyesi üreten RPA reaksiyonları, florometrenin ilk konfigürasyonu kullanılarak ölçüldü ve bu da heyecan verici ışığın daha iyi bastırılmasını sağlayan bir şey.
Şekil 3C, Zhang ve ark. 10 ve Rabe veCepko11 tarafından açıklanan N2, E1 ve As1e astar setlerini kullanarak65°C'de özel bir RT-LAMP testinin zaman seyri ölçümünü göstermektedir. RT-LAMP reaksiyonları daha fazla miktarda floresan üretir ve ikinci, daha düşük maliyetli florometre konfigürasyonu kullanılarak ölçüldü. Oligonükleotidler 1 mM konsantrasyonda 2x TE tamponda satın alındı ve yeniden canlandırıldı. İleri iç astar (FIP) ve geri iç astar (BIP) oligoları yüksek performanslı sıvı kromatografisi saflaştırma ile sıralandı. Her astar seti (N2, E1 ve As1e) aşağıdaki gibi 25x karışımın 1000 μL'si yapmak için birleştirildi: 40 μL FIP, 40 μL BIP, 5 μL F3, 5 μL B3, 10 μL LF, 10 μL LB ve 890 μL 1x TE tampon. Her RT-LAMP reaksiyonunun montajı için, her astar setinin 1 μL'si 50x floresan boyanın 0,5 μL'sine ve 12,5 μL 2x ana karışıma eklendi ve reaksiyon hacmi üreticinin talimatlarına göre çekirdeksiz su ile 20 μL'ye kadar getirildi. SARS-CoV-2 RNA Kontrolü, çekirdeksiz suda seri olarak μL başına 10, 100 veya 1.000 kopya konsantrasyonlarına seyreltildi ve toplam 25 μL reaksiyon hacmi için 5 μL eklendi. Tüm deneylerde kullanılan hedef kontrolü (NTC) çekirdeksiz su değildi. RT-LAMP reaksiyonları 25 μL moleküler biyoloji sınıfı mineral yağ ile kaplandı.
RPA ve RT-LAMP reaksiyonları 0,2 mL düşük profilli 8 tüplü PCR şeridinin iki kuyusunda monte edildi ve ultraclear düz kapaklarla kaplandı. Her RPA ve RT-LAMP reaksiyonı üç taraflı olarak çalıştırıldı. Tüm testlerde, mini florometre DNA amplifikasyonu ile ilişkili floresan seviyelerinin zamansal artışını başarıyla ölçtü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig01.jpg"> Şekil 1: Optik gövde ve ısı bloğunun üstünde monte edilmiş minyatür florometre. (A) Tek bir algılama kanalına yerleştirilen optik bileşenleri gösteren optik gövde şeması. (B) Montajdan sonra minyatür florometrenin ilk konfigürasyonunun şeması. (C) Tek bir algılama kanalına yerleştirilen optik bileşenlerle optik muhafazanın fotoğrafı. (D) Ticari olarak mevcut bir ısı bloğunun üzerine yerleştirilmiş monte edilmiş minyatür florometrenin fotoğrafı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig02.jpg"> Şekil 2: Minyatür florometrenin montaj ve elektrik kontrol şeması. A-J) optik bileşenlerin ilk sistem yapılandırması için 3D baskılı optik gövdeye adım adım yerleştirilmesi. (K) Her iki konfigürasyon için minyatür florometrenin elektrik şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62148/62148fig03.jpg"> Şekil 3: Minyatür florometre ile elde edilen temsili ölçümler. (A) Her iki kanalda da ölçülen floresan ve FITC boya konsantrasyonu istenen dinamik aralıkta doğrusal tepki gösterir. (B) Gerçek zamanlı floresan ve piyasada bulunan bir kitin pozitif ve negatif kontrollerinin izotermal amplifikasyonu için zaman. Amplifikasyon pozitif kontrol için beklendiği gibi gerçekleşir. (C) Gerçek zamanlı floresan ve SARS-CoV-2 RNA'nın 50.500 ve 5000 kopyalarının izotermal amplifikasyonu için zaman ve özel bir RT-LAMP testinden bir NTC örneği. Amplifikasyon, tahlil tespit sınırına yakın beklendiği gibi gerçekleşir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/62148fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Sistem 1</td>
			<td colspan="2">Sistem 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>madde</td>
			<td>miktar</td>
			<td>Toplam Fiyat (USD)</td>
			<td>miktar</td>
			<td>Toplam Fiyat (USD)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Optik Bileşenler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lens -ler</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
			<td>6</td>
			<td>158.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ayna</td>
			<td>2</td>
			<td>244.56</td>
			<td>2</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>Optik Filtreler</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>6</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ara toplam</td>
			<td>602.7</td>
			<td>ara toplam</td>
			<td>223.14</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Aydınlatma ve Algılama</td>
		</tr>
<tr>
<td>Led</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
			<td>2</td>
			<td>72.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>LED Sürücü</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
			<td>1</td>
			<td>11.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fotodiyot</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ara toplam</td>
			<td>134.11</td>
			<td>ara toplam</td>
			<td>134.11</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">Elektronik ve Ekran</td>
		</tr>
<tr>
<td>Arduino Nano</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
			<td>1</td>
			<td>20.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ahududu Pi</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
			<td>35</td>
		</tr>
<tr>
<td>LCD Ekran</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mini Ekmek Tahtası</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>10V Güç Kaynağı</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
			<td>1</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ara toplam</td>
			<td>93.3</td>
			<td>ara toplam</td>
			<td>93.3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Toplam Maliyet (USD)</td>
			<td>830.11</td>
			<td></td>
			<td>450.55</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Minyatür florometrenin iki konfigürasyonunun maliyet karşılaştırması. 
Ek Dosya 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl ve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System1_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: LCD_Screen_Holder.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/LCD_Screen_Holder.STL" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Top.STL" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl ve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_Optics_Enclosure_Bottom.STL" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 6: System2_BuildInstructions.pdf <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/System2_BuildInstructions.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
Ek Kodlama Dosyası 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode.ino" target="_blank">Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62148/MiniFluorimeter_2Diode_GUI.zip" target="_blank">Bu Kodlama Dosyasını indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Gerçek zamanlı, nicel izotermal nükleik asit amplifikasyonu gerçekleştirmek için birçok düşük maliyetli ısıtıcı ile uyumlu açık kaynaklı, modüler bir florometre oluşturmak için ayrıntılı talimatlar sağlanmıştır.

Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre

Traditional methods to detect and quantify nucleic acids rely on polymerase chain reaction (PCR) and require the use of expensive thermocyclers with ...

Bu yöntem, elektronik uzmanlığı olmayan bireylerin moleküler teşhis için kritik öneme sahip izotermal nükleik asit amplifikasyonu ve tespiti için bu florometre gibi aletler inşa etmelerini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, sistemin tamamen ticari olarak mevcut malzemelerden ve açık kaynaklı yazılımlardan düşük maliyetle monte edilebilmesidir. Bu florometre birden fazla izotermal amplifikasyon yöntemi ile kullanılabilir.Bu önemlidir, çünkü izotermal amplifikasyon yöntemleri çok çeşitli bulaşıcı ve kalıtsal hastalıkları tespit etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Optik muhafazayı monte etmek için, optik muhafaza alt STL parçasının üstündeki deliğe 3/16 inç uzunluğunda 4-40 dişli bir kesici uç yerleştirin ve parçanın diğer tüm deliklerine 1/4 inç uzunluğunda 4-40 dişli bir kesici uç yerleştirin. Orta test tahtasını, cihazın orta eksenine en yakın ve en yakın beş pim ile muhafazanın üst boşluğuna yerleştirin ve test tahtasını 3/16 inç uzunluğunda 4-40 vida ile sabitleyin.20 milimetre odak uzaklığı lenslerinden birini, dışbükey tarafı cihazın altına bakacak şekilde ve test tahtasından uzağa bakacak şekilde merkez test tahtasının altındaki bölüme yerleştirin. İlk konfigürasyonu oluşturmak için, uzun geçiş filtresini 20 milimetre odak uzaklığı lensinin altındaki bir sonraki bölüme yerleştirin. İkinci konfigürasyonu oluşturmak için lensin altındaki bölüme iki sarı emisyon filtresi folyosu yerleştirin.İlk yapılandırmayı oluşturmak için, dikroik aynayı, üretici tarafından belirtilen filtre yönünü gözlemlerken, enkasenin merkezine yakın köşegen bölüme yerleştirin. İkinci konfigürasyonu oluşturmak için kiriş ayırıcıyı çapraz bölüme yerleştirin. Konfigürasyona bağlı olarak dikroik aynanın veya ışın ayırıcının altındaki bölüme, dışbükey tarafı cihazın üst kısmına doğru işaret eden ikinci bir 20 milimetre odak uzaklığı lens yerleştirin.İlk yapılandırmayı oluşturmak için, eksitasyon filtresini dikroik aynanın sağındaki bölüme yerleştirin ve okun dikroik aynaya işaret etmesini sağlayın. İkinci konfigürasyonu oluşturmak için, kiriş ayırıcının sağındaki bölüme bir mavi heyecan filtresi folyosu yerleştirin. 15 milimetrelik odak uzaklığı lensini, dışbükey tarafı dikroik aynaya bakacak şekilde eksitasyon filtresinin sağına yerleştirin.Ve yapılandırmaya bağlı olarak LED dikroik aynaya veya kiriş ayırıcıya bakacak şekilde baskının kalan bölümüne bir LED yerleştirin. Led'den çıkan iki kablonun girinti kanallarına yerleştirildiğinden emin olun, böylece baskı sıkıca kapanır. Ve 3D baskı parçasının diğer tarafı için kurulumu tekrarlayın.Daha sonra, parçanın boş tarafını optik bileşenlerle kapatmak için, kaplamanın üst yarısının ekstrüde kısımlarını, kaplamanın alt yarısının girintili oluklarına yerleştirin. Ve parçaları 3/8 inç uzunluğunda 4-40 vida ile birlikte sabitleyin. Elektronik ve dokunmatik ekranı monte etmek için, iki mini ekmek tahtasını bağlayın ve mikrodenetleyiciyi ekmek tahtalarından birine yerleştirin ve mikrodenetleyicinin mikro USB bağlantı noktasının dışa dönük olmasını sağlayın.LED modülasyonunu bağlamak için LED+sürücünün CTL pimini mikrodenetleyicinin dijital pimine bağlayın. Ve LED sürücüsünün LED pimi mikrodenetleyicinin GND pimine. Ekmek tahtalarının arka kısmındaki plastik kapakları çıkarın ve kombine ekmek tahtalarını LCD ekran tutucu STL baskılı parçanın arka kısmına takmak için ekmek tahtalarının yapışkan arkasını 3D baskılı kısma bastırın.LCD ekran tutucuyu, 1 inç uzunluğunda 4-40 vidalı optik muhafazanın içindeki monte edilmiş ekmek tahtalarıyla sabitleyin. LED güç kaynağını bağlamak için, LED sürücüsünün LED pozitif pimini ilk LED'in pozitif teli ile bağlayın. Ve ilk LED'in negatif telini ekmek tahtasındaki ikinci LED'in pozitif teli ile bağlayın.İkinci LED'in negatif telini LED sürücüsünün LED pimine bağlayın. LED güç kaynağını bağlamak için, 10 voltluk güç kaynağının pozitif ve negatif kablolarını sırasıyla LED sürücüsünün VIN+ve VIN pimlerine bağlamak için 2 pimli adaptöre bir namlu jakı kullanın. Sensör test kartı güç kaynağını ve veri aktarımını bağlamak için, hafiften dijitale sensör test kartlarındaki SCK, SDA, VDUT ve GND pimlerini LCD tutucu baskısının sağ üst kısmındaki boşluktan mini ekmek panosuna bağlamak için 4 pinli dişiden erkek jumper teli kullanın.Ekmek panosunda, mikrodenetleyicinin 3.3 volt piminin ve her iki test panosunun VDUT piminin, mikrodenetleyicinin GND piminin ve her iki test panosunun GND piminin, mikrodenetleyicinin analog 4 piminin ve her iki test panosunun SDA piminin ve mikrodenetleyicinin analog 5 piminin ve her iki test tahtasının SCK pimi bağlanır. Tek kartlı bilgisayarın HDMI ve güç adaptörü bağlantı noktaları yukarı bakacak şekilde ve tek kartlı bilgisayar 3D baskılı parçaya ortalanmış olacak şekilde, tek kartlı bilgisayarı LCD ekran tutucusuna sabitlemek için dört M2,5 vida kullanın. Ardından dokunmatik ekran ekran talimatlarına göre dokunmatik ekran görüntüsünü tek kartlı bilgisayara bağlayın.Ve tek kartlı bilgisayarın HDMI bağlantı noktasını dokunmatik ekranın HDMI bağlantı noktasına bağlayın. Gerçek zamanlı floresan verilerini kaydetmek için, ısı bloğu açıldıktan ve uygun sıcaklığa ulaştıktan sonra, tek kartlı bilgisayarda güç ve tek kartlı bilgisayarı mikrodenetleyiciye bağlamak için bir mikro USB - USB kablosu kullanın. Sağlanan Python komut dosyasını dokunmatik ekranda açın ve ölçüm süresini değiştirin.Değişken çıktı dosyası yolunu programın oluşturduğu veri dosyasının adıyla değiştirin. Ve seri bağlantı noktası değişkenlerini istenen değerlerle değiştirin. Isı bloğuna izlenecek reaksiyonları içeren iki PCR tüpü yerleştirin.Ve flormetreyi, her optik kanaldan ekstrüde edilen dört mandal arasında ortalanmış PCR tüpleri ile ısı bloğuna yerleştirin. 3D baskılı florometrenin takılı olduğunu onayladıktan sonra LED'ler için güç kaynağı adaptörünü takın ve Python programını başlatın. Lcd ekranda, her iki PCR tüpündeki gerçek zamanlı floresanları ölçmek için grafiksel bir kullanıcı arayüzü görünecektir.Denemenin sonunda, kullanıcı tanımlı konuma kaydedilen ölçümleri ve çıktı veri dosyalarını görüntüleyin. Bir araya getirildikten sonra, florometre performansı, fitc boyasının bir seyreltme serisinden floresan ölçülerek doğrulanabilir. Bu temsili analizde, florometrenin her iki kanalı da istenen aralıkta doğrusal bir yanıt göstermiştir.Burada rekombinaz polimeraz amplifikasyon pozitifinin taban çizgisiyle çıkarılan floresanları ve flormetrenin ikinci konfigürasyonunda ölçülen standart bir ticari kitin negatif kontrol reaksiyonları gösterilmiştir. Florometrenin ilk konfigürasyonunda SARS-COVID-2 RNA için özel ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon reaksiyonunun gerçek zamanlı floresan ölçümleri, amplifikasyonun klinik olarak ilgili bir RNA kopya numarası aralığında beklendiği gibi gerçekleştiğini göstermektedir. Küresel tedarik zincirlerinin çok stresli olduğu bir dönemde, bu florometre gibi açık kaynaklı ekipman parçaları, salgınla ilişkili bazı sağlık eşitsizliklerini azaltmamıza yardımcı olabilir.

open-source-miniature-fluorimeter-to-monitor-real-time-isothermal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Entegre mikroakışkan termoplastik çip bir moleküler tanı olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Çip nükleik asit ekstraksiyon, ters transkriptaz ve PCR gerçekleştirir. Imalatı ve yonga çalıştırmak için yöntemler tarif edilmiştir.

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Burada, ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) ile insan örneklerinde SARS-CoV-2 virüsünü tespit etme yöntemini standartlaştırmak ve uygulamak için eksiksiz bir protokol sunuyoruz. 60 dakika içinde yapılan bu yöntem, düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir.

SARS-CoV-2 Virüsünü Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon ile Tespit Etme

Çeşitli bakteriyel patojenler, doğru bir şekilde tespit edilmez ve derhal tedavi edilmezse solunum yolu enfeksiyonlarına neden olabilir ve ciddi sağlık sorunlarına yol açabilir. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla bu patojenlerin hızlı ve doğru tespiti, klinik ortamlarda solunum yolu enfeksiyonlarının etkili bir şekilde yönetilmesini ve kontrol edilmesini sağlar.

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Burada, murin kalp kapakçıklarının kültürlenebileceği ve kapağın biyolojisinin incelenmesine olanak tanıyan bir ex vivo akış modeli sunuyoruz.

Minyatür Doku Kültürü Sistemde Fare Kalp Vanalar Kültürleme

Keşfedin, izotermal nükleik asit amplifikasyonu için düşük maliyetli açık kaynaklı minyatür florometre kurulumunu. Bu yöntem, elektronik bilgisi olmayan araştırmacıların gerçek zamanlı moleküler tanı cihazı inşa etmesini sağlar.

Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre (Video) | JoVE Journal

Kaynak Sınırlı Ortamlarda Gerçek Zamanlı İzotermal Nükleik Asit Amplifikasyon Reaksiyonlarını İzlemek için Açık Kaynaklı Minyatür Florometre

Daha fazla video keşfet