Kan-Beyin Bariyer Geçirgenliğini Artırmak için Odaklanmış Ultrason ve Mikrobubble Tedavilerini Görselleştirmek için Gerçek Zamanlı Intravital Multifotoğraf Mikroskopisi
5 Şubat 2022
Bu protokol, kan-beyin bariyer geçirgenliğini artırmak için odaklanmış ultrason ve mikrobubble tedavileri sırasında kemirgen beyninin gerçek zamanlı in vivo multifoton floresan görüntülemesini sağlayan cerrahi ve teknik prosedürleri açıklar.
Mikrobubbles varlığında ultrason maruziyeti, kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini geçici ve lokal olarak artırmak için etkili bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Normalde kan-beyin bariyeri birkaç beyin hastalığı için potansiyel ilaçların verilmesini engeller. Sonikasyon üzerine, enjekte edilen mikrobubbles salınmaya başlar ve damar duvarında zorlanmaya neden olur, sıkı kavşaklar açar ve sonunda ilaçların kan-beyin bariyerini geçmesine izin verir Preklinik modellerde, ultrason ve mikrobubble tedavisinin etkisi genellikle kontrastla geliştirilmiş manyetik rezonans görüntüleme veya boya ex vivo'nun ekstravazasyonu ile incelenir.
Bu yaklaşımın dezavantajı, ultrason maruziyeti sırasında ve hemen sonrasında gerçek zamanlı yanıt alınamamasıdır. Beynin intravital multifotoğraf görüntülemesi, bu etkileri gerçek zamanlı olarak inceleme fırsatı verir. Aşağıdaki videoda, kafatasına monte edilmiş bir halka dönüştürücü kullanarak bir fareye kranial pencere yerleştirme ve ultrason mikrobubble tedavisini gerçekleştirme konusunda adım adım talimatlar sunacağız.
Bu yordam eşzamanlı sonikasyon ve in vivo multifotoğraf görüntüleme sağlar. Kranial pencere cerrahisi ve ultrason mikrobubble tedavileri için gerekli malzemeleri hazırlamaya başlamak. Bu videoda akut iyileşme dışı kraniyal pencere ameliyatı gösteriyoruz.
Kronik iyileşme kraniyal pencere cerrahisi için sterilize edilmiş araç ve gereçler, steril bir cerrahi alan ve uygun ilaçlar gereklidir. Ameliyattan önce anestezi ve analjezi uygulanır. Kafadaki kürkü çıkarın.
Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Dektran ve mikrobubble enjeksiyonları için kuyruk damarına bir kateter yerleştirin. Bir ısı kaynağı kullanarak hayvanın 37 derecelik çekirdek sıcaklığını koruyun.
Burada ılık suyla dolu bir eldiven kullanıyoruz. Kafa derisini çıkarmak için, deriyi tostips kullanarak gözlerin arasına kaldırın ve sagittal dikiş boyunca kesin. Kafatasının dış yüzeyini kaplayan periosteumu pamuklu çubukla çıkarın.
Daha sonra kafatasındaki kranial pencerenin istenen yerini işaretleyin ve anahat boyunca delmeye başlayın. Kafatasının delme sırasında aşırı ısınmasını önlemek için, bir şırıngam kullanarak kafatasına salin damlatın veya salin içine batırılmış bir cerrahi sünger parçası uygulayın. Kafatasını delmeye ve soğutmaya göre değiştirin.
Kemik adasına hafif basınç uygulayarak delme ilerlemesini kontrol edin. Bir çift yabanarı kullanarak kemik adayı çıkarın. Salin içinde önceden sulanmış bir cerrahi sünger parçası kullanarak beynin nemli tutulmasını sağlayın.
Kafatası penceresi yerleştirmek için, bir kapak ucunun bir tarafına bir damla salin yerleştirin ve kafatasındaki deliğin üzerinde manevra yap. Kafatasına bağlamak için kapak kapağının çevresine bir tutkal tabakası yayın. Tutkal tamamen kuruduktan sonra, agarose çözeltisini pencereye yatırın ve dönüştürücüsü üzerine yerleştirin.
Transdüser ve kranial pencere arasında minimum agarose olacak şekilde sıkı basınç uygulayın. Agarose Jöle benzeri bir kıvama geldiğinde, dönüştürücünün örtünün çevresinden fazla agaroseyu kesin. Kafatasına yapışmak için dönüştürücünün örtünün çevresine bir tutkal tabakası yayın.
Tutkal tamamen kuruduktan sonra, hayvanı mikroskobun objektif merceği altına yerleştirin. Hedefin dönüştürücü veya kapakla çarpışmamasını sağlayın. Çok sesli mikroskopta bir görüş alanı seçin.
Vaskülatın görüntüleme taramasını yapın ve sonikasyona başlayın. Bu protokol için, 0,82 megahertz sürüş frekansı, mekanik olarak 0,2 ila 0,4 arasında indekslenmiş 10 milisaniyelik döngüler ve bir ila dört Hertz arasındaki darbe tekrarlama frekanslarında çalıştırılan bir halka dönüştürücü kullanıyoruz. Sonovue mikrobubbles kilogram başına bir mililitre dozda enjekte edilir.
Başarılı ultrason mikrobubble tedavileri, floresan dektranın intravaskülerden ekstravasküler alana ekstravazasyonu ile tespit edilebilir ve bu da BBB geçirgenliğinde bir artış olduğunu gösterir. Dektran kaçağı kinetiğini ilaç dağıtımı için temsili bir model olarak değerlendirmek için MATLAB gibi araçlar kullanılarak intra ve ekstravasküler alanlar arasındaki sinyal yoğunluğu değerlendirilebilir. Ultrason mikrobubble tedavileri ile indüklenen damar değişikliklerini değerlendirmek için ultrason mikrobubble tedavisinden önce, ultrason sırasında ve sonrasında ilgi çekici damarın çapı ölçülebilir.
Görüntü analizi ImageJ, FIJI veya programlama araçları gibi yazılımlar kullanılarak yapılabilir. Burada imaris kan damarı segmentasyonu ve sınıflandırılması için kullanılmıştır. Beynin intravital multifotoğraf mikroskopisi, halka dönüştürücülerle birleştiğinde ultrason mikrobubble tedavisinin neden olduğu etkileri gerçek zamanlı olarak yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükte izlemek için bir yöntem sağlar.
Nicel ve nitel veriler, örneğin ekstravazasyon kinetiği ve vasküler değişiklikleri incelemek için elde edilebilir. Burada sunulan deneysel yöntem çeşitli araştırma modellerine ve çeşitli ultrason uygulamalarına uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, odaklanmış ultrason ve mikrobalon tedavileri sırasında kemirgen beyninin gerçek zamanlı in vivo çok fotonlu floresan görüntülemesine yönelik prosedürleri özetlemektedir. Bu teknik, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırarak beyin hastalıkları için ilaç iletimini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyomedikal Mühendisliği
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Ultrason ve mikrobaloncuklar, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini geçici olarak artırabilir.
- Bu yöntem, beyne daha iyi ilaç iletimi sağlar.
- Geleneksel görüntüleme yöntemleri, tedavi sırasındaki gerçek zamanlı yanıtları yakalayamaz.
- İntravital multifoton görüntüleme, gerçek zamanlı gözlem için bir çözüm sunar.
Çalışmanın Amacı
- Eş zamanlı ultrason tedavisi ve çok fotonlu görüntüleme için bir protokol göstermek.
- Kan-beyin bariyeri geçirgenliği değişimlerinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlamak.
- Preklinik modellerde ilaç iletim yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için farelerde kranial pencerenin hazırlanması.
- Ultrasound uygulaması için halka tipi bir transduser kullanımı.
- Görüntüleme için mikro kabarcıklar ve floresan dekstran enjeksiyonu.
- Tedavi sırasında vasküler değişikliklerin gerçek zamanlı görüntülemesi.
Temel Sonuçlar
- Kan-beyin bariyeri geçirgenlik değişikliklerinin başarılı şekilde görüntülenmesi.
- Bir ilaç iletim modeli olarak dekstran sızıntısının kantitatif analizi.
- Ultrason tedavisine karşı vasküler yanıtların gerçek zamanlı izlenmesi.
- Görüntülemede elde edilen yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük.
Sonuçlar
- Protokol, kemirgen beyninin etkili bir şekilde gerçek zamanlı görüntülenmesine olanak tanır.
- Ultrasoy mikrobaloncuk tedavisi, kan-beyin bariyeri boyunca ilaç iletimini artırabilir.
- Bu yöntem, çeşitli araştırma modellerine ve ultrason uygulamalarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Gerçek zamanlı intravital multifoton mikroskopi, odaklanmış ultrason ve mikrobaloncukların tetiklediği kan-beyin bariyeri geçirgenlik değişikliklerinin doğrudan görselleştirilmesine olanak tanıyarak, MSS ilaç iletimindeki kritik bir darboğazı giderir. Bu yaklaşım, vasküler geçirgenlik ve ekstravazasyon kinetiğine dair kantitatif ve dinamik veriler sağlayarak, ultrason aracılı iletim stratejilerinin mekanizmal bazda risklerinin azaltılmasını destekler. Eş zamanlı tedavi ve görüntüleme sunan bu yöntem, preklinik hedef doğrulama ve öncü bileşik optimizasyon iş akışlarında öngörülebilirlik güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Ultrason-mikrokabarcık mekanizmalarının vasküler bütünlük üzerindeki etkilerini in vivo olarak doğrudan gözlemleyerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Sonikasyon parametrelerinin bariyer geçirgenliği sonuçlarıyla gerçek zamanlı korelasyonu aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: BBB modellerinde ilaç iletim verimliliği için bir vekil olarak dekstran sızıntısını nicelleştirerek portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Temel vasküler yanıt profilleri oluşturarak, sonraki bileşik değerlendirmeleri için standartlaştırılmış biyolojik sistemleri hazırlar.
- Kantitatif Çıktılar: Sızıntı kinetiğinin ve vasküler çap değişikliklerinin ölçülmesine olanak tanıyarak, analiz optimizasyonu için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir okumalar sağlar.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Haftalar boyunca tekrarlanan görüntüleme seanslarını destekleyerek, taşıyıcı ajanların tutarlı fizyolojik koşullar altında boylamsal taramasını sağlar.
Translasyonel ve Klinik Öncesi Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Önem: MSS endikasyonları için translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyumlu olarak, preklinik sistemlerde insanla ilgili KKB geçirgenliği zorluklarını modeller.
- Mekanistik Risk Azaltma: Bariyer açılmasının spatiotemporal dinamiklerini netleştirerek, doz-yanıt ve güvenlik değerlendirmelerindeki belirsizliği azaltır.
- Preklinik Süreklilik: Tedavi sırasındaki vasküler değişiklikler hakkında gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü veriler sunarak keşif ve preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken aşama hedef doğrulamadan lider bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olarak, taşıma mekanizması etkinliği hakkında gerçek zamanlı biyofiziksel geri bildirim sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Bozulmamış sinir dokusunda vasküler permeabilite üzerinde ultrason parametrelerinin ve mikrobaloncuk özelliklerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için standartlaştırılmış vasküler erişim ve gerçek zamanlı permeabilite okumaları sunan, analize hazır sistemler sağlar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırmaya ve doz-yanıt modellemesine olanak tanıyan kantitatif dekstran ekstravazasyon ve vasküler morfometri verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: In vivo ilaç dağılımını öngören dinamik BBB yanıtlarını yakalayarak preklinik validasyona bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projede odaklanmış ultrason protokollerinin iteratif olarak geliştirilmesi için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Ultrason aracılı BBB açılmasındaki mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef validasyonundaki öngörüsel güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış kranial pencere, transduser eşleşmesi ve görüntüleme parametreleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: İletim verimliliğine dair doğrudan ve gerçek zamanlı kanıtlar sunarak, geç aşama biyolojik risklerini azaltır ve "devam/dur" kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kantitatif geçirgenlik ve vasküler yanıt metriklerine dayalı olarak, iletim stratejilerinin risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare kraniyal pencere cerrahisi, multifoton mikroskobisi ve ultrason fiziği konularında uzmanlık gerektirir.
- Halka transdüserler, yüksek-NA objektifler ve darbeli lazer tarama mikroskopları dahil olmak üzere özelleşmiş ekipmanlara bağımlıdır.
- Sonikasyon parametrelerinin, kontrast madde dozajının ve görüntü analiz hatlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı hayvan suşları, kraniyal pencere boyutları ve ultrason frekansları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Protokolde belirtildiği üzere, cerrahi iyileşme süreleri ve tekrarlanan kraniyal pencere prosedürlerinden kaynaklanabilecek potansiyel inflamasyon ile sınırlıdır.
