Bağışıklık Hücreleri Tarafından Geçici Piconewton Reseptör Kuvvetlerini Haritalamak için DNA Gerilim Probları
20 Mart 2021
Bu makalede, bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini görüntülemek için DNA tabanlı gerilim problarını kullanmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, reseptör kuvvetlerini gerçek zamanlı olarak >4.7pN'yi haritalayabilir ve zaman içinde kuvvetleri entegre edebilir.
Bu protokol, hücreler ve özellikle bağışıklık hücreleri tarafından üretilen moleküler kuvvetleri haritalamak için bir yöntem sunar. Protokol, mekanobiyolojide mekanotransdüksiyonu incelemek isteyen laboratuvarlar için kritik öneme sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, süper kolay olması ve ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerde kuvvet iletimini ölçmek için geleneksel floresan mikroskobunun kullanılmasına izin vermesidir.
Başlamak için, 25 milimetrelik kapak kaymalarını 50 mililitrelik bir beherdeki bir politetrafloroetilen rafa yerleştirin ve kapakları suya batırarak üç kez durulayın. Eşit miktarda etanol ve suyu karıştırın ve rafı ve kapakları içeren behere bu çözeltiden 40 mililitre ekleyin. Ardından, beheri parafilm bant kullanarak kapatın.
Beheri ultrasonik bir temizleyicide 15 dakika boyunca sonikleştirerek kapak fişlerini temizleyin ve sonikasyondan sonra sıvıyı atın. Ardından, rafı içeren kabı durulayın ve kalan organik çözücüyü çıkarmak için en az altı kez suyla örtün. Taze bir piranha çözeltisi hazırlamak için, 50 mililitrelik bir beher kabına 30 mililitre sülfürik asit ekleyin ve yavaşça 10 mililitre hidrojen peroksit ekleyin.
Bir cam pipetin ucunu kullanarak piranha çözeltisini yavaşça karıştırın. Aşındırmayı başlatmak için, kapak fişlerini tutan rafı piranha çözeltisi içeren beher kabına aktarın ve kapak kaymalarını temizlemek ve hidroksilleştirmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, rafı çelik veya politetrafloroetilen cımbız kullanarak 50 mililitrelik temiz bir behere aktarın ve altı kez suyla durulayın.
Suyu tamamen çıkarmak için, kapakları tutan rafı 40 mililitre etanol içeren 50 mililitrelik bir behere batırın. Ardından, etanol atın. Daha sonra, rafı% 3 aminopropiltrietoksisilan içeren 40 mililitre etanol içine oda sıcaklığında bir saat batırarak kapaklardaki hidroksil grubuyla reaksiyonu başlatın.
Kapakların yüzeyini 40 mililitre etanol içine batırarak altı kez durulayın ve 20 dakika boyunca 80 santigrat derecede bir fırında kurutun. Petri kabının iç tabanını bir parafilm bant ile örtün, böylece kapak kaymalarının Petri kabının içine kaymasını önleyin. Ardından, amin kaplı örtü kaymalarını, DNA gerilim probları yukarı bakacak şekilde işlevselleştirilecek tarafa yerleştirin.
Kapakları ileride kullanmak üzere 20 santigrat derecede örtün. Kapaklardaki amin gruplarını değiştirmek için, lipoik asit PEG NHS ve mPEG NHS ekleyin ve Petri kabını oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, yüzeyi üç kez suyla durulayın.
Bundan sonra, bir dizi sandviç kapağına mililitre başına bir miligram Sulfo-NHS-Asetat içeren 100 mikrolitre 0.1 molar sodyum bikarbonat ekleyin ve pasivasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika inkübe edin. Her bir kapak parçasına 0.5 mililitre altın nanopartikül ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapakları üç kez suyla durulayın.
Tavlanmış DNA gerilim probuna on ila bir oranında Kara Delik Quencher 2 ipliği ekledikten sonra, sandviçi yapmak için iki kapak fişi başına 100 mikrolitre karışım ekleyin. Islak bir laboratuvar mendil topunu Petri kabına dikkatlice örtülerden uzağa yerleştirin ve çözeltinin kurumasını önlemek için kabı parafilm bantla kapatın. Bundan sonra, çanağı bir folyo ile örtün ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, odayı sıkarken yüzey çatlamasını önlemeye özen göstererek görüntüleme odasını monte edin. Ardından, görüntüleme odasına 0,5 ila bir mililitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini ekleyin. Cy3B kanalını, yayılmaya başladıklarında DNA saç tokası gerilim problarına kaplanmış hücrelerin floresan sinyallerini yakalamak için 100X hedefiyle kullanın.
100 mikroMolar floresan olmayan kilitleme ipliği stoğu hazırladıktan sonra, istenen zaman noktasında, gerilim sinyalini depolamak ve pipetleme yoluyla hücrelerle karıştırmak için görüntüleme odasındaki son bir mikroMolar konsantrasyonunda hücrelere ekleyin. Yaklaşık 10 dakikalık kilitlemeden sonra, hem kalitatif gerilim haritalaması hem de kantitatif analiz için epifloresanda hızlandırılmış filmler veya son nokta görüntüleri elde edin. Başarılı bir yüzey soluk pembe bir renge sahipti.
Yüzeyin yüksek kalitesi, temiz bir arka plan ve yansıma girişimi kontrast mikroskobu veya RICM kanalı ve Cy3B kanalında homojen floresan yoğunluğu ile gösterilmiştir. Gerilim kilidinin hızlandırılmış görüntüleri, hem TCR anti-CD3 epsilon hem de TCR-peptid-MHC gerilim sinyallerinin, saç tokası kilitleme ve sinyal birikimi nedeniyle güçlendirildiğini göstermiştir. Kilitleme ipliği, TCR peptid MHCN4'ün sıfır dakikadan başlayarak kısa ömürlü mekanik çekme olaylarını kaydetti, bu da nicel analizi kolaylaştırdı ve TCR peptid MHC kuvvetinin bağışıklık sinapslarının boğa gözü modeline benzeyen farklı modelini ortaya çıkardı.
Her adımda, niyet probu substrat hazırlığınız, malzemelerin ayrıntılarına ve dikkatli bir şekilde kullanılmasına dikkat etmelidir. Bu teknoloji, özellikle antijen arayışındaki bağışıklık hücrelerinde, çevre ile etkileşime girdiğinde hücre yüzeyinde meydana gelen geçici moleküler kuvvetlerin görselleştirilmesini sağlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, bağışıklık hücre reseptörleri tarafından uygulanan kuvvetleri görselleştirmek için DNA bazlı gerilim problarının kullanılması için bir protokol sunar. Bu yöntem, 4,7 pN'den büyük reseptör kuvvetlerinin gerçek zamanlı haritalandırılmasını sağlar ve kuvvet ölçümlerini zamanla entegre eder.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mekanobiyoloji
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Mekanotransdüksiyon çalışması, hücrelerin mekanik uyarımlara nasıl tepki verdiğini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Bağışıklık hücreleri, inflamasyon ve doku onarımı gibi çeşitli biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar.
- Moleküler kuvvetlerin haritalandırılması, hücresel davranış ve etkileşimlere dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu analiz için geleneksel floresan mikroskobu kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bağışıklık hücrelerindeki kuvvetleri ölçmek için basit bir yöntem geliştirmek.
- Hücresel süreçlerde mekanotransdüksiyonun anlaşılmasını geliştirmek.
- Çeşitli laboratuvarlarda kolayca uygulanabilecek bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için kapak camları ve çözeltilerin hazırlanması.
- Kuvvet ölçümü için DNA bazlı gerilim problarının kullanılması.
- Geleneksel floresan mikroskopi tekniklerinin uygulanması.
- Gerçek zamanlı görüntüleme ve zamanla kuvvet entegrasyonu.
Ana Sonuçlar
- Protokol, bağışıklık hücrelerindeki reseptör kuvvetlerini başarılı bir şekilde haritalandırır.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, kuvvet uygulamasının dinamiklerini gösterir.
- 4,7 pN'den büyük kuvvetler etkili bir şekilde ölçülebilir.
- Yöntem, hem ölümsüzleştirilmiş hem de primer hücreler için uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu teknik, hücresel kuvvetleri incelemek için basit ve etkili bir yol sunar.
- Biyoloji'deki mekanotransdüksiyonun daha geniş anlayışına katkıda bulunur.
- Protokol, çeşitli araştırma laboratuvarları tarafından kolayca benimsenebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Mapping transient piconewton-scale receptor forces in immune cells addresses a critical gap in mechanobiology and immunology discovery workflows. The DNA hairpin tension probe platform enables quantification and storage of short-lived mechanical events, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. This capability enhances early-stage portfolio decisions by revealing force-dependent signaling events that are otherwise undetectable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of receptor-mediated mechanotransduction in immune cells.
- Supports functional target validation by quantifying force-dependent signaling events.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing transient, weak, or rare force events.
- Improves predictive confidence for immune receptor pathway selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, force-sensitive substrates for downstream mechanobiology assays.
- Standardizes quantitative readouts of receptor force transmission using fluorescence microscopy.
- Enables reproducible mapping of mechanical events across cell types and conditions.
- Supports scalable screening of compounds affecting cellular force generation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical force mapping with disease-relevant immune cell functions.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mechanotransduction targets.
- Enables risk-adjusted advancement of immune-modulating candidates based on functional force readouts.
- Supports translational biomarker development for force-dependent immune responses.
Pipeline & Workflow Integration
This DNA tension probe method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early mechanistic insights and supporting lead identification for immune-modulating therapies.
- Discovery Biology: Quantifies and stores transient receptor forces to clarify immune signaling pathways.
- Screening: Provides standardized, quantitative force readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers fluorescence-based measurements for comparative analysis of mechanical events.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping force-dependent immune functions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mechanotransduction studies across diverse cell types and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell signaling.
- Operational Value: Standardizes force mapping with accessible fluorescence microscopy and robust probe design.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of immune targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and surface chemistry for probe preparation.
- Needs access to imaging infrastructure and quantitative analysis tools.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible force measurements.
- Adaptable to various immune and non-immune cell models with protocol optimization.
- Transient force storage and erasure depend on precise timing and probe handling.
