Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu
27 Şubat 2021
Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.
Bu protokol, viral vektörlerin doğrudan, pahalı özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan çoğu laboratuvar ayarında kolayca uygulanabilen mısır tesislerine aşıılmasına izin verir. Doğrudan aşılama, alternatif bir konağın inoculum kaynağı olarak kullanımını ortadan kaldırarak hem zamandan hem de kaynaklardan tasarruf sağlar. Bu yöntem ek viral vektörlere, mısır hatlarına ve potansiyel olarak diğer monokot türlere uygulanabilir.
Tepsilerin içine yerleştirilen küçük kesici uçlarda turba bazlı yetiştirme ortamına 1 ila 2 mısır tohumu ekerek başlayın. Tepsileri 25 santigrat derecede 16 saatin altında bir büyüme odasına ve 22 ila 25 santigrat derecede 8 saat gece veya 16 saat gün ve 8 saat gece ile 22 ila 25 santigrat derecede bir seraya yerleştirin. Düzenli olarak bitkileri sulayın ve haftada bir kez milyon konsantrasyonda 330 parçada 15-5-15 sıvı gübre ile gübreleyin.
LB ortamlarında istenen viral yapıyı içeren agrobakteri suşunu antibiyotiklerle aşılayarak agrobakteriyi enjeksiyona hazırlayın. Ardından, 24 saat boyunca 225 RPM'de sallanırken şişeyi veya tüpleri 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 kez G'de merkezileştirme ile bakterileri peletleyin ve süpernatant atın.
Daha sonra peleni bir mililitre deiyonize su ile yıkayın. Peletin 10 milimoler magnezyum sülfat çözeltisinin bir mililitresinde yeniden askıya alın ve optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün. Ardından 1.0 olarak ayarlayın.
Agrobakteri enjekte etmek için 4 ila 7 günlük mısır fideleri kullanın. Şırıngayı ve iğneyi birleştirin. Bakteri süspansiyonu, coleoptilüler düğümün 2-3 milimetre üzerine, coleoptile'ı doldurana veya bitkilerin büyüme aşamasında bekleyen whorl'da görünene kadar hafifçe enjekte edin.
Tüm fideleri enjekte edin ve her yapıyı enjekte etmek için şırıngayı ve iğneleri değiştirin. Kontrol genlerinin susturılmasından lezyonları gözlemleyerek fenotipik enfeksiyonu onaylayın, lezyon 22'yi taklit eder veya yapraklarda fitoen desaturaz. GFP ekspresyonunun varlığını tespit etmek için bitkilerin hızlı taranmasını ve floresan mikroskopisini görmek için floresan görüntüleme cihazı kullanın.
Enfeksiyonun moleküler tespiti için gen ekspresyon analizi yapın. Enfeksiyondan 14 ila 21 gün sonra enfekte bitkilerin yapraklarından toplam RNA çıkarın ve metin el yazmasında açıklandığı gibi ilk iplikçik cDNA'sını sentezleyin. Enfeksiyonu doğrulamak ve farklı viral yapılar için tasarlanmış belirli astarları kullanarak genin bütünlüğünü veya gen ilgisinin bir parçasını belirlemek için ters transkriptaz PCR gerçekleştirin.
Pcr ürününü, virüs ve gen veya gen parçasının varlığını veya yokluğunu belirlemek için nükleik asit lekesi içeren% 1 agarose jel üzerinde görselleştirin. Bu protokol, gen için tasarlanmış rekombinant virüsleri mısır fidelerine yerleştirmek için kullanıldı. Enjeksiyondan yaklaşık 12 gün sonra, yapraklarda nekroz ve fotobleaching olarak susturma fenotipleri gözlendi.
Enfeksiyon sonrası yapraklarda yapı varlığı, farklı bir GFP filtresi kullanılarak floresan altında yeşil floresan protein ekspresyonu gözlemlenerek tespit edildi. Foxtail mozaik virüs enfekte yapraklarda yeşil floresan protein ifadesi, yapraklara dağılmış küçük floresan delik alanları ve şeker kamışı mozaik virüsü enfekte yapraklarında büyük yamalar olarak görselleştirildi. Gen ekspresyon analizi kullanılarak sistemik foxtail mozaik virüs enfeksiyonu doğrulanmış ve fitoen desaturaz ve lezyon mimik 22'nin gen susturması veya baskılanması gözlenmiştir.
Yapı ayrıca enfeksiyon verimliliğini etkiledi. Foxtail mozaik virüs enfeksiyonu durumunda, foxtail mozaik virüs boş vektör ve foxtail mozaik virüs lezyonu 22 tipik olarak sırasıyla% 53 ve% 54 ile en yüksek enfeksiyon verimliliğine sahipti. Foxtail mozaik virüs fitoene desaturaz %39 ve foxtail mozaik virüs yeşil floresan protein, en düşük verimlilikte %16 ile bu arada şeker kamışı mozaik virüsü yeşil floresan proteininin enfeksiyon verimi %8 zamanlama ve semptomlar kullanılan viral vektör ve mısır hattına dayanacaktır.
Görsel fenotip eksikliği, susturma veya ifade eksikliği anlamına gelmeyebilir. Bu yöntem, kılavuz RNA'lar için teslimat yöntemlerini geliştirerek gen düzenleme teknolojilerine de uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu makale, rekombinant viral vektörlerin mısır fidelerine Agrobacterium aracılı iletimi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, gen susturma ve gen ekspresyon çalışmaları için viral konstrüktların doğrudan inokülasyonuna olanak tanıyarak, alternatif konak bitkilere ve özel ekipmanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. Yaklaşım, foxtail mosaic virus (FoMV) ve sugarcane mosaic virus (SCMV) vektörleri için optimize edilmiştir ve çeşitli mısır genotipleri ile potansiyel olarak diğer tek çenekli türlere uyarlanabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki moleküler biyolojisi
- Bitki virolojisi
- Genetik mühendisliği
Arka Plan
- DNA'nın bitki dokularına aktarılması için Agrobacterium tabanlı yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Viral vektörler, bitkilerde gen susturulmasını ve ekspresyonunu kolaylaştırır.
- Geleneksel inokülasyon genellikle bir virüs kaynağı olarak alternatif bir konakçı gerektirir.
- Doğrudan iletim yöntemleri, bitki genetik çalışmalarında zaman ve kaynak tasarrufu sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Mısır fidelerine viral vektörlerin doğrudan Agrobacterium aracılı iletimi için bir protokol geliştirmek ve optimize etmek.
- FoMV ve SCMV konstrüktlarını kullanarak yöntemin gen susturma ve ekspresyonu üzerindeki etkinliğini göstermek.
- Bitki moleküler araştırmaları için yaygın olarak erişilebilir bir teknik sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Mısır fidelerinin kontrollü koşullarda (büyütme kabini veya sera) yetiştirilmesi.
- pCAMBIA1380 içinde rekombinant viral konstrüktlar taşıyan Agrobacterium tumefaciens GV3101'in hazırlanması.
- Bakteriyel süspansiyonun 4–7 günlük mısır fidelerinin koleoptilar nodu yakınına enjekte edilmesi.
- Fenotipik gözlem (lezyon mimiği 22, fitoen desaturaz susturulması, GFP ekspresyonu) ve RT-PCR ile agaroz jel elektroforezi aracılığıyla moleküler doğrulama.
Ana Sonuçlar
- Rekombinant virüslerin mısır fidelerinde başarılı sistemik enfeksiyonu ve yayılımı.
- Gözlemlenebilir fenotipler: gen susturma için nekroz ve fotobeyazlama, gen ekspresyonu için GFP floresansı.
- Enfeksiyon verimlilikleri konstrükta göre değişiklik gösterdi: FoMV boş vektör ve les22 (%53–54), FoMV pds (%39), FoMV GFP (%16), SCMV GFP (%8).
- RT-PCR, enfekte bitkilerde viral konstrüktların varlığını ve bütünlüğünü doğruladı.
Sonuçlar
- Bu protokol, özel ekipman gerektirmeden viral vektörlerin mısıra verimli ve doğrudan iletimini sağlar.
- Mısırda hem gen susturma hem de ekspresyon çalışmaları için etkilidir.
- Yöntem; diğer viral vektörlere, mısır hatlarına ve potansiyel olarak diğer tek çenekli bitkilere uyarlanabilir ve gen düzenleme uygulamalarını kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Mısır fidelerinin rekombinant viral vektörlerle doğrudan agroinokülasyonu, tek çenekli ürünlerde gen fonksiyonu sorgulamasını ve özellik doğrulamasını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, alternatif konakçılara ve özel ekipmanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırarak erken keşif sürecini hızlandırır ve bitki biyoteknolojisi süreçlerinde hızlı hipotez testine olanak tanır. Yöntem; gen susturma ve ekspresyon çalışmaları için ölçeklenebilir, tekrarlanabilir iş akışlarını destekleyerek, hedef doğrulama ve özellik mühendisliğinde öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Gen susturma veya ekspresyon yapılarının doğrudan iletimi yoluyla hızlı fonksiyonel genomik çalışmalarını mümkün kılar.
- Belirli gen hedefleriyle bağlantılı gözlemlenebilir fenotipik değişiklikler aracılığıyla mekanik risk azaltmayı kolaylaştırır.
- Ürün iyileştirme için özellik seçimi ve hedef önceliklendirmesinde öngörücü güveni destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Gen fonksiyonu veya özellik ekspresyonunun alt akış taramaları için valide edilmiş mısır sistemlerini hazırlar.
- Enfeksiyon ve ekspresyon protokollerini standardize ederek genotipler ve konstrüktler arasındaki tekrarlanabilirliği artırır.
- Güvenilir konstrükt değerlendirmesi için RT-PCR ve floresan görüntüleme yoluyla kantitatif çıktılar üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Gen fonksiyonu çalışmalarını, tek çenekli ürünlerde hastalıkla ilişkili veya agronomik açıdan önemli özelliklerle hizalar.
- Bitki biyoteknolojisi süreçlerinde, erken keşif aşamasından preklinik özellik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Mühendislik ürünü özelliklerin risk ayarlı ilerlemesine ışık tutan mekanistik içgörüler sunar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu doğrudan agroinokülasyon protokolü, bitki özellik mühendisliği ve fonksiyonel genomik için keşiften doğrulamaya kadar uzanan sürece entegre edilmiştir.
- Keşif Biyolojisi: Mısırdaki doğrudan gen susturma veya ekspresyonuna olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Konstrükt karşılaştırması için tekrarlanabilir, kantitatif enfeksiyon ve ekspresyon verileri sağlar.
- Analitikler: Konstrükt varlığını ve fonksiyonel sonuçları doğrulamak için RT-PCR ve floresan okumaları kullanır.
- Translasyonel Araştırma: Erken dönem gen fonksiyonu çalışmalarını, ilgili ürün sistemlerindeki preklinik özellik doğrulamalarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli viral vektörler ve monokot genotipleri için geniş erişimli, uyarlanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gen fonksiyonu çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Özel ekipman veya alternatif konakçılara gerek duymadan gen aktarımını standartlaştırır ve ölçeklendirir.
- Stratejik Değer: Karar verme süreçlerini (go/no-go) hızlandırır ve özellik geliştirme süreçlerinde sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Mühendislik ürünü özelliklerin veya hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Bitki moleküler biyolojisi ve Agrobacterium aracılı transformasyon konularında uzmanlık gerektirir.
- Bitki büyütme, bakteri kültürü ve moleküler analiz için temel laboratuvar altyapısına ihtiyaç duyar.
- Tekrarlanabilirlik için enjeksiyon ve analiz protokollerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile çeşitli mısır genotiplerine ve potansiyel olarak diğer monokot türlere uyarlanabilir.
- Enfeksiyon verimliliği ve fenotip görünürlüğü, konstrükta ve genotipe göre değişiklik gösterebilir, bu durum moleküler onay gerektirir.
