Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton
25 Şubat 2021
Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.
Spotiton robotik sistemini kullanarak, ilgi çekici bir proteini elektron mikroskop ızgarasında etkileşimde bulunan bir ortakla 90 milisaniye kadar hızlı bir şekilde karıştırabilir ve vitrifiye edebilirsiniz. Bu protokol, standart ızgara hazırlama teknikleri tarafından yakalanamayacak kadar geçici olan ara protein onaylarının yakalanmasını sağlar. Zaman çözüldü Spotiton, membran kanalı aktivasyonu, DNA veya RNA sentezi veya bir ilacın veya antikorun hedef proteini ile erken etkileşimi gibi ikinci biyolojik veya biyokimyasal sistemleri bilgilendirebilir.
Kullanıcı, bir kılavuzun kalitesini doğrudan etkileyen birkaç bileşeni aynı anda yönetmelidir. Izgaraları hazırlarken kullanmadan önce sistemi anlamak ve sabırlı olmak önemlidir. Başlamak için, azot besleme tankındaki ana vanayı açın ve sistem rezervuarın gazdan arındırılmış ultra saf su ile doldurulmasını sağlayın.
Bilgisayarı ve Spotiton sistemini çok çıkışlı güç şeridinde açın. Spotiton yazılımının kullanıcı arayüzünü açmak için masaüstü simgesine tıklayın. Araçlar menüsünde, üç eksenli robotları ve dönen dağıtıcı kafa montajını başlatıp ev sahipliği yapmak için Aşamaları Başlat'ı seçin ve dağıtıcı uçlarının başlatma ve homing'den önce aşağı işaret etmesini sağlayın.
Ana menüde, robotları güvenli konuma göndermek için Güvenli Konuma Git'e tıklayın. Aspirat sekmesinde, dağıtıcı kafalarını rezervuardan gelen suyla birden çok kez yıkamak için Prime'ı seçin. Uçlardan çıkan iki kesintisiz su akışı görülene kadar devam edin.
İncele sekmesinde, muayene kamerasına bir uç gönderin ve ayrı damlacıklar üretilene kadar genliği ayarlayarak ateş suyunu test edin. Bir ucun ateş ederek videosunu kaydetmek için üst kamera monitöründeki Kaydet düğmesine basın. İkinci ipucunu inceleme kamerasına gönder.
Bir ucun sağ taraftaki monitörde ateşlendiği videoyu oynatın, aynı zamanda üst kamera monitöründe iki ucu ateşlenir ve iki dağıtıcıdan damlacık üretim desenine uyar. Birlikte verilen Allen anahtarını kullanarak ızgara robotundaki montajdan cımbızı çıkarın. Yakındaki bir tezgahta, bir test ızgarası nanotel tarafını ızgara bloğunun kenarına yerleştirin.
Izgaranın kenarını dikkatlice tutun ve cımbıza doğru şekilde yerleştirin. Sonra cımbızı yeniden monte edin. Cryo sekmesinde, üst kamera monitöründe Canlı'nın seçilmesini sağlamak için üst dalma yolu kamerasının görüş alanına bir ipucu taşımak için Kameraya İpucu'na tıklayın.
Açın ve üst kamera ışığını ayarlayın. Monitörün içindeki fareyi tıklatarak, üst kamera monitöründe görünen bir ipucu konumlandırın. Izgarayı üst kameranın önüne yerleştirmek için Izgaradan Kameraya tıklayın, ardından gerekirse ucu bir konuma yeniden ayarlayın.
Cryo sekmesinde Vitrified Grid'in seçili olmadığından emin olun, Sıra Hedefi'ne ve ardından Dalma'ya tıklayın. Dağıtıcıların normal çalıştığını onaylamak için üst ve alt görüntüleri değerlendirin. İki numuneyi uygun bir tamponla istediğiniz konsantrasyonlara seyreltin, ideal olarak her ikisi için de aynı şeyi kullanarak kriyojen kabı sıvı nitrojenle doldurun.
Plazma, beş watt hidrojen ve oksijen kullanarak üç ila dört nanotel ızgarasını temizler ve başlangıç noktası olarak 1,5 dakika. Nebülizörü takın ve buharın nebülizör kapağının merkezi bağlantı noktasından çıkışını gözlemleyin. Ana pencerede Canlı Nem Monitörü'ne uyun veya Raporlar ve Ortam altında Ortam Nem İzleyicisi'ni açın.
Oda ve kefen bölgelerindeki nem seviyelerini kontrol edin. Numune bardaklarına her numuneden beş mikrolitre ekleyin. Numune bardaklarını, solda bir, sağda ikinci ipucu için bir örnekle tutma tepsisine yükleyin.
Ardından tepsiyi oturana kadar makineye geri itin. Aspirat sekmesinde, birimin her uç tarafından aspire edilmesi için üç mikrolitre seçin. Numune tepsisinin güvenli bir şekilde oturduğundan emin olun, Aspirat'ı tıklayın ve pipet aşamasının dağıtıcı kafalarını numune kapaklarına hareket ettirdiğini gözlemleyin.
Numune kaplarını çıkararak ve sıvı seviyelerinde bir düşüş gözlemleyerek her iki numunenin de başarılı bir şekilde aspirasyonunun doğrulanması. Denetle sekmesinde, engelsiz dağıtımı onaylamak için her ipucunu inceleme kamerasına gönderin. Her uçtan damlacık oluşumunu eşleştirmek için genliği gerektiği gibi ayarlayın.
Taze plazma temizlenmiş bir ızgarayı cımbıza yükleyin, ancak cımbızı henüz monte etmeyin. Nem seviyesinin yaklaşık% 90 ila 95'e yükseldiğinden emin olun Etan kabını doldurun ve muayene kamerasının önündeki her iki ucun son test ateşini gerçekleştirin, hiçbir engel olmadığını onaylayın. Cryo sekmesinde Kameraya İpucu'na tıklayın.
Etan fincanı kontrol et. Etan buzu oluşmuşsa, ek etan gazı ile gerektiği gibi eritin. Cımbızı ızgara ile ızgara aşamasına monte edin.
Cryo sekmesinde, Izgaradan Kameraya'ya tıklayarak, bir ipucunun üst kamera monitöründe doğru şekilde konumlandırılmasını sağlayın. Vitrified Grid, Queue Target'a tıklayın, sonra Dala. Izgara robotuna ızgarayı etandan sıvı nitrojene atlaması ve su altında kalan rafa bırakması istendiğinde Tamam'ı tıklayın.
Saklanması veya atılması gerekip gerekmeyeceğine karar vermek için ızgaranın görüntülerini inceleyin. Izgarayı tutuyorsanız, önceden soğutulmuş ince uçlu tokmaklar, ızgarayı kenardan hafifçe kavrayın ve çentiğin solundaki ilk yuvadan başlayıp saat yönünde giden bir ızgara kutusu yuvasına yerleştirin. Raporlar ve Deneme'yi seçerek dalma sırasında makine ayarları ve nem ölçümleriyle birlikte üst ve alt kameralardaki ızgara görüntülerini gözden geçirmek ve karşılaştırmak için Deneme Görüntüleyicisi'ni kullanın.
Vitrifikasyondan önce 150 milisaniye boyunca bir promotör dizisi taşıyan 105 baz çift DNA oligomerinde RNA polimeraz karıştırılarak tek bir zaman çözümlenmiş Spotiton seansı sırasında hazırlanan ızgaraların görüntüleri burada gösterilmiştir. Altı ızgaradan sadece biri yetersiz fitillenme gösteriyor. Vitrifiye bir ızgaradaki buz biriktirme deseni, üst kamera görüntüsünde görülen biriken sıvı deseniyle yakından eşleşir.
Karışık numunelerin etkili bir şekilde fitilleme, numunenin nadiren indiği karelere taştığı nanotel kaplı ızgara çubukları boyunca gerçekleşir. Buz dolu karelerde, buz genellikle karenin merkezindeki delikler içinde en kalındır ve ızgara çubuklarına daha yakın deliklerde daha ince hale gelir. Izgara çubuklarına hemen bitişik delikler, nanotellere yakınlık nedeniyle genellikle boştur.
Nanotel ızgaralarının uygun şekilde hazırlanması ve işlenmesi, karışık numune ızgaralarında iyi buz kalınlığı sağlayacaktır. Spotiton sistemi ayrıca kullanıcının iki örneği tek bir ızgaraya ayrı ayrı yatırmasına izin verir ve aynı şebeke bakım oturumu sırasında karıştırılmamış bir denetimin toplanmasını sağlar. Spotiton, bakteri gen ekspresyonunda ilk ara maddelerin gerçek zamanlı olarak yakalanmasını sağlamıştır.
Saniye altı zaman ölçeğinde oluştukları için yapıları şimdiye kadar bilinmiyor.
Genel Bakış
Bu çalışma, elektron mikroskobu ızgarası üzerinde proteinlerin hızlı karıştırılması ve vitrifikasyonu için Spotiton robotik sistemi kullanan bir protokol sunmaktadır. Teknik, standart yöntemlerin yakalayamadığı geçici protein konformasyonlarını yakalar ve dinamik biyolojik süreçlere dair içgörüler için ön ayak oluşturur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Protein etkileşimleri
- Geçici konformasyonlar
- Krio-elektron mikroskobu
Arka Plan
- Hızlı protein etkileşimlerinin incelenmesinin önemi
- Geçici hallerin yakalanmasının zorlukları
- Biyolojik araştırmalarda vitrifikasyonun yararlılığı
Kullanılan Yöntemler
- Numune karıştırma ve vitrifikasyon için Spotiton sisteminin kullanılması
- Uygulama, nanotel ızgaralarında protein ve etkileşime giren ortağı içerir
- Geçici hallerin yakalanması için yüksek hızlı karıştırma
Ana Sonuçlar
- Karışık protein numunelerinin 90 ms kadar kısa sürede başarılı bir şekilde vitrifikasyonu
- Numune bütünlüğünü sağlayan nanotel ızgaralarında etkili sızdırma
- Karıştırma sonuçlarıyla ilişkili buz birikimi desenlerinin net görselleştirilmesi
Sonuçlar
- Bu çalışma, hızlı biyolojik süreçleri gözlemlemenin yanı sıra Zaman-çözümlü Spotiton'un yararlılığını etkili bir şekilde göstermektedir.
- Bulgular, biyolojik araştırmalar için önemli olan protein dinamiği ve etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Capturing transient molecular intermediates is a critical challenge in early-stage drug discovery and structural biology. The Spotiton robotic system enables time-resolved cryo-EM grid preparation, allowing R&D teams to interrogate rapid biomolecular interactions and conformational changes with high temporal precision. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of short-lived protein conformations relevant to target engagement.
- Supports mechanistic de-risking by capturing intermediate states in protein-ligand or protein-nucleic acid interactions.
- Facilitates functional target validation by revealing structural transitions on sub-second timescales.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological grids for downstream cryo-EM analysis with minimal sample volume.
- Standardizes grid preparation for reproducible, quantitative structural readouts.
- Enables rapid, scalable grid production to support high-throughput screening of molecular interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces ambiguity in structure-based drug design by capturing elusive intermediate states.
Pipeline & Workflow Integration
The Spotiton system integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic interrogation with structural validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling capture of rapid molecular events and pathway transitions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cryo-EM grids for comparative analysis of compound or biomolecule effects.
- Analytics: Provides high-resolution structural data to inform condition comparisons and mechanistic hypotheses.
- Translational Research: Connects early structural findings to preclinical validation when disease-relevant systems are studied.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable grid preparation for structural studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing transient states critical to biological function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM grid handling and robotic system operation.
- Needs access to Spotiton instrumentation and compatible nanowire EM grids.
- Demands rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different biomolecular systems or sample types.
- Grid quality is sensitive to humidity control, dispenser calibration, and sample preparation protocols.
