Name: Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinden hemojenik endotel hücrelerinin yönlendirilmiş farklılaşma protokolünü. Bu yöntem, endotelden hematopoietik geçişi in vitro çalışmak ve rejeneratif tıpta kan ürünü üretimi için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen NIH hibeleri HL128064 ve U2EB017103 tarafından desteklenmiştir. CT Innovations 15-RMB-YALE-04 hibesi ile daha fazla destek sağlanmıştır.

<ol><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li>
<li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHBV%2Fbioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li>
<li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature%3A+An+essential+component+for+organ-on-chip+systems%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems.</a> MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).</li>
<li>Gritz, E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).</li>
<li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+Methods%2C+considerations%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li>
<li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+endothelial+cells+in+scalable+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).</li>
<li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lancet+Commission%3A+Stem+cells+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine.</a> The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li>
<li>Fox, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differentiated+pluripotent+stem+cells+in+replacement+therapy+for+treating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease.</a> Science. 345 (6199), 1247391(2014).</li>
<li>Mahla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li>
<li>Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+obstacles%2C+and+limitations+in+the+use+of+stem+cells+in+organ-on-a-chip+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).</li>
<li>Ramme, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+four-organ-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip.</a> Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-Chip%3A+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li>
<li>Kane, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+by+directed+differentiation%3A+analysis+of+microrna+and+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).</li>
<li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+fully+defined+medium+enables+identification+of+lysophosphatidic+acid+and+platelet+activating+factor+as+regulators+of+eNOS+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).</li>
<li>Nguyen, M. T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+endothelial+progenitor+cells+on+laminins+in+defined+and+xeno-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).</li>
<li>Ikuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+differentiation+of+endothelial+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+lineage+control+with+VEGF+and+cyclic+AMP%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.</a> PLOS One. 12 (3), 0173271(2017).</li>
<li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+and+purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells+and+expansion+with+the+use+of+inhibitors+of+ROCK%2C+TGF-B%2C+and+GSK3B%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B.</a> Heliyon. 6 (3), 03493(2020).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKusuma%2C+S+%22Human+Embryonic+Stem+Cell+Protocols%22">Human Embryonic Stem Cell Protocols</a>. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).</li>
<li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li>
<li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200(2019).</li>
<li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+specification+of+pluripotent+stem+cell+derived+endothelial+cells+toward+arterial+and+venous+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143(2019).</li>
<li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communications. 8 (1), 2149(2017).</li>
<li>Dalton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+cell+cycle+to+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linking the cell cycle to cell fate decisions.</a> Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).</li>
<li>Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+arteries%2C+veins%2C+and+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).</li>
<li>Rocha, S. F., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+differentiation+and+specialization+of+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Molecular differentiation and specialization of vascular beds.</a> Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).</li>
<li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li>
<li>Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+is+essential+for+embryonic+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development.</a> Cell. 155 (1), 215-227 (2013).</li>
<li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-kit%2C+notch+signaling%2C+and+p27-mediated+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li>
<li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8 (1), 14361(2017).</li>
<li>Ottersbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-haematopoietic+transition%3A+an+update+on+the+process+of+making+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).</li>
<li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li>
<li>Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+promotes+endothelial+cell+cycle+early+g1+state+to+enable+human+hemogenic+endothelial+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification.</a> Cell Reports. 33 (9), 108465(2020).</li>
<li>Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+arterial+and+venous+endothelial+cells+under+feeder-+and+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261(2015).</li>
<li>Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+feeder-+and+xeno-free+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823(2019).</li>
<li>Galat, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-free+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+efficiently+produces+hemogenic+endothelium+with+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67(2017).</li>
<li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, murin besleyici ve serumsuz 2D kültür sistemi kullanılarak yaklaşık 1 hafta içinde insan embriyonik kök hücrelerinden hemojenik endotel hücrelerinin üretilmesi için adımlar özetlenmiştir (Şekil 1). Bu protokol, ilkel ECs38'i elde etmek için Sriram et al. (2015) tarafından açıklanan bir yöntem üzerinde genişlemektedir. CD31 + CD45- ECs'nin ilkel doğası ve spesifikasyon potansiyeli, bu hücrelerin DLL4 kaplı plakalarda kültürlenmesi ve arter...

Endotel hücreleri (ECs), insan vücudunda ve mühendislik dokularında birden fazla işlevi yerine getiren heterojen bir hücre popülasyonudur. Diğer hücre tiplerini (yani, kardiyomiyositler1, osteoblastik hücreler2) desteklemeye ve düzenlemeye ek olarak, bu işlevler kan ve dokular arasında seçici bir bariyer oluşturmayı ve doku oluşumuna yardımcı olmayı içerir3. Normal gelişim sırasında olgun EC'lerin farklılaşması, çeşitli sinyal yolları gerektirir. Primordial EC'ler mezoderm progenitörlerinden türetilir ve daha sonra olgun arteriyel, venöz, kılcal ve lenfatik fenotiplere doğru belirtilir4. Ek olarak, ekstraembriyonik yumurta sarısı kesesi ve embriyonik Aort-Gonad-Mesonephros (AGM) bölgesindeki EC'lerin küçük bir alt kümesinin, fetal karaciğere ve fetal kemik iliğine göç eden, doğum sonrası kaldıkları ve yaşam boyunca tüm kan hücresi tiplerini ürettikleri hematopoetik kök ve progenitör hücrelere (HSPC'ler) yol açan hemojenik EC'ler haline geldiği belirtilmektedir4. EC fenotiplerinin çeşitliliği tüm doku gelişimi ve bakımı için gereklidir.
Bu nedenle, EC'ler ve türevleri, insan gelişimi ve / veya hastalığının mekanizmalarının modellenmesi ve aydınlatılmasının yanı sıra rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamalarının modellenmesi ve aydınlatılmasını amaçlayan çalışmaların kritik bileşenleridir 5,6,7,8. Bununla birlikte, bu tür çalışmalar için ana sınırlama, birincil insan EC'lerinin gerekli miktarda bulunmamasıdır. Terapötik uygulamaların çoğunluğu için en az 3 x 108 EC'nin gerekli olacağı tahmin edilmektedir6. Bu sorunu çözmek için, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) kullanımı, çeşitli soy potansiyelleri ve çok sayıda soy üretme yetenekleri nedeniyle önerilmiştir 6,9.
Gerçekten de, hESC'lerden veya hiPSC'lerden türetilen hücrelerin yararlılığı, hastalık modellemesi ve ilaç taramasına odaklanan birçok çalışmada gösterilmiştir10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) teknolojisi, hücreleri ve dokuları üç boyutlu iskelelere entegre ederek insan vücudunun fizyolojisini daha sadık bir şekilde özetlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, birden fazla bireysel OOC'nin (vücut veya çip üzerinde insan, BOC / HOC olarak adlandırılan) bağlantısı,13,14,15 ilgili organlar arasında çapraz konuşmaya izin vermek için mikroakışkanlar aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Vaskülatür gibi destekleyici dokular, OOC'lerin ve BOC / HOC'lerin kritik bileşenleridir; vaskülatür dahil etmek, besinlerin, oksijenin ve parakrin faktörlerin dokular boyunca taşınmasına izin verir, böylece gerekli dokuya özgü mikro ortamı teşvik eder 3,12. Bu nedenle, arteriyel, venöz, lenfatik ve hemojenik EC'ler gibi olgun insan EC'lerini türetme yöntemleri, bu doku mühendisliği yaklaşımlarını ilerletmek için çok önemlidir.
İnsan ilkel veya progenitör EC'lerinin hESC'lerden veya hiPSC'lerden türetilmesi için adımları detaylandıran birden fazla protokol yayınlanmıştır5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Bu protokollerin çoğu, embriyoid cisim (EB) oluşumuna veya stromal hücrelerin murin besleyici tabakası ile ESC'lerin / iPSC'lerin ortak kültürüne dayanır. Bu stratejiler, düşük EC verimi ve / veya insan EC'lerinin murin hücreleri ile kontaminasyonu ile zor ve zaman alıcı olma eğilimindedir. Stromal hücrelerin kullanımı olmadan kesinlikle 2D kültüre dayanan protokoller genellikle uzun indüksiyonlar gerektirir, indüksiyon için büyüme faktörlerinin ve / veya inhibitörlerin karmaşık kombinasyonlarını kullanır, hücre ayrılmasını takiben genleşme sürelerini uzatır veya bu faktörlerin bir kombinasyonuna sahiptir. Sinyal yolları ve olgun EC tiplerinin in vivo türetilmesinde rol oynayan faktörler hakkında bilgi edinmek, basit ve sağlam bir in vitro farklılaşma protokolü için zemin hazırlar.
Daha önce, geliştirme sırasında sırasıyla murin arteriyel ve hemojenik ECs'nin spesifikasyonunda Çentik ve Retinoik Asit (RA) sinyal yolakları için anahtar roller tanımlanmıştır. Çentik sinyal yolu, arteriyel EC fenotipinin spesifikasyonunda ve korunmasında birçok rol oynar. Murin retinal vaskülarizasyon modelini kullanarak yapılan çalışmalar, sıvı kesme stresinin bir Çentik-Cx37-p27 sinyal eksenini indüklediği ve arteriyel EC spesifikasyonunu sağlayan G1 hücre döngüsü durmasını teşvik eden bir yol tanımladı27. Hücre döngüsü durumlarının, hücrelerin gen ekspresyonunu ve fenotipik değişiklikleri indükleyebilecek belirli sinyallere alıcı olduğu farklı fırsat pencereleri sağlayarak hücre kaderi kararlarında rol oynadığı varsayılmıştır28. Bu Çentik aracılı G1 tutuklaması, ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 ve Notch 4 (29,30'da gözden geçirildi) dahil olmak üzere arteriyel EC'lerde zenginleştirilmiş genlerin ekspresyonunu sağladı. Ayrıca, hemojenik EC spesifikasyonunun RA sinyali31,32 aracılığıyla in vivo olarak desteklendiği gösterilmiştir. Ek çalışmalar, RA sinyallemesinin aşağı akışında, c-Kit ve Notch ekspresyonunun, murin yumurta sarısı kesesinde ve AGM33'te hemojenik spesifikasyonu sağlayan p27'yi yukarı regüle ettiğini tespit etmiştir. Murin hemojenik ECs, hem endotel (yani CD31, KDR) hem de hematopoetik (yani, c-Kit, CD34) belirteçlerin ekspresyonu ile minimal olarak tanımlanabilir4. Son olarak, hemojenik EC'ler, HSPC'leri oluşturmak için endotelyal-hematopoetik geçişe (EHT) uğrar ve bu da tüm kan hücresi tiplerine yol açabilir 4,34,35.
Son çalışmalar, aynı sinyal hiyerarşisinin insan hemojenik EC spesifikasyonunu destekleyip destekleyemeyeceğini test etti. Bunu yapmak için, hESC'lerden hemojenik ECs türetmek için serum ve besleyicisiz bir 2D kültür protokolü geliştirildi ve bu hemojenik EC'ler tek hücre seviyesinde CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Kadherin-CD45- olarak karakterize edildi. Bu çalışma ayrıca, FUCCI muhabir yapısını (H9-FUCCI-hESC) ifade eden H9-hESC'leri kullanarak, farklı hücre döngüsü durumlarını tanımlayan Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) raporlayıcısından da yararlanmıştır. Bu hücrelerle yapılan çalışmalarda, RA'nın ECs'de erken G1 hücre döngüsü tutuklamasını teşvik ettiği ve erken G1 durumunun in vitro37'de hemojenik spesifikasyonu sağladığı gösterilmiştir. Burada, bu insan hemojenik endotel hücrelerinin farklılaşması için ayrıntılı bir protokol ve kimliklerini doğrulayan tahliller sunulmaktadır. Bu basit yöntem, insan kan hücresi gelişimi mekanizmalarının gelecekteki çalışmaları için ECS'nin bu özel alt kümesini oluşturmak için yararlı bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>15 cm'lik tabaklar</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>doku kültürü ile tedavi edilmiş</td></tr><tr><td>35 mm'lik tabaklar</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>doku kültürü ile muamele edilmiş</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>doku kültürü ile tedavi edildi</td></tr><tr><td>Antimikrobiyal reaktif Marka Adı: Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D sistemleri</td><td>233-FB-025</td>, <td>50 ng/mL'de</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>kullanımı 25 ng/mL'de kullanım</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Ayrıştırma Solüsyonu Marka Adı: Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R& D sistemleri</td><td>1506-D4/CF</td><td>rekombinant insan; 10 & mu'da kullanın; g / mL</td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme ortamı Marka Adı: EGM-2 Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 BulletKit (EGM-2)</td> <td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>polistiren yuvarlak alt filtre kapaklı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>4 & mu'da kullanılır; g/cm2</sup</td></tr><tr><td>>GSK3i/CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td>10 mM stok; 5 & mu'da kullanın; M</td></tr><tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Matriks proteini&nbsp; Marka Adı: Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Büyüme faktörü azaltıldı. Protein (Matrigel) konsantrasyonunu belirlemek için parti için Analiz Sertifikasına bakın. Bu konsantrasyon, 1 mg protein içeren Matrigel hacmini hesaplamak için gereklidir.</td></tr><tr><td>Metilselüloz bazlı ortam Marka Adı: MethoCult H4435 Zenginleştirilmiş</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotent kök hücre farklılaşma ortamı Marka Adı: STEMdiff APEL 2</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotent kök hücreler: H1, H9, H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td> <td>insan; H9-FUCCI, Dr. Ludovic Vallier'in Cambridge Kök Hücre Enstitüsü'ndeki laboratuvarından elde edildi</td></tr><tr><td>Proteinsiz Hibridoma Ortamı (PFMH)</td> <td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50mg</td><td>0.5 & mu'da kullanım; M</td></tr><tr><td>Ters transkripsiyon ana karışımı Marka Adı: iScript Ters Transkripsiyon Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon kiti Marka Adı: RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit (NaOH)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Kök hücre büyüme ortamı Marka Adı: mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green master mix Marka Adı: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25299956</td><td>%0.25</td></tr> <tr><td>VEGF165 (VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>50 ng/mL&</td></tr><tr><td>alfa;-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu'da kullanım; g/mL*</td></tr><tr><td>&alfa;-CD34-Pasifik Mavisi</td><td>BioLegend</td><td>343512</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alfa;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alfa;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alfa;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alfa;-VE-Cadherin-PE</td><td>BioLegend</td><td>348506</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>* Antikor floresan konjugatları, kullanılan hücre sıralayıcıya göre optimize edilmelidir. Burada, bu çalışmada kullanılan son konsantrasyonlar sunulmuştur.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hemojenik endotel hücrelerinin İnsan pluripotent kök hücrelerinden yönlendirilmiş farklılaşması

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Kan damarları vücudun tüm dokularında her yerde dağılır ve çeşitli işlevleri yerine getirir. Bu nedenle, kan damarı lümenlerini hizalayan olgun vasküler endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden türetilmesi, çok sayıda doku mühendisliği ve rejenerasyon uygulaması için çok önemlidir. İn vivo, primordiyal endotel hücreleri mezodermal soydan türetilir ve arteriyel, venöz, kılcal, hemojenik ve lenfatik dahil olmak üzere spesifik alt tiplere doğru belirtilir. Hemojenik endotel hücreleri özellikle ilgi çekicidir, çünkü gelişim sırasında, hematopoetik kök ve progenitör hücrelere yol açarlar ve bu da yaşam boyunca tüm kan soylarını üretir. Bu nedenle, in vitro hemojenik endotel hücreleri üretmek için bir sistem oluşturmak, endotelyal-hematopoetik geçişi incelemek için bir fırsat sağlayacaktır ve insan kan ürünlerinin ex vivo üretimine ve insan donörlerine olan bağımlılığın azalmasına neden olabilir. Progenitör ve primordiyal endotel hücrelerinin türetilmesi için çeşitli protokoller mevcut olsa da, insan kök hücrelerinden iyi karakterize edilmiş hemojenik endotel hücrelerinin üretimi tanımlanmamıştır. Burada, hemojenik endotel hücrelerinin insan embriyonik kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde türetilmesi için bir yöntem sunulmaktadır: GSK3β inhibitörüne (CHIR99021) yanıt olarak oluşan ilkel çizgi hücrelerle bir farklılaşma protokolü, daha sonra bFGF'nin aracılık ettiği mezoderm soy indüksiyonu, ardından BMP4 ve VEGF-A tarafından teşvik edilen ilkel endotel hücre gelişimi ve son olarak retinoik asit tarafından indüklenen hemojenik endotel hücre spesifikasyonu. Bu protokol, moleküler regülasyonlarını ve endotelyal-hematopoetik geçişlerini daha iyi anlamak için kullanılabilecek iyi tanımlanmış bir hemojenik endotel hücresi popülasyonu verir ve bu da aşağı akış terapötik uygulamalarına uygulanma potansiyeline sahiptir.

hESC'lerden ilkel EC'lerin ve hemojenik EC'lerin özelliklerini özetleyen bir şematik ve kaplamadan 24 saat sonra hücrelerin temsili bir görüntüsü Şekil 1'de gösterilmiştir. Spesifikasyona uygun olarak, ilkel EC'ler ve hemojenik EC'ler sırasıyla 5. ve 8. günlerde saflaştırılır. İlkel EC'ler CD31+ CD45- ve hemojenik EC'ler CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- olarak tanımlanır. İlkel EC'ler ve hemojen...

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Bu protokol, iyi karakterize edilmiş bir insan hemojenik endotel hücresi popülasyonu oluşturmak için bir yöntemi detaylandırır. Bu hücreler moleküler regülasyonu ve endotelyal-hematopoetik geçişi incelemek için kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücrelerini ilkel endotel hücrelerine ayırmak için dört gün boyunca kültürleyerek başlayın.Beşinci günde, hücrelerin üzerindeki ortamı aspire edin. Daha sonra hücreleri kuyucuk başına bir mililitre DMEM / F-12 ile nazikçe yıkayın. Kuyu başına bir mililitre taze hazırlanmış hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca inkübe edin.Altıncı gün ve yedinci günde, hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına bir mililitre taze hazırlanmış homojen endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Sekizinci günde. Hücreleri ayırdıktan ve yıkadıktan sonra, her biri mililitre başına 5. hücrelere 1 çarpı 10 ila 5. hücre yoğunluğunda en az 600 mikrolitre hücre içeren buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün.Hücreleri içeren tüplere uygun şekilde antikorlar ekleyin ve 30 dakika boyunca ışıktan korunan buz üzerinde inkübe

directed-differentiation-hemogenic-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Bu video, insan iPSC'lerini beyin mikrovasküler endotel hücrelerine ayırmak için çok adımlı bir süreci göstermektedir. Elde edilen farklılaşmış hücreler, sıkı bağlantılarla karakterize edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini yakından taklit eder ve bu da onları beyin hastalıkları üzerine araştırmalar için ideal hale getirir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerine Farklılaşması

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Bu makalenin amacı, insan hepatik progenitörlerin pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasına neden olmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlamaktır. Bu prosedürün kullanıma hazır ortam formülasyonları ile geliştirilmesi, kullanıcıya biyomedikal araştırma ve çeviri için insan karaciğer hücreleri üretmek için bir facile sistemi sunmaktadır.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Burada, pluripotent kök hücrelerin beyin mikrovasküler endotel hücresi (BMEC) benzeri hücrelere farklılaşmasını sağlayan genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemi (EECM) olan bir protokolü açıklıyoruz. Bu hücreler endotel hücre adezyon molekülü ekspresyonunu gösterir ve bu nedenle in vitro immün hücre etkileşimlerini incelemek için uygun bir insan kan-beyin bariyer modelidir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Olgun Bir İmmün Fenotipli Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Benzeri Hücrelere Farklılaşması

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinden hemojenik endotel hücrelerinin yönlendirilmiş farklılaşma protokolünü. Bu yöntem, endotelden hematopoietik geçişi in vitro çalışmak ve rejeneratif tıpta kan ürünü üretimi için temel oluşturur.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Daha fazla video keşfet