Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması
31 Mart 2021
Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.
Bu protokol, iyi karakterize edilmiş bir insan hemojenik endotel hücresi popülasyonu oluşturmak için bir yöntemi detaylandırır. Bu hücreler moleküler regülasyonu ve endotelyal-hematopoetik geçişi incelemek için kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücrelerini ilkel endotel hücrelerine ayırmak için dört gün boyunca kültürleyerek başlayın.
Beşinci günde, hücrelerin üzerindeki ortamı aspire edin. Daha sonra hücreleri kuyucuk başına bir mililitre DMEM / F-12 ile nazikçe yıkayın. Kuyu başına bir mililitre taze hazırlanmış hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca inkübe edin.
Altıncı gün ve yedinci günde, hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına bir mililitre taze hazırlanmış homojen endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Sekizinci günde. Hücreleri ayırdıktan ve yıkadıktan sonra, her biri mililitre başına 5. hücrelere 1 çarpı 10 ila 5. hücre yoğunluğunda en az 600 mikrolitre hücre içeren buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün.
Hücreleri içeren tüplere uygun şekilde antikorlar ekleyin ve 30 dakika boyunca ışıktan korunan buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 1000 kez G ve 4 santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 600 mikrolitre buz gibi soğuk ayıklama tamponunda yeniden askıya alın.
Numuneleri beş mililitrelik FACS tüplerinin ağ filtre kapağından süzün ve hücreleri anında hücre sıralamak için ışıktan korunan buz üzerinde saklayın. Hemojenik endotel hücrelerini FACS ile izole etmek için, önce CD45-negatif hücre popülasyonunu kapıya verin. Daha sonra CD45-negatif popülasyon içinde, CD31-pozitif hücreleri kapı.
Daha sonra CD31-pozitif popülasyon içinde, VE-kadherin-negatif hücre popülasyonu için kapı. Ve sonra VE-kadherin-negatif popülasyonda, c-Kit-pozitif hücreler için kapı. C-Kit-pozitif popülasyondan, CD34-pozitif hücre popülasyonunu kapılayın.
Ve son olarak, CD34-pozitif hücre popülasyonundan, KDR-pozitif hücreleri tanımlayın ve toplayın. Hematopoetik Progenitör Hücrelerin büyümesi için formüle edilmiş Metilselüloz bazlı bir ortamda hemojenik endotel hücreleri tohumlandıktan sonra, sekizinci günde Koloni Oluşturan Birim-Eritroid koloniler ve Patlama Oluşturan Birim-Eritroid koloniler sayılır. Koloni Oluşturan Birim-Granülosit-Makrofaj ve Koloni Oluşturan Birim-Granülosit, Eritroid, Makrofaj ve Megakaryosit.
Multipotent hematopoetik progenitör koloniler 14. günde sayılır. Kaplanan 1000 hemojenik endotel hücresi başına yaklaşık 20 koloni oluşturan birim üretilir. Endotel hücre morfolojisine sahip hücreler kültürlerde de görülebilir.
Bunlar, tek hücre düzeyinde multilineage hematopoetik progenitörlere yol açan hemojenik endotel hücreleridir. Bu protokol, yaklaşık bir hafta içinde insan hemojenik endotel hücreleri üretebilen 2D serum ve murin besleyici içermeyen bir kültür sistemidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, yaklaşık 1 hafta içinde insan pluripotent kök hücrelerinden insan hemojenik endotel hücrelerinin karakterize edilmiş bir popülasyonunu oluşturma yöntemini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu hücreler, moleküler düzenleme ve endotel-hematopoetik geçişini incelemek için kullanılabilir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Farklılaşması
- Kök Hücre Biyolojisi
- Hematopoez
Arka Plan
- İnsan pluripotent kök hücreleri çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir.
- Hemojenik endotel hücreleri kan oluşumunda önemli bir rol oynar.
- Bu hücrelerin farklılaşmasının anlaşılması rejeneratif tıp için hayati öneme sahiptir.
- Bu protokol, bu hücrelerin oluşturulması için düzenli bir yaklaşım sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Hemojenik endotel hücrelerini farklılaştırmak için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Endotel-hematopoetik geçiş üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
- Hematopoezdeki moleküler mekanizmaları incelemek için bir kaynak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Dört gün boyunca insan embriyonik kök hücrelerinin kültürü.
- Hücrelerin DMEM/F-12 ortamı ile yıkanması.
- Hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamının eklenmesi.
- Hücrelerin 24 saat boyunca 37 derece Celsius ve %5 karbon dioksit ortamında inkübasyonu.
Ana Sonuçlar
- Hemojenik endotel hücrelerinin başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Farklılaşmış hücre popülasyonunun karakterizasyonu.
- Hematopoezin moleküler düzenlemesi hakkında bilgiler.
- Rejeneratif tıp ve hastalık modellemesinde olası uygulamalar.
Sonuçlar
- Bu protokol, hemojenik endotel hücrelerini oluşturmak için basit bir yaklaşım sunar.
- Kan hücresi gelişimi üzerinde daha fazla araştırma için yeni yollar açar.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemi kullanarak çeşitli hematopoietik bozuklukları araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells addresses a critical bottleneck in modeling hematopoietic development and generating blood lineages ex vivo. This capability enables mechanistic de-risking of endothelial-to-hematopoietic transition and supports predictive confidence in early-stage cell therapy and regenerative medicine pipelines. The protocol's feeder-free, serum-free design enhances reproducibility and scalability for enterprise R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular pathways governing endothelial-to-hematopoietic transition.
- Supports functional target validation for factors influencing blood lineage specification.
- Facilitates predictive de-risking of candidate targets in hematopoietic development.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, well-characterized cell population for downstream functional assays.
- Enables quantitative assessment of hematopoietic colony formation from defined progenitors.
- Supports reproducible screening of modulators affecting endothelial or hematopoietic fate.
Translational & Preclinical Research
- Establishes a platform for modeling disease-relevant hematopoietic defects in vitro.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of blood cell generation strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust generation and isolation of hemogenic endothelial cells for mechanistic studies and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on molecular regulation of blood lineage emergence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative colony-forming outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based gating and colony quantification for objective readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical evaluation of hematopoietic potential.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, feeder-free system adaptable across stem cell lines and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hematopoietic lineage modeling and target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell differentiation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for cell therapy and regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of early-stage cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and differentiation protocols.
- Demands access to flow cytometry instrumentation for multi-parameter cell sorting.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and colony quantification.
- Adaptable to various human stem cell lines with protocol optimization.
- Dependent on validated antibody panels and methylcellulose-based functional assays.
