İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları
4 Şubat 2021
Burada sunulan miyosin 5a'yı ifade etmek ve arındırmak için bir prosedür ve ardından hem topluluk hem de tek moleküllü in vitro floresan mikroskopi bazlı tahliller kullanılarak karakterizasyonu ve bu yöntemlerin nonmuscle miyosin 2b'nin karakterizasyonu için nasıl değiştirilebileceği tartışılmıştır.
Bu protokol, hücrelerdeki rollerine katkıda bulunan hareketli özellikleri bilgilendirebilen protein düzeyinde kas dışı miyozin dinamiklerini karakterize etmek için kullanılabilir. Bu, çeşitli düzenleyici koşulların miyozin hareketliliği üzerindeki etkilerini incelemek ve hücresel davranışlarını bilgilendirmek için kullanılabilecek hızlı, tekrarlanabilir ve son derece kontrollü bir yöntemdir. Bu teknikler, kas dışı miyozinlerdeki hastalık yapıcı mutasyonların davranışlarını tek molekül ve topluluk düzeyinde nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.
Metodolojisinin genel yaklaşımı, saflaştırılmış kinesinlerin ve dinenlerin mikrotübüllerle karakterize edilmesi gibi diğer çeşitli sitoskeletal sistemlere uygulanabilir. Bu protokolün çok yönlülüğü, hangi floroforların ve kimyasal koşulların en uygun olduğu konusunda soru işaretleri oluşturabilir, ancak yöntem nispeten hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Akış odalarının nasıl kurulabileceğini ve kaplanabileceğini anlamak, bu deneyler için çeşitli koşullara uyum sağlayabileceğiniz güçlü bir temel oluşturur.
Başlamak için, amil asetat içinde yüzde bir nitroselüloz çözeltisi hazırlayın ve bir doku kültürü plakasının altına 125 milimetre çapında dairesel bir filtre kağıdı yerleştirin. Sekiz kare kapak kaymalarını bir rafa yükleyin ve yaklaşık iki ila beş mililitre 200 geçirmez etanol ve ardından iki ila beş mililitre damıtılmış su ile iyice yıkayın. Daha sonra filtrelenmiş bir hava hattı veya nitrojen hattı kullanarak kapak kaymalarını tamamen sürün.
Yavaşça pipet Bir kapak kaymasının bir kenarı boyunca yüzde bir nitroselüloz çözeltisinin 10 mikrolitresi. Tek bir hareketle 200 mikroliter pipet ucunun yan tarafını kullanarak kapak fişinin geri kalanına sürün. Daha sonra bu kapak kaymasını nitroselüloz tarafı yukarı olacak şekilde doku kültürü kabına yerleştirin.
Kalan kapak kaymaları için bunu tekrarlayın ve kurumasını bekleyin. Büyük kalıntıları temizlemek için mikroskop kaydırağı optik lens kağıdıyla silin. Yaklaşık iki santimetre uzunluğunda iki parça çift taraflı bant kesin ve mikroskop kaydırağın uzun kenarının ortasına bir parça yerleştirin.
İkinci bant parçasını kabaca ilk bant parçasının iki milimetre altına yerleştirin, böylece ikisi paralel olarak yaklaşık 10 mikrolitre çözelti tutabilen bir akış odası oluşturur. Nitroselüloz kapağı kaymalarından birini bant üzerine dikkatlice yapıştırın, böylece nitroselülozla kaplanmış yan bantla doğrudan temas eder. Pipet ucu kullanarak, kapak fişinin slayda düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için slayt bandı arayüzüne hafifçe bastırın.
Daha sonra kaydırağın kenarında asılı kalan fazla bandı jiletle kesin. Myosin 5a için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun. Myosin 5a'nın 10 mikrolitresini slayt akış odasından geçirin ve bir dakika bekleyin.
Daha sonra DTT ile hareketlilik tamponunda mililitre BSA başına bir miligram 10 mikrolitre akış. Bunu iki kez tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra bir dakika bekleyin. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendil veya filtre kağıdının köşesini kullanın.
Daha sonra DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın. Pipet siyah aktüer çözeltisi bir mililitre şırınga ve 27-gauge iğne ile bu çözeltiyi odaya sokmadan önce aktiin filamentlerini yamgulamak için. Siyah aktini, bir milimolar DTT ile 50 milimolar MB'de bir milimolar ATP varlığında odaya ekleyin.
Daha sonra, serbest aktüer filamentler odasını tükenmek için DTT ve bir milimolar ATP ile 50 mikrolitre hareketlilik tamponunda akış. Herhangi bir ATP'nin haznesini tükenmek için DTT ile üç kez 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın. DTT ile hareketlilik tamponu içeren 20 nanomolar RH aktisin çözeltisinin 10 mikrolitresinde akış ve aksin filamentlerinin kapak kaymasının yüzeyine bağlı Myosin 5a'ya sert bir şekilde bağlanmasına izin vermek için bir dakika bekleyin.
İlişkisiz RH aktisin filamentlerini çıkarmak için DTT ile iki kez 10 mikrolitre 50 milimolar hareketlilik tamponu ile yıkayın. 30 mikrolitre son tamponda akış. RH aksini görselleştirmek için 561 nanometrelik bir eksitasyon dalga boyu kullanarak floresan mikroskopta görüntüler kaydedin.
Myosin 5a ters hareketlilik tahlilleri için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun. DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile oda yıkayın. DTT ile hareketlilik tamponunda mililitre BSA başına bir miligram 10 mikrolitre akış.
Üçüncü yıkamadan bir dakika sonra bekleyerek bunu iki kez tekrarlayın. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan fitillamak için kağıt mendil veya filtre kağıdı kullanın. Daha sonra, odayı DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile üç kez yıkayın.
DTT ile hareketlilik tamponunda NeutrAvidin çözeltisinin 10 mikrolitresinde akış ve bir dakika bekleyin. Daha sonra bu çözeltinin 10 mikrolitresi ile üç kez yıkayın. Büyük sıkılmış pipet ucu kullanarak DTT ile hareketlilik tamponu içeren 10 mikrolitre BRH aktinin akışı.
Ve bir dakika bekleyin. Daha sonra, DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile üç kez yıkayın. 10 nanomolar Myosin 5a ile 30 mikrolitre son tamponda akış.
Ve hemen toplam iç yansıma floresan mikroskobuna yükleyin. TIRF görüntüleme için optimum odak bulunduktan sonra kayda başlayın. Kas dışı Myosin 2b, esansiyel ışık zincirleri ve düzenleyici ışık zincirlerinin yanı sıra Myosin 5a ve calmodulin'in saflaştırılması SDS-PAGE yapılarak değerlendirildi.
Süzülen actin filament tahlili, etiketli aktiin filamentlerinin pürüzsüz hareketlerini içeren ideal ve izlenebilir bir filmin özelliklerini gösterir. Siyah aksin yıkama, ölü miyozin kafalarının ölçüm alanından çıkarılmasını sağlayarak aksin filamentlerinin genel yumuşak hareketine daha fazla katkıda bulundu. Kas dışı Myosin 2b ve Myosin 5a için hızlı yol programından filament izleme çıktı görüntüleri elde edildi.
Temsili bir histogram, Actomyosin 2b kayma hızının saniyede 77 nanometre olduğunu göstermektedir. Ve Actomyosin 5a'nınki saniyede 515 nanometredir. Metilselülozun yokluğunda, aktin filamentleri miyozin kaplı yüzeyle yakından ilişkili kalmaz ve kas olmayan Myosin 2b kaplı kapak kaymalarının yüzeyine yakın çırpınmasına neden olur.
Ters hareketlilik tahlili kullanılarak yüzeye bağlı floresan aktisan filamentler üzerinde miyosin hareketi gözlendi. Akinin düzgün bir şekilde translokasyonuna izin verecek siyah aksin yıkama için akış hücresine sokmadan önce etiketsiz aksini yamulması önemlidir. Ek deneyler miyozin hareketliliğinin miyozin mutasyonlarından, yük indükleyici proteinlerden, iyonik mukavemetten ve düzenleyici proteinlerden nasıl etkilendiğini araştırabilir.
Gelecekteki çalışmalar için çeşitli hücresel koşullar yeniden inşa edilebilir. Bu yöntemler, çeşitli miyozin izoformlarının tek molekül ve topluluk düzeyindeki hareketli ve mekanik özelliklerinde nasıl farklılık gösterdiğine dair biyokimyasal ve biyofiziksel araştırmalara izin verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, myosin 5a'nın ekspresyonu ve saflaştırılmasının ardından in vitro floresan mikroskopi analizleri kullanılarak karakterizasyonunu detaylandırmaktadır. Ayrıca, kas dışı myosin 2b'nin incelenmesine yönelik modifikasyonları da ele almaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
- Nörobilim
Arka Plan
- Miyozinler, hücresel hareketlilikte kritik roller oynarlar.
- Miyozin dinamiklerini anlamak, bunların hücrelerdeki işlevlerini aydınlatmak için gereklidir.
- Kas dışı miyozinler çeşitli hücresel süreçlerde yer alırlar.
- Karakterizasyon teknikleri, mutasyonların miyozin davranışı üzerindeki etkisini ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kas dışı miyozin dinamiklerini protein düzeyinde karakterize etmek.
- Hücresel rollere katkıda bulunan hareketli özellikler hakkında bilgi sağlamak.
- Düzenleyici koşulların miyozin hareketliliği üzerindeki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Topluluk ve tek molekül floresan mikroskopisi.
- Saflaştırılmış miyozinlerin karakterizasyonu.
- Floroforların ve kimyasal koşulların optimizasyonu.
- Deneyler için akış odalarının kurulumu ve kaplanması.
Temel Sonuçlar
- Protokol hızlı, tekrarlanabilir ve yüksek düzeyde kontrollüdür.
- Kas dışı miyozinlerdeki hastalık yapıcı mutasyonların incelenmesine olanak tanır.
- Diğer hücre iskeleti sistemlerine uygulanabilir, çok yönlü bir metodolojidir.
- Çeşitli deneysel koşullar için hızlı optimizasyon sağlar.
Sonuçlar
- Miyozin dinamiklerinin anlaşılması, hücresel davranışlar konusundaki bilgileri artırır.
- Bu yöntem, gelecekteki çalışmalar için güçlü bir temel sağlar.
- Bu çalışma, sağlıklı durumda ve hastalıklarda miyozin fonksiyonuna ilişkin önemli sorular ortaya çıkarmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Önem
Bu protokol, miyozin hareketliliğinin tek molekül ve toplu düzeylerde kantitatif olarak karakterize edilmesini sağlayarak motor protein fonksiyonuna dair mekanistik bilgiler sunar. Biyokimyasal özellikler ile hücresel fenotipler arasında bağlantı kurarak hedef doğrulamayı destekler ve miyozin odaklı terapötik stratejilerin risklerinin azaltılmasına yardımcı olur. Bu yaklaşım, hastalıkla ilişkili modellere uyarlanabilir ve kontrollü koşullar altında miyozin izoform dinamiklerinin preklinik değerlendirmesini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hücresel taşıma ve adezyondaki fonksiyonel rolleri açıklığa kavuşturmak için miyozin mekanokimyasının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşim değerlendirmesi için translokasyon hızı ve yürüyüş uzunluğuna dair tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- Öngörücü Değer: Düzenleyici koşulların veya mutasyonların motor protein davranışını nasıl değiştirdiğine dair hipotez testlerini destekleyerek hedef güven puanlamasına yardımcı olur.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Deney Hazırlığı: Bileşik tarama için yüksek içerikli görüntüleme ile uyumlu, standartlaştırılmış, floresan tabanlı motilite deneyleri oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Doz-yanıt analizi için aktin translokasyon hızı ve tek molekül koşu uzunluğu gibi ölçülebilir parametreler sunar.
- Platform Yeniden Kullanımı: Diğer hücre iskeleti sistemlerine (örneğin, mikrotübüller ile kinesin/dynein) uyarlanabilir, böylece farklı hedeflere yönelik deney taşınabilirliği sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık Modelleme: Protein düzeyinde, kas dışı miyozinlerdeki hastalığa neden olan mutasyonları incelemek için hücresel koşulların yeniden oluşturulmasına olanak tanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Moleküler hareketlilik kusurlarını hücresel fenotiplerle ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Preklinik Süreklilik: Korunan analiz formatı aracılığıyla, keşif aşamasındaki hedef doğrulaması ile preklinik fonksiyonel değerlendirme arasında köprü kurar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, motor proteinlerdeki yapı-fonksiyon ilişkilerini aydınlatan biyofiziksel karakterizasyon sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Hareketlilik dinamiklerinin doğrudan gözlemi yoluyla miyozin izoformlarının yolak aydınlatılmasını ve fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Tarama: Kontrollü tampon koşulları altında bileşiklerin motor protein aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için analiz standardizasyonuna ve tekrarlanabilirliğe olanak tanır.
- Analitik: İzoformlar, mutantlar veya işlem koşulları arasında karşılaştırma yapılmasına izin veren hız ve prosesivite üzerine kantitatif ölçümler sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Tek molekül davranışını, sitokinez ve gerilim sürdürülmesi gibi hücresel fonksiyonlarla ilgili toplu düzeydeki çıktılara bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı terapötik alanlardaki çeşitli motor proteinlerin incelenmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturarak analiz yeniden geliştirme çabasını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Miyozin mekanokimyasal eşleşmedeki belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış akış odası hazırlama ve görüntüleme protokolleri aracılığıyla laboratuvarlar arası analiz tekrarlanabilirliğini ve standartlaşmayı sağlar.
- Stratejik Değer: Motiliteyi değiştiren mutasyonların veya düzenleyici etkilerin erken tespitini mümkün kılarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış fonksiyonel domainler ve motilite profillerine dayanarak miyozin hedeflerinin risk ayarlı önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Protein saflaştırma, floresan mikroskopi ve motilite takibi için görüntü analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- TIRF veya geniş alanlı floresan mikroskopi sistemlerine erişime ve akış hücresi üretim kabiliyetlerine bağlıdır.
- Deneysel tekrarlar boyunca tampon koşullarının, ATP konsantrasyonlarının ve florofor seçiminin standardizasyonunu gerektirir.
- Yüzey yoğunluğu, iyonik güç ve düzenleyici proteinlerin dahil edilmesi hususlarında farklı miyozin izoformları için optimizasyon değerlendirmeleri içerir.
- Saflaştırılmış, fonksiyonel protein preparatlarına duyulan ihtiyaçla sınırlıdır; aktivite, etiketlerden, degradasyondan veya hatalı katlanmadan etkilenebilir.
