Name: Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Öğrenin, glioblastoma kök benzeri hücrelerin desenli nöronlar üzerindeki göç davranışını ortak kültür sistemiyle incelemeyi. Bu yöntem, tümör invazyonunu klinik tanı için nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO tarafından desteklendi. Alveole, Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43) tarafından desteklenmektedir. Joris Guyon, Toulouse Üniversite Hastanesi'nden (CHU Toulouse) burs alan bir kişidir.

Tüm hastalardan (yerel etik kurul yönetmeliklerine göre Norveç'in Bergen kentindeki Haukeland Hastanesi'nden) bilgilendirilmiş yazılı onay alınmıştır. Bu protokol Bordeaux Üniversitesi insan ve hayvan araştırma etik kurullarının yönergelerine uyar. Hamile sıçanlar Bordeaux Üniversitesi'nin hayvan tesisinde barındırıldı ve tedavi edildi. E18 zamanlı hamile bir sıçanın ötanazisi CO2kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm hayvan işlemleri kurumsal yönergelere göre yapılmış ve yerel etik kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm ticari ürünlere Malzeme Tablosundaatıfta bulunulmaktadır.
1. Desenli slaytların hazırlanması
<ol><li>Mikropatterning için substrat hazırlığı<ol>
<li>18 mm dairesel cam kapakları 5 dakika boyunca hava/plazma aktivasyonu ile tedavi edin. Kapakları 100 μL (3-aminopropil) triethoxysilane ile kapalı bir odaya 1 saat boyunca bir kurutucuya yerleştirin.</li>
		<li>10 mM karbonat tamponunda 100 mg/mL poli (etilen glikol)-süksinimimidyl değer (moleküler ağırlık 5.000 (Peg-SVA)) ile 1 saat boyunca pH > 8 ile kuluçkaya yatırın. Ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın ve kimyasal bir kaputun altında kurulayın. NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Fosfat tamponlu saline (PBS) 14,7 mg/mL'de fotoinitiatör olan 4-benzoylbenzyl-trimethylammonium klorürü (PLPP) ekleyin. NOT: Plpp jelinin konsantre bir formu da kullanılabilir. PEG fırçasını (100 mJ/mm2)bozmak için gereken daha kısa ultraviyole (UV) aydınlatma süresi ile sonuçlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotoinitiator jel biriktirme<ol>
<li>Slaytın ortasına biriktirmek için 3 μL PLPP jel ve 50 μL mutlak etanol karışımı hazırlayın. Mutlak etanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi kimyasal bir kaputun altına yerleştirin. NOT: Bu aşamada, numune daha fazla kullanım için karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cam slayt mikropatterning<ol>
<li>Kapak kapağını bir Ludin odasına monte edin ve otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin.</li>
		<li>Öngörülen mikropatternlere karşılık gelen görüntüleri yazılıma yükleyin. Bu parametreleri uygulayın: replikasyon 4 x 4 kez, 200 μm aralık, UV dozu 1.000 mJ / mm2. Otomatik UV aydınlatma dizisinden sonra PLPP'yi birden fazla PBS yıkama ile durulayın. NOT: PLPP jel kullanılmışsa, deiyonize su ile kapsamlı yıkamalarla çıkarın, N2akışında kurulayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>30 dakika boyunca laminin (PBS'de 50 μg/ mL) ile kuluçkaya yatın. PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. NOT: Saflaştırılmış yeşil floresan proteinin floresan çözeltisi (PBS'de GFP, 10 μg/mL) laminin ile karıştırılarak mikropatternlerin floresan mikroskopisi ile görselleştirilmesi istenebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Nöronların ve GBM hücrelerinin ortak kültür için hazırlanması
<ol><li>Embriyonik sıçan hipokampal nöronların kültürü<ol>
<li>Embriyonik (E18) sıçanların hipokampuslarını parçalara parçalara parçalar ve dokuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethaneslfonic acid (HEPES)/penisilin-streptomisin çözeltisine 15 mL'lik bir tüpte aktarın. Hipokampusu kurutmadan fazla çözeltiyi çıkarın.</li>
		<li>Penisilin (10.000 birim/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) ve 1 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. HBSS/HEPES/penisilin-streptomisin çözeltisi ile 2x yıkayın ve dokunun bu çözeltide 2-3 dakika kalmasını sağla.</li>
		<li>Her doku ile 10x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak, köpürmeyi en aza indirmeye özen göstererek, iki alev cilalı Pasteur pipet kullanarak dokuyu ayrıştırın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun uygulanabilirliğini değerlendirin. Nöronları aşağıda belirtildiği gibi mikropatterned kapak örtüleri üzerine plakalayın. NOT: Ekstraksiyondan sonra hücre canlılık oranı %85-90'dır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikropatterned kapaklarda nöronlar için hücre kültürü<ol>
<li>PBS ile mikropatterned cam slaytları yeniden sulandırın ve komple nöronal hücre kültürü ortamını kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>E18 Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen hipokampal nöronları, %3 at serumu ile zenginleştirilmiş nörobakal ortamda (NBM) cm2 başına 50.000 hücre yoğunluğunda doğrudan mikropatterned cam kapak sapının üzerine tohum atın. Mikropatterned nöronları 48 saat boyunca inkübatöre (37 °C, % 5 CO2)yerleştirin. NOT: ~6 saat sonra, primer hipokampal nöronlar laminin mikropatternlerine bağlı olarak görülebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nöronlar üzerinde insan GBM kök benzeri hücrelerin ortak kültürü NOT: Bu çalışma için, membran GFP pozitif ve nükleer-domates hasta kaynaklı GBM hücreleri daha önce yayınlanan protokollere göre yetiştirilmiştir10.<ol>
<li>Küresel şekilli hücreler süspansiyonda büyüdükçe, süspansiyonu 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Küreselleri 5 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca hücre ayrıştırma reaktifinin 0,5 mL'si ile kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosunabakın).</li>
		<li>4,5 mL tam NBM ekleyin (B27 takviyesi, heparin, fibroblast büyüme faktörü 2, penisilin ve streptomisinin daha önce açıklandığı gibi8ile tamamlanır) ve otomatik sayım tekniği kullanarak hücreleri sayın.</li>
		<li>NBM'deki mikropatterned nöronal kültürün üzerinde %3 at serumu ile zenginleştirilmiş 1.000 GBM hücre tohum. Plakayı 37 °C, %5 CO2ve %95 nemde kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Canlı hücre görüntüleme
<ol><li>GBM hücre tohumlamadan hemen sonra, numuneyi termostat odası ile donatılmış ters bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Yazılımda çok boyutlu bir alım araç kutusu kullanarak birden fazla pozisyonu kaydetmek için motorlu bir aşama ile donatılmış mikroskopta canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Sıcaklık (37 °C) ve gaz kontrollü (%5CO2) ortamda 20x hedefle 12 saat boyunca her 5 dakikada bir parlak alan ve epifluoresans GFP/Domates görüntüleri elde edin.</li>
</ol>4. Görüntü analizi
NOT: Fiji kullanılarak, iki boyutlu (2D) görüntü yığını yarı otomatik olarak ev yapımı ve kullanıcı dostu bir araç kullanılarak (bu adreste mevcuttur: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), IJ1 makro dilinde yazılmıştır (Şekil 2A). Otomatik iş akışı ve yordamlar Şekil 2B'de özetlenmiştir.
<ol><li>Nöronal ağ analizi (Şekil 2Bi)<ol>
<li>Yığının bir görüntüsünü seçin. İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığıve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Ağ aracını sağ tıklatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Ağ aracını sol tıklatın.<ol>
<li>Seçili görüntüyü çoğaltın ve üç renk kanalına bölün (Kırmızı-Gri-Yeşil).</li>
			<li>Gri kanalı (brightfield) seçin ve farklı alanlar arasındaki ayrımı geliştirmek için kontrast uzatma geliştirme (CSE) gerçekleştirin. Kenar Bul komutu altında zaten gruplanmış olan 2D sinyal işleme konvolüzyon işlemini gerçekleştirmek için Sobel kenar dedektörünü (SED) kullanın.</li>
			<li>Çift filtreleme (F) için, gürültüyü azaltmak ve nesne sinyalini yumuşatmak için Gauss bulanıklığı ve ortanca filtre uygulayın. Siyah pikseller (hücre alanı) ve beyaz pikseller (arka plan) içeren ikili bir resim (BIN-gri) elde etmek için uyarlanmış eşik algoritmaları yürüterek Maskeye (CM) dönüştürün. Hücre alanını basit bir ağa (NET) iskeletleştirin (Sk) ve küçük, ağ bağlantısı olmayan parçacıkları kaldırarak net görüntüdeki parçacıkları (EP) filtreleyin.</li>
			<li>Kırmızı ve yeşil kanallar (çekirdek ve membran) için çift filtrelemegerçekleştirin, uyarlanmış eşik yöntemini kullanarak Maske'ye dönüştürün ve BIN-green'in Parçacıkları Çözümle komutuyla hücre morfolojisini belirlemesine izin verin.</li>
			<li>İlgi alanlarını (ROI) kullanarak tüm kanalları OR (birleştirme) işleciyle birleştirin ve ilk renklerini basit bir RGB görüntüsüne yeniden yönlendirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Tek hücreli hareketlilik analizi (Şekil 2Bii)<ol>
<li>İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak için Tek Hücre İzleme aracına sağ tıklayın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, İz türü = Çekirdek veya Zar, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Z projeksiyonu = Maksimum yoğunluk, Toplam Dilimler..., Gauss Bulanıklığı ve Ortanca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Tek Hücreli İzleme aracını sol tıklatın.<ol>
<li>Gri kanalı çıkarın. Zamana göre bir görüntü yığınına karşılık gelen bir görüntü oluşturacak yığına bir Z projeksiyonu uygulayın (T yığını). Çift filtre uygula ve hücrelerin bıraktığı izleri maskele'ye dönüştür. Bin-kırmızı/yeşil görüntüye küçük parçacıkları kaldırın.</li>
			<li>Yatırım getirisini kullanarak, hücre izlemenin her konturunun öğesini seçin ve sonraki adımlar için bu ön işleme adımını atlamak üzere Seçenekler iletişim kutusunda Kenar algılamayı atla kutusunu işaretleyin.</li>
			<li>
Kırmızı kanalı(İz türü = Çekirdek) özgün yığında yalıtın. Bir yatırım getirisi seçin ve dış alanı kaldırın. Tüm görüntüleri çift filtreleyin ve Maske'ye (BIN-red) dönüştürün. Her binarized çekirdeğin centroid X/Y konumunu belirleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı13için zaten yayımlanmış bir makro kullanarak, bu hücrenin ortalama kare yer değiştirme, yön oranı ve ortalama hızını hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çok hücreli izleme analizi (Şekil 2Biii)<ol>
<li>İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için İzleme aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için İzleme aracını sol tıklatın.<ol>
<li>Gri kanalı çıkarın.</li>
			<li>
Kırmızı ve yeşil kanalları bölün, çift filtreyi iki katınaçıkarın ve Maske 'ye dönüştürün.</li>
			<li>Görüntü Hesaplayıcısı'nıkullanarak kanalları birleştirin ... ve operatörü ile komut vererek, yalnızca zarlarda bulunan çekirdek sinyalini bırakır. NOT: Fiji'deki birkaç eklenti, bu ikili önceden işlenmiş görüntüdeki birkaç hücrenin X/Y konumunu aynı anda belirlemek için kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Daha önce açıklanan makro13'ü kullanarak, bu hücreler için yörünge grafiğini, ortalama kare yer değiştirme oranını, yönlülük oranını ve ortalama hızı hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sinir paspasında küresel göç (Şekil 2Biv)<ol>
<li>İlgili Seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin hassas bir segmentasyonunu oluşturmak için Ayarları (örneğin, Eşik = Üçgen, Li, Huang..., Gauss Bulanıklığı ve OrtaNca filtreler = 1, 2, 3...) ayarlamak için Geçiş aracına sağ tıklayın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Aşağıdaki yordamı otomatik olarak etkinleştirmek için Geçiş aracını sol tıklatın.<ol>
<li>Kırmızı kanalı kaldırın.</li>
			<li>
Yeşil ve gri kanalları bölün. </li>
			<li>Gri kanal için, nöronal paspasın konturunu manuel olarak çizin ve alanını ölçün.</li>
			<li>Yeşil kanal için, yığını çift filtreleyin ve Maske 'ye dönüştürün. Desenin (BIN) dışındaki alanı kaldırın ve her görüntü için binarized hücre alanını belirleyin. NOT: Yukarıda açıklanan parametreler, ilgi çekici simgeye sol tıklayarak değerleri değiştirerek kalibre edilir. Bu işlem manuel olarak yapılabilir. Ancak, çok sayıda görüntü (satın alma başına yaklaşık yüz), kanallar (genellikle 3 kanal) ve işleme adımları için otomatik veya yarı otomatik bir araç tercih edilir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li>
<li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li>
<li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2FCXCR4+expression+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li>
<li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li>
<li>Boyé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li>
<li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+Printing+by+Light%3FInduced+Molecular+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li>
<li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li>
<li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li>
<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li>
<li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Glioblastomas, farklı modlar kullanarak parenkimayı kapsamlı bir şekilde istila eder: WMTs18'dekan damarlarını çevreleyen ortak seçenek, interstisyel istila veya istila . Bu ikinci mod, literatürde WMT istilası ile ilgili uygun in vitro veya in vivo modelleri bulma zorluğu nedeniyle iyi karakterize değildir. Burada, kültürlü kemirgen nöronlarının laminin kaplı yüzeylerde desenli olduğu ve nöronların üzerine floresan GBM kök benzeri hücrelerin tohum edildiği basitleştirilmiş bir m...

GBM'ler de dahil olmak üzere primer malign gliomalar yıkıcı tümörlerdir ve GBM hastaları için orta sağkalım oranı 12 ila 15 ay olarak bildirilmiştir. Mevcut tedavi, radyoterapi ile birlikte büyük tümör kitle rezeksiyonu ve kemoterapiye dayanır, bu da sağkalım oranını sadece birkaç ay uzatır. Terapötik başarısızlıklar, kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca zayıf ilaç dağıtımı ve pervasküler alanlarda, menenjitlerde ve WMTs1boyunca invaziv büyüme ile yakından ilgilidir. Vasküler ko-seçenek olarak da adlandırılan pervasküler istila iyi çalışılmış bir süreçtir ve moleküler mekanizmalar aydınlatılmaya başlanmıştır; ancak, WMTs boyunca GBM hücre istilası süreci iyi anlaşılamamıştır. Tümör hücreleri Scherer'in ikincil yapıları boyunca sağlıklı beyne göç2. Gerçekten de, neredeyse bir yüzyıl önce, Hans-Joachim Scherer, şimdi perineuronal satellitoz, perivasküler satellitoz, subpial spread ve WMT boyunca istila olarak adlandırılan GBM'nin istilacı yollarını tanımladı (Şekil 1A).
Stromal hücre türevi faktör-1α (SDF1α) ve C-X-C motifli kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi bazı kemokinler ve reseptörleri, ancak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) değil, WMT invazyon3'ekarışmış gibi görünmektedir. Daha yakın zamanda, hücrelerarası bir ÇEN1-SOX2 ekseninin, GBM hücrelerinin WMT istilasında önemli bir yol olduğu gösterilmiştir4. Yazarlar, GBM kök benzeri hücrelerin kısmen olgunlaşmamış nöronlarda beyin parenkimini nasıl istila ettiğini anlattılar ve miyelin kılıflarının GBM hücreleri tarafından yok edilmesini önerdiler. 2019 yılında Nature dergisinde üç makalenin güvenli bir şekilde yayınlandığı bir kilometre taşına ulaşıldı ve glioma gelişiminde elektriksel aktivitenin rolünün altını çizdi5,6. Monje ve işbirlikçilerinin ufuk açıcı çalışmaları, glioma gelişimini destekleyen nöroligin-3'ün salgılanmasında elektrik aktivitesinin merkezi rolüne ışık tutuyor.
Winkler ve işbirlikçileri, GBM hücreleri (mikrotüpler) arasındaki bağlantıların invaziv adımlarda ve son zamanlarda yeni tanımlanan nöroglioma sinapsları aracılığıyla GBM hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerde çok önemli olduğunu açıkladılar. Bu yapılar, tümör gelişimini ve istilasını destekleyen GBM hücre zarındaki α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazolepropionik asit (AMPA) reseptörlerinin glutamaterjik stimülasyonunu tercih eder. Tümör hücre invazyonu, GBM hastalarında gözlendiği gibi metastazların veya uzak sekonder odakların yayılmasında merkezi bir süreçtir. Thrombospondin-1, dönüşen büyüme faktörü beta (TGFβ tarafından düzenlenmiş matrisli protein veya kemokin reseptörü CXCR3)7,8gibi GBM invazyonunda önemli olduğu belirlenmiştir.
Burada, nöronların laminin izleri üzerinde desenli olduğu ve GBM hücrelerinin tek hücreli veya küresel olarak tohumlandığı GBM istilasını incelemek için basitleştirilmiş bir biyomimetik model tanımlanmıştır (Şekil 1B). İki deneysel ayar, GBM 9,10,11'de gözlenen nöronlar üzerindeki istilayı yeniden yakalamayı amaçlamaktadır. Bu tür modeller geçmişte, mekanik veya kimyasal özellikleri modüle ederek hücre göçlerini incelemeye izin veren hizalanmış nanofiber biyomalzemeler (çekirdek kabuk elektrospinning) olarak geliştirilmiştir12. Bu makalede açıklanan ortak kültür modeli, bu süreçte yer alan yeni moleküler yollar tanımlayarak GBM hücrelerinin nöronlar üzerinde nasıl kaçtığını daha iyi anlamanızı sağlar.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil) trietoksisilan</td><td>Sigma</td><td>440140-100ML</td><td>Amino grubu, mPEG-SVA</td></tr><tr><td>96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakanın</td> biyokonjugasyonu için yararlıdır <td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>Sferoidleri hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>-20 ° C'de saklanır; C (uzun vadeli) veya 4 & derece; C (kısa süreli), küre ayrışma enzimi</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20 °C'de saklanır; C, kullanmadan önce buzunu çözün</td></tr><tr><td>Temel Fibroblast Büyüme Faktörü</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 ° C'de saklanır; C, kullanmadan önce buz çözme</td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma OdasıSlaytlar</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Hücre sayımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>Hücre kültürü substratı</td></tr><tr><td>Kurutucu kartuşları</td><td>Sigma</td><td>Z363456-6EA</td><td>(3-aminopropil) trietoksisilan tedavisi sırasında mostürü azaltmak için kullanılır</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4'te saklanır &deg; C</td></tr><tr><td>Fiji yazılımı, MTrack2 makro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Resimleri analiz etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Flask 75 cm&sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>Nöronal yapışmayı teşvik eder</td></tr><tr><td>Leonardo yazılımı</td><td></td><td></td><td>öngörülen mikro desenlerin yüklenmesi</td></tr><tr><td>MetaMorph Yazılımı&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>Mikroskopi otomasyon yazılımı</td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>%2 nihai konsantrasyon için NBM'de seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>4 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td> <td>motorlu tabla ile donatılmış ters mikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin - Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveol</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>PEG fırçasını bozmak için kullanılan foto başlatıcı</td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol) -Süksinimidil Valerate (mPEG-SVA)</td> <td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>Kirlenme önleyici kaplama olarak kullanılır</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>Dijital mikro ayna cihazı (DMD) tabanlı UV projeksiyon cihazı</td></tr><tr><td>Tripan mavisi %0,4</td> <td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Hücre sayımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>Yapışık hücreleri ayırmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

göç ve hücresel etkileşimleri İncelemek İçin desenli nöronlarda glioblastoma kök benzeri hücrelerin ortak kültürü

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastomas (GBM), grade IV malign gliomalar, agresif özellikleri nedeniyle en ölümcül insan kanseri türlerinden biridir. Bu tümörlerin genetiğindeki önemli gelişmelere rağmen, GBM hücrelerinin sağlıklı beyin parankimini nasıl istila ettiği iyi anlaşılamamıştır. Özellikle, GBM hücrelerinin peritümoral alanı farklı rotalarla istila ettiği gösterilmiştir; bu makalenin ana ilgisi beyaz madde yolları (WMTs) boyunca rotadır. Tümör hücrelerinin peritumoral sinir hücresi bileşenleri ile etkileşimleri iyi karakterize değildir. Burada nöronların GBM hücre invazyonunun üzerindeki etkisini değerlendiren bir yöntem tanımlanmıştır. Bu makale, GBM kök benzeri hücrelerin nöronlar üzerindeki göçünü analiz ederek WMT invazyonunun taklit edildiği gelişmiş bir ortak kültür in vitro testini sunun. GBM hücrelerinin nöronların varlığındaki davranışları, açık kaynaklı ve serbest erişimli yazılımlarla otomatik bir izleme prosedürü kullanılarak izlenir. Bu yöntem, özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar için birçok uygulamanın yanı sıra GBM hücre göçini engelleyebilen farmakolojik ajanların nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmek için yararlıdır.

Protokol bölümünde açıklandığı gibi floresan GBM hücreleri ile birlikte kültürlenen desenli nöronlar hazırlandı ve izleme deneyleri yapıldı. GBM hücreleri nöronlara göç ederken şekillerini hızla değiştirdi (Şekil 1B: panel 6 ve Video 1). Hücreler rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göç etti (Video 1). Floresan GBM hücreleri ve floresan olmayan nöronlar kolayca ayırt edilebilir ve bu, protokol bölümünde açıklandığı gibi Fiji makr...

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomalar, invaziv profili yüksek olan yıkıcı beyin tümörleridir. Bu ortak kültür sistemi, hastalarda gözlenen invaziv rotalardan birini yeniden canlandırmak için nöronlar üzerindeki glioblastoma hücrelerinin göçini taklit eder. Ortak kültür modelimizin geometrisi ve bileşimi tam olarak kontrol edilir.Daha iyi bir tekrarlanabilirliği ve karmaşık biyolojik süreçlerin basit bir nicelemesini kolaylaştırır. Bu yöntem, yeni ayrışmış glioblastoma hücreleri ve nöronları birlikte kült ederek klinik tanıya uyarlanabilir. Klinik sonuç olarak çok önemli olan klinik indeksi tanımlar.Yöntemimiz, fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer göç eden hücreleri ölçmek için de kullanılabilir. Prosedürü gösteren joris Guyon olacak, ekibimden bir doktora öğrencisi. Mikropatterning için bir substrat yapmak için, kapakları bir saat boyunca 100 mikrolitre triethoxysilane ile bir desiccator'a yerleştirmeden önce beş dakika boyunca hava veya plazma aktivasyonu ile 18 milimetre dairesel cam kapak örtülerini tedavi edin, ardından bir saat boyunca milimetre başına 100 miligramda bir PEG-SVA çözeltisini kuluçkaya bırakın.Jel biriktirme için, inkübasyonun sonunda, slaytın ortasına üç mikrolitre PLP

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu videoda, peritümöral boşluklardaki nöronlar üzerinde göç ederken glioblastoma kök benzeri hücrelerin miyelinli nöronal yolların istilasını taklit eden mikro desenli nöronlar üzerindeki glioblastoma hücrelerinin bir ko-kültür testi açıklanmaktadır. Bu tahlil, glioblastoma hücrelerinin göçünü inhibe eden farmakolojik ilaçların bir gliomdaki nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmeye yardımcı olabilir.

Desenli Nöronlar Üzerinde Glioblastoma Hücrelerinin Birlikte Kültürlenmesi: Glioblastoma Hücrelerinin Sıçan Hipokampal Nöronları Üzerindeki Göçünü İn Vitro İzlemek İçin Bir Teknik

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Kanserin kötü huylu davranışını anlamak, tümör hücrelerinin makrofajlar gibi tümör mikro çevresinin bileşenleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair doğru modeller oluşturmayı gerektirir. Burada, tümörle ilişkili makrofajlar ve mikroglia ile glioblastoma hücre etkileşimini incelemek için iki yöntem tanımlanmıştır ve burada glioblastoma invazyonu üzerindeki etki değerlendirilmektedir.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Burada, kantitatif geçiş ve zamanla ve birden fazla tedavi koşullar altında işgal glioblastoma Beyin tümör kök hücrelerin ölçmek için canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklar.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Öğrenin, glioblastoma kök benzeri hücrelerin desenli nöronlar üzerindeki göç davranışını ortak kültür sistemiyle incelemeyi. Bu yöntem, tümör invazyonunu klinik tanı için nicelendirir.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Daha fazla video keşfet