İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları
February 4th, 2021
Burada sunulan miyosin 5a'yı ifade etmek ve arındırmak için bir prosedür ve ardından hem topluluk hem de tek moleküllü in vitro floresan mikroskopi bazlı tahliller kullanılarak karakterizasyonu ve bu yöntemlerin nonmuscle miyosin 2b'nin karakterizasyonu için nasıl değiştirilebileceği tartışılmıştır.
Bu protokol, hücrelerdeki rollerine katkıda bulunan hareketli özellikleri bilgilendirebilen protein düzeyinde kas dışı miyozin dinamiklerini karakterize etmek için kullanılabilir. Bu, çeşitli düzenleyici koşulların miyozin hareketliliği üzerindeki etkilerini incelemek ve hücresel davranışlarını bilgilendirmek için kullanılabilecek hızlı, tekrarlanabilir ve son derece kontrollü bir yöntemdir. Bu teknikler, kas dışı miyozinlerdeki hastalık yapıcı mutasyonların davranışlarını tek molekül ve topluluk düzeyinde nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.
Metodolojisinin genel yaklaşımı, saflaştırılmış kinesinlerin ve dinenlerin mikrotübüllerle karakterize edilmesi gibi diğer çeşitli sitoskeletal sistemlere uygulanabilir. Bu protokolün çok yönlülüğü, hangi floroforların ve kimyasal koşulların en uygun olduğu konusunda soru işaretleri oluşturabilir, ancak yöntem nispeten hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Akış odalarının nasıl kurulabileceğini ve kaplanabileceğini anlamak, bu deneyler için çeşitli koşullara uyum sağlayabileceğiniz güçlü bir temel oluşturur.
Başlamak için, amil asetat içinde yüzde bir nitroselüloz çözeltisi hazırlayın ve bir doku kültürü plakasının altına 125 milimetre çapında dairesel bir filtre kağıdı yerleştirin. Sekiz kare kapak kaymalarını bir rafa yükleyin ve yaklaşık iki ila beş mililitre 200 geçirmez etanol ve ardından iki ila beş mililitre damıtılmış su ile iyice yıkayın. Daha sonra filtrelenmiş bir hava hattı veya nitrojen hattı kullanarak kapak kaymalarını tamamen sürün.
Yavaşça pipet Bir kapak kaymasının bir kenarı boyunca yüzde bir nitroselüloz çözeltisinin 10 mikrolitresi. Tek bir hareketle 200 mikroliter pipet ucunun yan tarafını kullanarak kapak fişinin geri kalanına sürün. Daha sonra bu kapak kaymasını nitroselüloz tarafı yukarı olacak şekilde doku kültürü kabına yerleştirin.
Kalan kapak kaymaları için bunu tekrarlayın ve kurumasını bekleyin. Büyük kalıntıları temizlemek için mikroskop kaydırağı optik lens kağıdıyla silin. Yaklaşık iki santimetre uzunluğunda iki parça çift taraflı bant kesin ve mikroskop kaydırağın uzun kenarının ortasına bir parça yerleştirin.
İkinci bant parçasını kabaca ilk bant parçasının iki milimetre altına yerleştirin, böylece ikisi paralel olarak yaklaşık 10 mikrolitre çözelti tutabilen bir akış odası oluşturur. Nitroselüloz kapağı kaymalarından birini bant üzerine dikkatlice yapıştırın, böylece nitroselülozla kaplanmış yan bantla doğrudan temas eder. Pipet ucu kullanarak, kapak fişinin slayda düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için slayt bandı arayüzüne hafifçe bastırın.
Daha sonra kaydırağın kenarında asılı kalan fazla bandı jiletle kesin. Myosin 5a için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun. Myosin 5a'nın 10 mikrolitresini slayt akış odasından geçirin ve bir dakika bekleyin.
Daha sonra DTT ile hareketlilik tamponunda mililitre BSA başına bir miligram 10 mikrolitre akış. Bunu iki kez tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra bir dakika bekleyin. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendil veya filtre kağıdının köşesini kullanın.
Daha sonra DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın. Pipet siyah aktüer çözeltisi bir mililitre şırınga ve 27-gauge iğne ile bu çözeltiyi odaya sokmadan önce aktiin filamentlerini yamgulamak için. Siyah aktini, bir milimolar DTT ile 50 milimolar MB'de bir milimolar ATP varlığında odaya ekleyin.
Daha sonra, serbest aktüer filamentler odasını tükenmek için DTT ve bir milimolar ATP ile 50 mikrolitre hareketlilik tamponunda akış. Herhangi bir ATP'nin haznesini tükenmek için DTT ile üç kez 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın. DTT ile hareketlilik tamponu içeren 20 nanomolar RH aktisin çözeltisinin 10 mikrolitresinde akış ve aksin filamentlerinin kapak kaymasının yüzeyine bağlı Myosin 5a'ya sert bir şekilde bağlanmasına izin vermek için bir dakika bekleyin.
İlişkisiz RH aktisin filamentlerini çıkarmak için DTT ile iki kez 10 mikrolitre 50 milimolar hareketlilik tamponu ile yıkayın. 30 mikrolitre son tamponda akış. RH aksini görselleştirmek için 561 nanometrelik bir eksitasyon dalga boyu kullanarak floresan mikroskopta görüntüler kaydedin.
Myosin 5a ters hareketlilik tahlilleri için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun. DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile oda yıkayın. DTT ile hareketlilik tamponunda mililitre BSA başına bir miligram 10 mikrolitre akış.
Üçüncü yıkamadan bir dakika sonra bekleyerek bunu iki kez tekrarlayın. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan fitillamak için kağıt mendil veya filtre kağıdı kullanın. Daha sonra, odayı DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile üç kez yıkayın.
DTT ile hareketlilik tamponunda NeutrAvidin çözeltisinin 10 mikrolitresinde akış ve bir dakika bekleyin. Daha sonra bu çözeltinin 10 mikrolitresi ile üç kez yıkayın. Büyük sıkılmış pipet ucu kullanarak DTT ile hareketlilik tamponu içeren 10 mikrolitre BRH aktinin akışı.
Ve bir dakika bekleyin. Daha sonra, DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile üç kez yıkayın. 10 nanomolar Myosin 5a ile 30 mikrolitre son tamponda akış.
Ve hemen toplam iç yansıma floresan mikroskobuna yükleyin. TIRF görüntüleme için optimum odak bulunduktan sonra kayda başlayın. Kas dışı Myosin 2b, esansiyel ışık zincirleri ve düzenleyici ışık zincirlerinin yanı sıra Myosin 5a ve calmodulin'in saflaştırılması SDS-PAGE yapılarak değerlendirildi.
Süzülen actin filament tahlili, etiketli aktiin filamentlerinin pürüzsüz hareketlerini içeren ideal ve izlenebilir bir filmin özelliklerini gösterir. Siyah aksin yıkama, ölü miyozin kafalarının ölçüm alanından çıkarılmasını sağlayarak aksin filamentlerinin genel yumuşak hareketine daha fazla katkıda bulundu. Kas dışı Myosin 2b ve Myosin 5a için hızlı yol programından filament izleme çıktı görüntüleri elde edildi.
Temsili bir histogram, Actomyosin 2b kayma hızının saniyede 77 nanometre olduğunu göstermektedir. Ve Actomyosin 5a'nınki saniyede 515 nanometredir. Metilselülozun yokluğunda, aktin filamentleri miyozin kaplı yüzeyle yakından ilişkili kalmaz ve kas olmayan Myosin 2b kaplı kapak kaymalarının yüzeyine yakın çırpınmasına neden olur.
Ters hareketlilik tahlili kullanılarak yüzeye bağlı floresan aktisan filamentler üzerinde miyosin hareketi gözlendi. Akinin düzgün bir şekilde translokasyonuna izin verecek siyah aksin yıkama için akış hücresine sokmadan önce etiketsiz aksini yamulması önemlidir. Ek deneyler miyozin hareketliliğinin miyozin mutasyonlarından, yük indükleyici proteinlerden, iyonik mukavemetten ve düzenleyici proteinlerden nasıl etkilendiğini araştırabilir.
Gelecekteki çalışmalar için çeşitli hücresel koşullar yeniden inşa edilebilir. Bu yöntemler, çeşitli miyozin izoformlarının tek molekül ve topluluk düzeyindeki hareketli ve mekanik özelliklerinde nasıl farklılık gösterdiğine dair biyokimyasal ve biyofiziksel araştırmalara izin verir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, miyozin 5a'nın ekspresyonunu ve saflaştırılmasını, ardından in vitro floresan mikroskopi analizleri kullanılarak karakterizasyonunu detaylandırmaktadır. Ayrıca, non-müsküler miyozin 2b'nin incelenmesi için modifikasyonları da tartışmaktadır.
Ana Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
- Sinirbilim
Arka Plan
- Miyosinler hücresel hareketlilikte kritik roller oynamaktadır.
- Miyosin dinamiklerinin anlaşılması, hücrelerdeki işlevlerini açıklamak için gereklidir.
- Non-müsküler miyosinler çeşitli hücresel süreçlerde yer almaktadır.
- Karakterizasyon teknikleri, mutasyonların miyosin davranışındaki etkisini ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Non-müsküler miyosin dinamiklerini protein seviyesinde karakterize etmek.
- Hücresel rollere katkıda bulunan hareketli özellikler hakkında bilgi sağlamak.
- Regülasyon koşullarının miyosin hareketliliği üzerindeki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Toplu ve tek molekül floresan mikroskopi.
- Saflaştırılmış miyosinlerin karakterizasyonu.
- Floroforlerin ve kimyasal koşulların optimizasyonu.
- Deneyler için akış odalarının kurulumu ve kaplanması.
Ana Sonuçlar
- Protokol hızlı, tekrarlanabilir ve yüksek oranda kontrollüdür.
- Non-müsküler miyosinlerde hastalığa neden olan mutasyonların incelenmesini sağlar.
- Diğer sitoskelet sistemlerine uygulanabilen esnek metodoloji.
- Çeşitli deneysel koşullar için hızlı optimizasyon.
Sonuçlar
- Miyosin dinamiklerinin anlaşılması, hücresel davranışların bilgisini artırır.
- Bu yöntem, gelecekteki çalışmalar için sağlam bir temel sağlar.
- Bu, sağlık ve hastalıktaki miyosin işlevi hakkında önemli sorular ortaya çıkarmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
