Santral Sinir Sistemi Metastazının Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Kurulması ve Kullanılması

CNS metastazı için yeni tedavilerin geliştirilmesi, iyi preklinik modellerin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Hasta kaynaklı ksenogreft modellerimiz, CNS metastazını tarihsel olarak kullanılan hücre hattı modellerinden daha iyi özetlemektedir. Farklı tümör aşılama yollarını kullanarak, metastatik kaskadın farklı yönlerini inceleyebilirsiniz.

Her rotanın, çalışmanız için yararlanılabilecek avantajları vardır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Ben Yi Tew olacak. Kriyokorunmuş PDX tümörlerinin deri altı yan implantasyonu için, kriyokorunmuş tümör dokusunu 37 santigrat derecelik bir su banyosunda hızla çözün.

Daha sonra, bir doku kültürü kabında beş mililitre DPBS içinde durulayın. Daha sonra, üç ila sekiz haftalık bir dişi NOG faresinde anesteziyi onayladıktan sonra, sol veya sağ kanatta 0,5 ila bir santimetrelik bir kesi yapın ve tümör dokusunun bir 2x2x2 milimetrelik parçasını cebe derinlemesine yerleştirin. Kesi kapattıktan sonra, farenin ambulatuar olana kadar izleme ile anesteziden kurtulmasına izin verin.

Tümör büyümeye başladığında, tümörü haftada üç kez bir kumpas ile ölçün. Uygun deneysel son noktada, bir nekropsi yoluyla metastazları tanımlayın ve histolojik bir analiz yoluyla hedef organ içindeki tümörlerin varlığını doğrulayın. DMEM'deki rezeke PDX tümörünü buz üzerine yerleştirin.

Tümörü bir doku kültürü kabında beş mililitre DPBS'de yıkayın ve varsa nekrotik bölgeleri çıkarın. Tümörü iki ila dört milimetre uzunluğunda küçük parçalara ayırın ve parçaları ayrışma çözeltisi içeren bir tüpe aktarın. Bir Dissosiyatör üzerinde uygun programı kullanarak, dokuyu mekanik olarak ayrıştırın ve elde edilen hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.

Süzgeçten kalan hücreleri yıkamak ve ayrışmış hücre süspansiyonunu santrifüj etmek için 20 mililitre DMEM kullanın. Ardından, hücreleri ve DPBS'yi saymak için yeniden askıya alın ve hücreleri bir ila iki mikrolitre DPBS başına dördüncü hücrelere beş ila 10 kez 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonuna ayarlayın. Cerrahi alanı hazırlamak için, kafa derisini ortaya çıkarmak için farenin kafasındaki kürkü tıraş edin.

Ardından, fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve kulak çubuklarını kullanarak farenin kafasını sıkıca sabitleyin. Ayrıca uygun bir analjezik uyguladığınızdan emin olun. Kafa derisini üç alternatif povidon-iyot ovma ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.

Kafatasını açığa çıkarmak ve kafa derisini geri çekmek için beş ila yedi milimetre uzunlamasına bir kesi yapın. Bregmayı bulmak için periosteumu forseps ile kazıyın. Stereotaktik çerçevenin iğnesini bregma'nın üzerine yerleştirin ve koordinatları sıfırlayın.

Kolu orta çizginin bir milimetre arkasına, bir milimetre yanal olarak hareket ettirin ve bu yeri kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin. Ardından, kafatasında işaretlenmiş yerde küçük bir çapak deliği açın ve beyne girmemeye dikkat edin. Bir ila iki mikrolitre hücreli beş mikrolitre 26 gauge Hamilton şırıngasına yükleyin ve şırıngayı stereotaksik kola takın.

İğneyi yavaşça beyne iki milimetre yerleştirin ve hücreleri istenen oranda enjekte etmeye başlayın. Tüm hücreler teslim edildiğinde, iğneyi yavaşça geri çekin, çapak deliğini kemik mumu ile doldurun ve insizyonu kapatın. Fareyi anesteziden iyileşene kadar izleyerek kafesine geri yerleştirin.

Hayvanı uygun deneysel son noktada ötenazi yaptıktan sonra, histolojik bir analiz yoluyla beyindeki tümörlerin varlığını doğrulayın. PDX tümörlerini intrakardiyak enjeksiyonla implante etmek için, tümör hücrelerini gösterildiği gibi hazırlayın ve anestezi altındaki alıcı fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin. Hayvanın göğsündeki kürkü tıraş edin ve maruz kalan cildi povidon-iyot ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.

Beşinci tümör hücrelerine 0,5 ila 10 kez 10 ve 100 mikrolitreye kadar DPBS'yi 28 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngaya çekin. Enjeksiyon bölgesini sternumun biraz solunda, sternal çentik ile ksifoid süreç arasında yarıya kadar yerleştirin. Ardından, iğneyi enjeksiyon bölgesinde fareye dikey olarak yerleştirin.

Geri akış gözlendiğinde, iğnenin sol ventriküle başarılı bir şekilde girdiğini gösterir, iğneyi hareket ettirmeden tümör süspansiyonunu yavaşça sol ventriküle dağıtın. Tüm hücreler teslim edildiğinde, iğneyi yavaşça ve dikey olarak geri çekin ve kanama durana kadar yaklaşık bir dakika boyunca enjeksiyon bölgesine bir parça steril gazlı bez uygulayın. Farenin gezici olana kadar izleme ile ısıtılmış bir ped üzerinde iyileşmesine izin verin.

Uygun deneysel son noktada, bir nekropsi yoluyla metastazları tanımlayın ve histolojik bir analiz yoluyla hedef organ içindeki tümörlerin varlığını doğrulayın. Tümör mikroortamındaki farklılıklara rağmen, PDX tümörleri, implantasyon bölgesinden bağımsız olarak, küçük çekirdekli ve yetersiz sitoplazmaya sahip hücreleri içeren benzer morfolojiler göstermektedir. Bu analizde, insan melanom hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu, tümör hücrelerinin fare beynine metastazı ile sonuçlanırken, insan küçük hücreli akciğer kanseri tümör hücrelerinin metastazı olan beyin intrakardiyak enjeksiyonu, fare karın boşluğuna ve karaciğere metastaz ile sonuçlandı.

Bu protokoller, yeni tedavileri ve tedavi kombinasyonlarını test etmek için klinik öncesi çalışmaların kurulmasını sağlar ve biyolojik süreçlerin ve tümör metastazlarının incelenmesine yardımcı olabilir.