Name: Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogasterde Tümör Allotransplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster'de otomatik enjektör kullanarak tümör allotransplantasyonunu nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem, hız, tutarlılık ve verimlilik artışı sağlayarak kanser araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eski laboratuvar üyeleri Dr. Sheng-An Yang ve Bay Juan-Martin Portilla'ya bu protokolün geliştirilmesindeki katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Dr. Yan Song'un Pekin Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi'ndeki laboratuvarına, manuel allotransplantasyon konusundaki protokollerini paylaştıkları için minnettarız. Ayrıca Bay Calder Ellsworth ve Bay Everest Shapiro'ya el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz.
KİS'ler bu çalışma için Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (https://www.nih.gov/) fon (GM072562, CA224381, CA227789) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (htps://nsf.gov/) finansman (IOS-155790) aldı. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

1. SG hayali halka tümörünün hazırlanması
<ol><li>UAS-NICD (Erkek: 10-15 sinek) ve Act-Gal4, UAS-GFP / CyO genotipleri ile yetişkin sinekleri çaprazlayın; küvet-Gal80ts (Bakire dişi: 10-15 sinek) ve 18 ° C'de 1 gün boyunca üremelerine izin verin. Seçilen yetişkin sinekler yüksek doğurganlık sağlamak için 5-9 günlük olmalıdır.</li>
	<li>Yetişkin sineklerin, şişelerde bulunan sinek yiyeceklerine 18 ° C'de 24 saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin, ardından yetişkin sinekleri çıkarın. NOT: Sinek yiyecekleri, Drosophila Stok Merkezi8'in standart mısır unu yemek tarifi kullanılarak hazırlanır. Her şişe yaklaşık 10mL sinek yemi içermelidir.</li>
	<li>Yumurtaların 18 ° C'de 6 gün boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin. Bu dönemde larvalar yumurtadan çıkacaktır.</li>
	<li>Larva içeren şişeleri 29 ° C'lik bir inkübatöre aktarın ve 7 gün daha inkübe edin. NOT: Bu inkübasyon adımı, spesifik deneysel tasarıma bağlı olarak isteğe bağlıdır.</li>
</ol>2. Allotransplantasyon için yetişkin vahşi tip Drosophila'nın hazırlanması
<ol><li>Yabani tip veya uygun mutant yetişkin sinekleri% 100 CO2 ile uyuşturun ve sinekleri cinsiyetlere göre sıralayın. Hem erkek hem de dişi sinekler tümör konakçıları olarak kullanılabilir.</li>
	<li>5 cm uzunluğunda bir sinek bandı parçasını, yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde mikroskop slaytına, her iki ucunda birer tane olmak üzere iki küçük bant parçasıyla sabitleyin.</li>
	<li>Kanatlarını banda yapıştırarak sinekleri hareketsiz hale getirin. Sinekleri manevra yaparken forseps kullanın.<ol>
<li>Allogreft alıcıları olarak kullanılan 60-80 yetişkin sinek için yukarıdaki adımı tekrarlayın. NOT: Sinekleri, daha sonra daha verimli bir enjeksiyon işlemi için vücut eksenleri birbirine paralel olarak hizalanmış düzgün sıralar halinde düzenlemek en iyisidir. Şekil 1 , bu şekilde bantlanmış konakçı sinek sıralarını göstermektedir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Otomatik enjektör aparatının montajı
<ol><li>Hem otomatik enjektör aparatını hem de güç kablosunu kontrol ünitesi kutusuna bağlayın.<ol>
<li>Enjeksiyon hacmini 59,8 nL'ye ayarlayın. Bu, allotransplantasyon sırasında uygun miktarda emme ve enjeksiyon kuvvetinin korunmasına yardımcı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontrol kutusunu ve otomatik enjektörü, ışık mikroskobunun karşı taraflarına yerleştirin. NOT: Sağ elini kullanan operatörler için, kontrol kutusu mikroskopun sol tarafına, enjektör sağ tarafa yerleştirilmelidir. Solak operatörler için bunun tersi de geçerlidir.</li>
	<li>3,5'' cam kılcal damarı, kapalı ucu forseps ile kırparak kullanıma hazırlayın.<ol>
<li>Cam kılcal damarın bir ucunu dört adımlı bir mikropipet çektirici kullanarak işleyin ve cihazda aşağıdaki özellikleri kullanarak dar, kapalı bir uca ısıtın: Isı = 650, Kuvvet = 200 ve Mesafe = 8. Kılcal damarları çektirme aparatına düzgün bir şekilde yerleştirin ve yukarıdaki ayarları girdikten sonra programı çalıştırın.</li>
		<li>Yetişkin sinek karnına kolay giriş için daha keskin bir son oluşturmak üzere kılcal damarı yaklaşık 60° açıyla kesmek için forseps kullanın1. İyi kırpılmış kılcal damar örneği için Şekil 2'ye bakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjektörün kapağını hafifçe sökün. Enjektör iğnesini toplam uzunluğunun% 70-80'i görünene kadar ilerletmek için Boş düğmesini basılı tutun. Kılcal damar ilerlemesini hızlandırmak için Doldur düğmesine bir kez basın ve aynı anda Boş düğmesini basılı tutun.</li>
	<li>Cam kılcal damarı mineral yağ ile doldurmak için bir şırınga kullanın. Ardından, cam kılcal damarı, enjektörün kauçuk tıpasına sıkıca tutturulana kadar enjektör iğnesine dikkatlice yerleştirin. Şimdi enjektör kapağını sıkıca vidalayın.<ol>
<li>Allotransplantasyon sırasında ortamın kirlenmesini önlemek için cam kılcal kapağın dış yüzeyindeki mineral yağ kalıntılarını silin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SG hayali halka tümörünün diseksiyonu
<ol><li>Larvalardan birini seçin ve SG hayali halka tümör diseksiyonuna hazırlanmak için 100 μL Schneider's Medium ile doldurulmuş bir diseksiyon plakasına aktarın. NOT: Sadece tümörü barındıran örnekler larva olarak kalacaktır. Bunun nedeni, tümör büyümesinin larva gelişimini ve ilerlemesini geciktirmesidir9. Örneklerin üçte ikisi tümörü barındırmayacak ve böylece pupa / yetişkinlere ilerlemiş olacaktır.<ol>
<li>Diseksiyon ve allotransplantasyon amacıyla, 10x-20x büyütme aralığına sahip bir stereomikroskop kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larva gövdesinin orta bölümünü tutmak için bir çift forseps kullanarak, başka bir çift forseps kullanarak larva kafasını sıkıştırın ve uzunlamasına bir germe kuvveti uygulayın.</li>
	<li>Larvaların Y şeklindeki SG'sini bulun ve larva dokusunun geri kalanından izole edin10.</li>
	<li>SG hayali halka tümörünü, bitişik dokuyu çıkararak diseke edin ve izole edin. Bu diseksiyon işleminin bir tasviri için Şekil 3'e bakınız.</li>
	<li>Araştırma ihtiyaçlarına göre ilave 10 ila 20 SG hayali halka tümörleri için 4.1-4.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>5. Primer SG hayali halka tümörünün allogrefti
<ol><li>Kılcal damarı, primer SG hayali halka tümörlerini içeren Schneider's Medium'a batırın. Cam kılcal damarı Schneider's Medium ile en üstteki 0,5 cm'lik segmente kadar doldurmak için Doldur düğmesini basılı tutun. Bu üst segment mineral yağ ile dolu kalmalıdır. NOT: Boş düğmesine bir kez basarken aynı anda Doldur düğmesini basılı tutarak bu işlemi hızlandırın.</li>
	<li>Birincil bir tümörü bulun ve tümör kılcal damara emilene kadar Doldur düğmesine basın.<ol>
<li>Tümörün kılcal damarın ucunda veya kılcal damarın ucundan birkaç milimetre uzakta oturduğundan emin olun. Bu, tümörün sürüklenmesini ve kılcal damarda bulunan çözeltide kaybolmasını önlemeye yardımcı olur. Kılcal damarda otururken uygun tümör lokalizasyonunun gösterilmesi için Şekil 4A'ya bakınız.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskop slaytındaki banda hareketsiz hale getirilmiş yetişkin bir sinek bulun. Forseps kullanarak, alt karın bölgesini yavaşça tutun. Daha sonra, karın alt lateral kütikülünü kılcal damar ile delin. Tümör yeni konakçı karnına girene kadar Boş düğmesine basın. Bu tekniğin gösterimi için Şekil 4B'ye bakınız.</li>
	<li>Forseps kullanarak, konağın kanatlarını banttan çıkarmak için yavaşça sıkıştırın. Ev sahibini taze yiyeceklerle yeni bir şişeye yerleştirin. Şişeyi enjeksiyondan sonraki ilk 24 saat boyunca yana doğru yerleştirmek en iyisidir. Her şişe sadece en fazla 20 sinek içermelidir. NOT: Bazı konakçı sineklerin enjeksiyondan sonra vücutlarında eksik kanatlar ve diğer yaralar olacaktır ve şişe dik yerleştirilirse sinek yemine yapışabilir.</li>
	<li>Kalan primer tümörleri yeni yetişkin konakçılarına nakletmek için 5.2 ile 5.4 arasındaki adımlarıtekrarlayın.
</li>
	<li>Kılcal damarları keskinlerin kabına atın ve aparatı tekrar kutusuna koymadan önce mineral yağ kalıntılarını otomatik enjektörün dışından temizleyin.</li>
	<li>Ana bilgisayar şişesini 1 gün boyunca oda sıcaklığında saklayın, ardından şişeyi 29 ° C'de bir inkübasyon odasına aktarın. Sinek konakçılarını her 2-3 günde bir yeni şişelere aktarın.</li>
	<li>Sinek konakçılarını günlük olarak izleyin ve hayatta kalma oranlarını hesaplayın. Bir hafta sonra, tümörler floresan adaptörlü bir stereo mikroskop altında görünür olmalı ve boyutları ve ilerlemeleri için sürekli olarak izlenebilir.</li>
</ol>6. Nakledilen tümörlerin yeniden allogreftlenmesi
<ol><li>Allogreftten yaklaşık 10-14 gün sonra, floresan mikroskobu kullanarak konakçı karınlarda büyüyen tümörleri tarayın.</li>
	<li>Bir konağı CO2 ile anestezi altına alın ve 100 μL Schneider Medium ile doldurulmuş bir diseksiyon plakasına yerleştirin. Büyümüş allogreftlenmiş tümörü iki çift forseps kullanarak konakçıdan diseke edin.<ol>
<li>Karnı tutmak için bir çift forseps kullanın ve diğer çift karın kütikülü kesmek için tahsis edilmiş tümörü açığa çıkarın1.</li>
		<li>Tümörü, bağlı konakçı dokulardan, floresan belirteçlerini kılavuz olarak kullanarak mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde izole edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki ila üç ek tahsis edilmiş tümöre hazırlanmak için adım 6.2'yi tekrarlayın.</li>
	<li>Hasat edilen tümörleri içeren diseksiyon plakasını bir ışık mikroskobu sahnesine aktarın.</li>
	<li>Steril iğneler kullanın ve tümörleri kılcal boyuta uygun daha küçük parçalara ayırın.</li>
	<li>Yeni nesil yetişkin konakçıları hazırlamak için 4.1-4.5 adımlarını tekrarlayın ve tümörlerin allotransplantasyonunu tamamlamak için 5.1-5.7 adımlarını tekrarlayın. NOT: Primer olmayan tümörlerde başarı oranları genellikle primer tümörlere göre daha yüksektir.</li>
	<li>Çalışmada kullanılan sonraki her nesil sinek için 6.1-6.6 arasındaki adımları tekrarlayın. NOT: Deneysel ihtiyaçlara uygun Drosophila konak çizgilerini seçin.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+tumor+growth+in+Drosophila+using+the+tissue+allograft+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).</li>
<li>Magadi, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Hes-centred+transcriptional+networks+in+neural+stem+cell+maintenance+and+tumorigenesis+in+Drosophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia.</a> Development. 147 (22), (2020).</li>
<li>Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaller%2C+S+%22Pseudomonas+Methods+and+Protocols%22">Pseudomonas Methods and Protocols</a>. , Springer. 723-740 (2014).</li>
<li>Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+protocol+for+the+African+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%2C+by+means+of+nano-injection%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection.</a> African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).</li>
<li>Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+nanoinjection+and+electrophysiology+assay+to+screen+for+bioactivity+of+compounds+using+the+Drosophila+melanogaster+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).</li>
<li>Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+notch+triggers+neoplastic+tumorigenesis+in+a+transition-zone-like+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment.</a> Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BDSC+Cornmeal+Food%22">BDSC Cornmeal Food</a>. , (2020).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
<li>Kennison, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+salivary+glands+and+polytene+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Ji, H., Han, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LarvaSPA%2C+a+method+for+mounting+drosophila+larva+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).</li>
<li>Mirzoyan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+organism+to+study+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer.</a> Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).</li>
<li>Bangi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+at+the+intersection+of+infection%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).</li>
<li>Saavedra, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+tumor-induced+organ+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+drosophila+tumors+interrupt+insulin+signaling+to+induce+cachexia-like+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting.</a> Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Koyama, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bellymount+enables+longitudinal%2C+intravital+imaging+of+abdominal+organs+and+the+gut+microbiota+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila.</a> PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).</li>
</ol>

Yazarlar arasında beyan edilecek çıkar çatışması yoktur.

Tümör allotransplantasyonu, araştırmacıların Drosophila tümörünün büyümesi ve ilerlemesi sırasında ortaya çıkan bazı sorunları ele almalarına yardımcı olabilir. Böyle bir zorluk, primer tümör kültürü 12 sırasında tümör taşıyan larvaların veya yetişkinlerin erken ölümlerininatlatılmasıdır. Bu bağlamda, devam eden tümör allotransplantasyonu, tümörlerin süresiz olarak büyümesine izin verir, bu da tümör büyümesi, metastazı ve evriminin uzunlamasına incelenmesini kolaylaştırır. Tümör allotrans...

Bu protokol, Drosophila larva tükürük bezi (SG) hayali halka tümörlerinin bir oto-nanolitre enjeksiyon aparatı (örneğin, Nanoject) kullanılarak yetişkin konakçıların karınlarına allotransplantasyonu için adım adım rehberlik sağlar. Bu protokol aynı zamanda tümörlerin yeni nesil yetişkin konakçılara daha sonra yeniden tahsis edilmesi için talimatlar sağlar, bu da tümör evrimi ve tümör-konakçı etkileşimleri gibi tümör özelliklerinin uzunlamasına incelenmesi için fırsatlar sağlar. Protokol, ilaç tarama deneylerine de uygulanabilir.
Bu yöntem, Drosophila'da tümör allotransplantasyonunun manuel enjektörler1 kullanılarak gerçekleştirilmesinin etkinliğini artırmak için geliştirilmiştir, bu da emme ve enjeksiyon kuvvetlerinde genellikle tutarsızdır ve tümör allotransplantasyonu için optimal olmayan sonuçlara yol açmaktadır. Bir otoenjektör aparatı daha iyi kontrol sağlar ve allogreft sonrası daha düşük sinek mortalitesi oranlarına neden olabilir. Eğitimli bir operatör, manuel enjektörkullanıldığında yaklaşık% 80'e kıyasla, otomatik enjektör ile% 90'ın üzerinde bir konakçı hayatta kalma oranı elde edebilir1. Allogreft sonrası 8-12. günlerde genel tümör edinme oranı %60-80'dir. Ortalama enjeksiyon süresi ayrıca manuel bir enjektör kullanılarak sinek başına 30-40 sn'den otomatik enjektör kullanılarak sinek başına 20-25 sn'ye yükseltilmiştir.
Bu protokol, Drosophila tümör allotransplantasyonunda otoenjektör aparatını kullanan ilk birkaç protokol arasındadır. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, tümörlü nöral kök hücrelerin allotransplantasyonu için otoenjektör de kullanılmıştır2. Daha önce, otoenjektör aparatı Drosophila'da bakteriyel virülans3, paraziter enfeksiyonlar ve konakçı savunması4'ü incelemek ve farklı bileşiklerin biyoaktivitesini taramak için kullanıldı5. Protokolümüz, otoenjektör aparatını tümör enjeksiyonu kullanımı için uyarlar ve Drosophila araştırmacılarına daha yüksek kaliteli ve daha tutarlı sonuçlar sunarken onlara önemli ölçüde zaman kazandırmayı amaçlamaktadır. Bu protokol sadece tümörlerin allotransplantasyonu için kullanılamaz, aynı zamanda benzer kalibre6'daki wildtype ve mutant dokuların allotransplantasyonuna da uyarlanabilir.
Bu protokolde kullanılan Drosophila NICD tümörü ilk olarak Yang ve ark.7 tarafından SG hayali halka geçiş bölgesinde, yüksek seviyelerde endojen Janus Kinaz / Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörleri (JAK-STAT) ve c-Jun N-terminal Kinaz (JNK) aktivitesi sergileyen bir "tümör sıcak noktası" nda tanıtıldı. Ek olarak, geçiş bölgesi yüksek seviyelerde matriks metalloproteinaz-1 (MMP1)7'ye sahiptir, bu da bu bölgeyi özellikle tümörigeneze elverişli kılar. NICD aşırı ekspresyonu yoluyla çentik yolu aktivasyonu tek başına tümör oluşumunu sürekli olarak başlatmak için yeterlidir. Bu tümörler daha sonra tümör hücresi bölünmesi, invazyonu ve tümör-konakçı etkileşimleri dahil olmak üzere çok çeşitli konuların araştırılmasına izin vermek için tahsis edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>LSM 980</td><td>"Zeiss LSM 980" olarak da bilinir</td></tr> <tr><td>Mısır unu sineği yemi</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>N/A</td><td>"BDSC Standart Mısır Unu Gıdası" olarak da</td></tr> <tr><td>bilinirDiseksiyon İğnesi (30Gx1/2)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td></td></tr><tr><td>Sinek Bandı</td><td>Fisherbrand</td><td>159015A</td><td></td></tr><tr>Stero Mikroskop <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>için Floresan Adaptörü</td><td>SFA-UV</td><td>"NightSea Floresan Adaptörü" olarak da bilinir</td></tr> <tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td>"Zeiss Stereo Discovery.V8" olarak da bilinir</td></tr> <tr><td>Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10</td><td>"Dumont #5 Forseps" olarak da bilinir&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam Kılcal (3.5 '')</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Tutkal</td><td>Elmer</td><td>E305</td><td>"Elmer Washabale Clear Glue" olarak da bilinirIşık</td></tr> <tr><td>mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>435063-9010-100</td><td>"Zeiss Stemi 305" olarak da bilinir</td></tr> <tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>PUL-1000</td><td>"Dört Adımlı Mikropipet Çektirme" olarak da bilinir"</td></tr><tr><td>Nanoject Aparatı</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>"Nanoject II Otomatik Nanolitre Enjektör" olarak da</td></tr> <tr><td>bilinirSchneider'ın Orta</td><td>ThermoFisher</td><td>21720001</td><td></td></tr><tr><td>Şırıngası (27G x1 / 2)</td> <td>BD PrecisionGlide</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Flakon</td><td>Fisherbrand</td><td>AS507</td><td></td></tr></tbody></table>

programlanabilir otomatik nanolitre enjektör ile drosophila melanogaster'de tümör allotransplantasyonu

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

Bu protokol, Drosophila melanogaster'deki tümörlerin oto-nanolitre enjeksiyon cihazı kullanılarak allotransplantasyonunu tanımlar. Bir otoenjektör aparatının kullanılmasıyla, eğitimli operatörler manuel enjektör kullanılarak elde edilenlere kıyasla daha verimli ve tutarlı transplantasyon sonuçları elde edebilirler. Burada, konuları kronolojik bir şekilde ele alıyoruz: Drosophila çizgilerinin geçmesinden, primer tümörün indüksiyonuna ve diseksiyonuna, primer tümörün yeni bir yetişkin konağa transplantasyonuna ve genişletilmiş çalışmalar için tümörün nesiller boyu transplantasyonuna devam edilmesine. Bir gösterim olarak, burada kuşak transplantasyonu için Notch hücre içi alan (NICD) aşırı ekspresyonuna bağlı tükürük bezi hayali halka tümörleri kullanılmaktadır. Bu tümörler ilk önce larva tükürük bezi hayali halkaları içindeki bir geçiş bölgesi mikro ortamında güvenilir bir şekilde indüklenebilir, daha sonra devam eden tümör büyümesini, evrimini ve metastazını incelemek için in vivo olarak tahsis edilebilir ve kültürlenebilir. Bu allotransplantasyon yöntemi, potansiyel ilaç tarama programlarında ve tümör-konakçı etkileşimlerini incelemek için yararlı olabilir.

Burada, nanolitre enjeksiyon otoenjektör aparatını kullanarak SG hayali halka tümörlerinin nesiller arası allotransplantasyonunu gerçekleştirdik ve tümör büyümesi, tümör hücresi göçü ve tümör-konakçı etkileşimleri konularına daha derin bir dalış sağlayan konfokal lazer tarama mikroskobu ile daha sonra tümör canlı görüntüleme gerçekleştirdik. Sinekleri monte ederken, onları bir mikroskop slaytına yapıştırın ve bir polidimetilsiloksan (PDMS) blok11 ile sınırlandırın.
<str...

Bu protokol, neoplazinin çeşitli yönlerini incelemek için Drosophila tümörlerinin yetişkin konakçıların karnına ilk ve devam eden kuşak allotransplantasyonu için ayrıntılı rehberlik sağlar. Bir otoenjektör aparatı kullanarak, araştırmacılar geleneksel, manuel yöntemlerle elde edilenlere kıyasla daha iyi verimlilik ve tümör verimi elde edebilirler.

Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogaster'de Tümör Allotransplantasyonu

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Bu protokol, Drosophila tümör allotransplantasyonunda otoenjektör aparatının kullanımını tanımlayan ilk protokoller arasındadır. Son yıllarda popülaritesi artan bir konu. Bu yöntemin temel avantajı, tümör allotransplantasyonunun hızını, tutarlılığını ve verimini artırarak Drosophila'da kanser araştırmalarının etkinliğini arttırmasıdır.Drosophila'da tümör allotransplantasyonu, ustalaşması zor olabilecek hassas bir tekniktir. Sabırlı olun ve uygulamanın mükemmelleştirdiğine güvenin. Sinekleri geçtikten ve yumurtaları altı gün boyunca 18 santigrat derecede kuluçkaya yatırdıktan sonra, yumurtadan çıkmış larvaları içeren şişeleri 29 santigrat derecede ayarlanmış bir inkübatöre aktarın.Anestezi uygulanan vahşi tip veya mutant yetişkin sinekleri cinsiyetlerine göre sıralayın. Beş santimetre uzunluğunda bir sinek bandı parçasını, yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde mikroskop slaytına sabitleyin. Kanatlarını forseps ile banda yapıştırarak sinekleri hareketsiz hale getirin.Kontrol kutusunu ve otomatik enjektörü, ışık mikroskobunun karşı taraflarına yerleştirin. Cam kılcal damarın bir ucunu dört adımlı bir mikro pipet çektirici kullanarak işleyin ve dar bir kapalı uca ısıtın. 3,5 inçlik bir cam kılcal damar hazırlamak için kılcal damarı yaklaşık 60 derecelik bir açıyla kesmek için forseps kullanın.Enjektörün kapağını hafifçe sökün. Enjektör iğnesini toplam uzunluğunun% 70 ila% 80'i görünene kadar ilerletmek için boş düğmeyi basılı tutun. Cam kılcal damarı mineral yağ ile doldurmak için bir şırınga kullanın.Larvalardan birini seçin ve SG hayali halka tümör diseksiyonuna hazırlanmak için 100 mikrolitre Schneider's Medium ile dolu bir diseksiyon plakasına aktarın. Larva gövdesinin orta bölümünü tutmak için bir çift forseps kullanarak, larva kafasını başka bir çift forseps kullanarak sıkıştırın ve uzunlamasına bir germe kuvveti uygulayın. Larvaların Y şeklindeki SG'sini bulun ve izole edin, ardından bitişik dokuyu çıkararak SG hayali halka tümörünü diseke edin.Cam kılcal damarı, doldurma düğmesini basılı tutarak en üstteki 0,5 santimetrelik segmente kadar Schneider's Medium ile doldurun. Birincil bir tümörü bulun ve tümör kılcal damara emilene kadar doldurma düğmesine basın. Tümörün kılcal damarın ucunda veya kılcal damarın ucundan birkaç milimetre uzakta oturduğundan emin olun.Banda hareketsiz hale getirilmiş yetişkin bir sinek bulun. Daha sonra alt karnı hafifçe tutmak ve karnın alt lateral kütikülünü kılcal damarla delmek için forseps kullanın. Tümör yeni konakçı karnına girene kadar boş düğmeye basın.Forseps kullanarak, konağın kanatlarını banttan çıkarmak için yavaşça sıkıştırın. Sonra taze yiyeceklerle yeni bir şişeye yerleştirin. Allograftan yaklaşık 10 ila 14 gün sonra bir floresan mikroskobu kullanarak konakçı karınlarında büyümüş tümörlerin taranması ve yetiştirilen allogreftlenmiş tümörün iki çift forseps kullanılarak konakçıdan çıkarılması.Karnı tutmak için bir çift forseps kullanın ve diğer çift karın kütikulasını kesmek için tahsis edilmiş tümörü açığa çıkarın. Tümörü bağlı konakçı dokulardan dikkatlice izole edin. Steril iğneler kullanın ve tümörleri kılcal boyuta uygun daha küçük parçalara ayırın.Tümörün allotransplantasyonunu tamamlamak için yeni nesil yetişkin konakçılar için bu işlemi tekrarlayın. Tümör gelişim süreci, allotransplantasyon sonrası 10. günde erişkin bir konakçı karnında büyüyen birinci nesil SG hayali halka tümörünün canlı görüntülenmesi ile izlendi. Allotransplantasyon sonrası 10. günde konakçı karnın büyük bir bölümünü kaplayan altıncı jenerasyon SG hayali halka tümörü burada gösterilmiştir.Bu aşamada görüntüleme, tümör büyüme paternlerinin yanı sıra göç ve invazyon davranışlarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Tümör transplantasyonu, tümör progresyonu, evrimi ve metastazı için uzunlamasına çalışmalar için harika bir tekniktir. Tümör konakçı etkileşimlerini incelemek için büyük önem taşıyan sonuçlar.Bu proto, Temodal ilaçlarını kullanan kanser ilaç taramalarında büyük potansiyele sahiptir. Bu tekniği kullanarak, araştırmacılar araştırmada önemli ölçüde zaman ve çaba tasarrufu sağlayabileceklerdir.

tumor-allotransplantation-drosophila-melanogaster-with-programmable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

RAS V12 ve karalanmış, tümör hücreleri de invaziv davranışlar sergileyen Drosophila tümör büyüme neden gibi hücre polarite genlerindeki mutasyonlar gibi bir aktive onkogen arasındaki işbirliği. Burada iyi huylu ve invaziv tümörlerin indüksiyon ve gözlem için basit bir protokol verilmektedir.

Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Kanser hücrelerinin transplantasyonu, kanser mekanizmalarının ve terapötik tepkilerin tanımlanması için önemli bir araçtır. Mevcut teknikler, bağışıklık yetersiz hayvanlara bağımlıdır. Burada, tümör hücresi davranışının ve in vivo ilaç yanıtlarının uzun vadeli analizi için immün yetkin embriyolara zebra balığı tümör hücrelerini nakletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Bu yöntemin amacı, memeli tümör hücrelerini floresan etiketli kan damarlarıolan zebra balığı embriyosuna xenografting ederek tümör anjiyogenezinin in vivo modelini oluşturmaktır. Ksenogreft ve ilişkili damarların görüntülenmesiyle anjiyojenik yanıtın kantitatif ölçümü elde edilebilir.

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Drosophila melanogaster yetişkin sinekleri, konakçı antimikrobiyal doğuştan gelen immün yanıtların ve mikrobiyal enfeksiyon stratejilerinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. D. melanogaster larva aşamasını ek veya alternatif bir model sistem olarak tanıtmak için, bir larva enjeksiyon tekniği tanımlanmıştır.

Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü

Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Burada, son teknoloji ürünü bir robotik enjeksiyon sistemi kullanılarak zebra balığı larvalarına otomatik tümör ksenogreft implantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, sistemin başarılı performansını gösteren enjeksiyon videoları ve doğrulama verileri sunuyoruz.

Kanser Araştırmaları ve Tıbbı için Zebra Balığı Larvalarında Tümör İmplantasyonunun Otomatikleştirilmesi

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Tümör içi immünoterapiye artan ilgi nedeniyle, erişilebilir ve pratik tümör modelleri seçmek çok önemlidir. Deri altı tümörleri oluşturmak kolaydır ancak görselleştirmek ve manipüle etmek zordur. Bu protokolte, daha iyi görünürlük ve erişilebilirlik sağlayan deri içi tümörlerin oluşumu için yöntemleri tanımlıyoruz.

İntradermal Tümör İmperasyonu Olarak Mısır Kanseri İçin Sağlam Bir Model Olarak İntümörlü İmmünoterapi Çalışmaları

Öğrenin, Drosophila melanogaster'de otomatik enjektör kullanarak tümör allotransplantasyonunu nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem, hız, tutarlılık ve verimlilik artışı sağlayarak kanser araştırmalarını kolaylaştırır.

Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogaster'de Tümör Allotransplantasyonu

Daha fazla video keşfet