Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.

Büyük ölçekli bir veri toplama oturumunun kurulumu, eğim serisi alımı için mevcut kalan mikroskop süresini önemli ölçüde azaltabilen zaman alıcı bir yordamdır. Bu yöntem, dikkatli bir toplama hedefi seçimi gerektiren tomografi deneylerinin zaman verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için büyük ölçekli otomatik tomografi veri alımının hızlı bir şekilde kurulumunu sağlar. Sahte bir SerialEM örneği açarak başlayın.

İlk kılavuz karesi eşlendikten sonra, sahte SerialEM örneğindeki montajı görmek için SerialEM gezgin menüsü menü birleştirmeyi kullanın. Kılavuz kare haritasını açmak için gezgin penceresini çift tıklatın. Haritayı arayın ve ilgi çekici hedefe görüntü alma noktaları eklemek için sahte SerialEM gezgin seçeneğini kullanın.

Yeni kareleri eşledikten sonra, gezgin dosyasını kaydedin ve gezgini yeniden birleştirin. Tüm ızgara kareleri eşlenene kadar devam edin. Yine, gezgin dosyasını sahte SerialEM örneğiyle birleştirin.

Pi EM sanal haritalar komut dosyasını sahte SerialEM menüsünden çalıştırın. Araçları seçin ve sanal bağlantı haritalarını seçin. Bu, ızgara kare haritalarının boyutuna ve miktarına ve görünüm ve önizleme haritalarının binning'ine bağlı olarak biraz zaman alabilir.

Uygun mikroskop performansını sağlamak için, veri toplama için aşağıdaki sırayla aynı büyütme ve ışın boyutu kurulumunu kullanın. CTF tarafından SerialEM koma içermeyen hizalamayı çalıştırın.

CTF ve GIF hızlı ayarı ile SerialEM doğru astigmatizma çalıştırın. SerialEM'de yeni gezgin dosyasını açın. Tüm A noktalarının seçimi silin.

İlk görünüm haritalarını seçin. Daralt'ı seçin. A'ya iki kez tıklayın ve daralt'ı seçin.

İlk görünüm eşleme konumunu seçin. T Kaydır'a basın, sonra son görünüm eşleme konumunu seçin ve T Kaydır'a tekrar basın. İletişim kutusunu açmak için dosyanın özelliklerinde tek kare görüntüler seçin.

Bir sonraki dosya özellikleri iletişim kutusunda, görüntüleme gereksinimlerine ve cihaz kurulumuna göre istediğiniz parametreleri seçin. İstendiğinde, bir numara içeren bir ad verin ve kaydet'e tıklayın. Eğim serisi denetleyicisini ilk TS konumu için ayarlayın.

Bittiğinde, bu alma öğesinden sonraki tüm eğim serileri için bu parametreleri ayarlamak üzere Tamam'ı tıklatın. Tüm önizleme eşlemeleri artık numaralı bir dosya adıyla TS olarak seçilir. Gerekirse, her hedef için odak/izleme mesafesini ayarlayın.

Yüklemek için görünüm haritasını çift tıklatın. Gezgin listesinde önizleme eşlemesini seçin. Ardından gezgin penceresinde odağı düzenle'yi seçin.

Düşük doz kontrol panelinde, denemeyi konumlandırmak ve sahne eğim ekseni boyunca odaklanmak için alanlar arası ekseni döndür'ü seçin. Bu eğim serisinin odak deneme konumunu ayarlamak ve gezgin öğesinin TSP kümesine sahip olduğundan emin olmak için yüklü görünüm haritasında istenen bölgeye tıklayın. Tüm öğeler için yordamı yineleyin.

Her eğim serisinden önce çalışan PreTomo komut dosyasındaki odak aralığını düzenleyin. SerialEM eğim serisi menüsünde, TS'de çalıştırma komut dosyasını kontrol edin ve her eğim sırasında DuringTomo komut dosyasının komut dosyası numarasını seçin. Azot tankı seviyesini ve otomatik yükleyici turbosuzun seçili olup olmadığını kontrol edin.

Veri depolama alanı boş alanını denetleyin. SerialEM dosya menüsünde, günlük dosyası için sürekli kaydetme seçeneğinin önünden gidin. Her eğim serisi kendi günlük dosyasına sahip olacaktır.

Gezinti menüsündeki öğelerde acquire'e tıkla'ya tıkladan PreTomo komut dosyasını çalıştırın. Birincil görev alma eğim serisini seçin, sonra PostTomo'dan sonra komut dosyası çalıştır'ı seçin. Sonunda sütun vanalarını kapat'ı seçin ve sonunda e-posta gönderin, ardından git'e tıklayın.

Daha düşük büyütmede ızgara haritasında 71 uygun kare seçildi. Orta büyütme haritaları, bu durumda ilgi örneğinin, koronavirüslerin doğrudan görselleştirilmesine ve tanımlanmasına izin veren ayarlarla elde edilmiştir. Edinme süresi kare başına üç dakika, toplamda üç saat ve 45 dakika idi.

İlk kare harita oluşturulurken, kare haritayı görselleştirmek ve eğim serisi alımına uygun hedeflere puan eklemek için ayrı bir bilgisayarda sahte bir SerialEM örneği açıldı. SerialEM düşük doz kuruldu ve referans görünümü ve önizleme görüntüleri alındı ve harita olarak kaydedildi. İkinci haritalar daha sonra ilgili kare harita görüntülerinden sanal görünüm ve sanal önizleme oluşturmak için kukla SerialEM örneğinde hemen kullanılabilir.

Sanal görünüm haritaları, hedefin ilk ortalama için kullanıldı ve ardından sanal önizleme eşlemi kullanılarak gerçek eğim serisi edinme büyütmesinde gerçekleştirilen son bir merkezleme yapıldı. Kullanıcılar örnek manzarayı keşfetmek için kendilerine bolca zaman vermelidir. Bazı haritaları aradıktan sonra, veri toplamak için kaliteli alanlar için daha iyi bir his geliştirir.