Name: Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Keşfedin hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS) yöntemini, pulmoner damar yapısı ve kontraktilete çalışmaları için kullanılan güçlü bir ex vivo model olarak. Bu teknik, canlı görüntüleme ve moleküler analizler için üç boyutlu akciğer mimarisini korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Teknik destekleri için Dr. Yuan Hao ve Kaifeng Liu'ya teşekkür eder. Bu çalışma NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Bursu ve Dr. Ke Yuan'a Pulmoner Hipertansiyon Derneği Aldrighetti Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.

Tüm hayvan bakımı Boston Çocuk Hastanesi'nin yönergelerine uygundu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokoller. Bu çalışmada kullanılan fareler vahşi tip C57 /B6 fareler ve Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato çapraz farelerdir.
1. Çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Deney sırasında gerekli olan fosfat tampon çözeltisini (1x PBS) ve% 2 agarose çözeltisini önceden hazırlayın.<ol>
<li>2 g agarose tozunun 100 mL otomatik kapatılmış suya karıştırılması. Çözelti net olana kadar mikrodalga fırında birkaç saniye ısıtın.</li>
		<li>Çözeltiyi kullanıma kadar 42 °C'de bir su banyosuna yerleştirin. NOT: Hem PBS hem de %2 agarose haftalarca oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fare akciğerinin çıkarılması
<ol><li>Fareyi aşırı dozda izofluran ile ötenazi. Alt seviyedeki kağıt mendile az miktarda izofluran yerleştirerek ve fareyi bir kurutucuda üst seviyeye yerleştirerek izofluran aşırı doz elde edin. Fare, bilinçsiz olana kadar kurutucuda kalır.</li>
	<li>Boyuna düşük basınç uygulayarak ve kuyruğa kaudal çekerek farenin ölümünü sağlayın. Fareyi diseksiyon yüzeyine getirin.</li>
	<li>Fareyi supine konumuna getirin ve yapışkan bantla masaya bantlama pençeleri ve burun yerine sabitleyin.</li>
	<li>Farenin ventral yüzeyine% 70 etanol püskürtün ve fazla etanolleri silin.</li>
	<li>Farenin karın derisini mesanenin bulunduğu yerde tokmaklarla kaldırın ve orta çizgide cerrahi makasla kesin, servikal bölgeye üstün hareket ederek nefes borusuna maruz kalın.</li>
	<li>Alttaki fasyal tabakayı cımbızla kaldırın ve visseral organları ve mediastinal bölmeyi ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesin, yine üstünden daha düşük bir şekilde kesin.</li>
	<li>Kalbi ve akciğeri açığa çıkarmak için orta çizgideki sternumu kesin.</li>
	<li>Künt diseksiyon kullanarak diyaframı karaciğer ve karın bölmesinden ayırın.</li>
	<li>Bağırsakların altındaki alt vena kavayı (IVC) bulun ve IVC'yi kesin.</li>
	<li>Sağ ventrikülü bulun. NOT: Sağ ventrikül sol ventriküle göre daha hafif bir görünüme sahip olacak ve sağ ventrikülü sol ventrikülden ayırarak intraventriküler septum görselleştirilmelidir.</li>
	<li>25-30 G kelebek iğnesi ile sağ ventrile 0,5 mL%1 fraksiyone heparin enjekte edin ve ardından 1x PBS'nin 10-15 mL'si ile yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yıkayın (Şekil 1A).<ol>
<li>İğneyi kalpten geçirmemek ve kantinanik boşluğa heparin enjekte etmemek için dikkatli olun. NOT: 1x PBS enjeksiyonu akciğer dokusunu beyaza çevirir. Karın aortundan ekstravaze olan sıvı berrak ve renksiz olmalı ve başarılı kızarma sonrası karaciğer görünüşte beyazlaşabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gırtlak bulun ve künt uç cımbız kullanarak çevredeki fasya ve dokuyu parçalara ayrıştırın.</li>
	<li>Cerrahi dikişi nefes borusunun altına yerleştirin ve gevşek bir şekilde cerrahi bir düğüm bağlayın.</li>
	<li>Nefes borusuna ip ve 20 G künt uçlu iğne ile kanüleden daha üstün küçük bir delik yerleştirin.</li>
	<li>Cerrahi bir düğüm kullanarak iğne ve trakea etrafındaki dikişi sıkın.</li>
	<li>Nefes borusuna 2,5-4 mL agarose enjekte edin ve akciğerin şişirmesini izleyin.</li>
	<li>Agarose aşılandıktan sonra, agarose katılaştırmak için akciğerin üzerine soğuk, soğutulmuş 1x PBS dökün.</li>
	<li>Ameliyat dikişinden daha üstün trakeayı kesin ve herhangi bir yapışıklığı ve fasyayı çıkararak akciğeri ve kalbi mediastinyumdan kesin.</li>
	<li>Katılaşmadan sonra, buzda tutmak için bir Petri kabına 1x DMEM 'e (dokuyu batırmaya yetecek kadar) yerleştirin. Vibratom makinesi kullanarak hemen bir lob dilimleyin(Şekil 1B).</li>
</ol>3. Hassas kesilmiş akciğer dilimleri
<ol><li>Numuneyi platforma süperglue ile takın ve numunenin medial tarafını yukarı bakacak şekilde tutun.</li>
	<li>Numune kabını 1x PBS ile doldurun ve numunenin tamamen suya batırılmasını sağlayın.</li>
	<li>PBS'yi ve numuneyi soğuk tutmak için numune kabını çevreleyen kabı buzla doldurun.</li>
	<li>Vibratomu açın ve aşağıdaki istenen ayarlara ayarlayın.<ol>
<li>Kalınlığı 300um olarak ayarlayın.</li>
		<li>Frekansı 100 Hz olarak ayarlayın.</li>
		<li>Genliği 0,6 mm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Hızı 5 μm/s'ye ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir Allen anahtarı kullanarak, bıçak tutucuyu güvenli konuma getirin ve bir bıçak yerleştirmek için çeneleri açın.</li>
	<li>Çeneleri bir Allen anahtarı ile sıkın ve bıçak tutucuyu dilimleme için uygun konuma getirin.</li>
	<li>Örneği ve platformu kutunun üzerine yerleştirin ve bıçağın önüne kaydırın.</li>
	<li>Örnek platformunun etrafındaki kutuyu, numune suya gömülene kadar 1x PBS ile doldurun.</li>
	<li>Vibratom bıçağını bloğun kenarına getirin ve bıçağı numunenin üst kısmına gelene kadar manuel olarak diraye diri diri dürt.</li>
	<li>Uygun ayarları onaylayın ve vibratomu çalıştırın (Şekil 2).</li>
	<li>Taze dilimler kesildikçe, örnekleri PBS'den çıkarın ve 1x antibiyotik-antimycotic içeren 10 mL 1x DMEM ile steril bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>İşiniz bittiğinde bıçağı tamamen geri çekin ve ardından bıçağı güvenli bir konuma getirmek için Allen anahtarını kullanın.</li>
	<li>Numuneleri 1x DMEM'de 37 °C'de bir inkübatörde 10 güne kadar korunmuş canlılık ile saklayın (aşağıdaki canlılık deneyine bakın).</li>
</ol>4. Örnek vazokonstriktör deneyi
<ol><li>Mikroskop slaydına vibratom dilimi yerleştirin.</li>
	<li>Slayda yerleştirmeden önce, fazla ortamdan (PBS) kurtulmak için bir temizleme mendili kullanın.</li>
	<li>Numuneyi faz kontrastlı mikroskopinin altına yerleştirin ve bir damarı tanımlamak için 10-20x büyütme kullanın.</li>
	<li>Slaydı tamamen batırmak için 60 mM KCl veya 1 μM Endothelin-1 gibi 500 μL vazokonstriktör koyun.</li>
	<li>30 s-60 sn(Video 1)için kayıt larak videoyu gözlemleyin ve yakalayın.</li>
</ol>5. PCLS'de dokuyu RNA veya protein lizizine hazırlamak
<ol><li>Deneye başlamadan önce, küçük bir polistiren köpük kutusunu 1 L sıvı azotla doldurun.</li>
	<li>Başlamadan önce sıvı azotlu kabın içine iki küçük mikrosantrifüj tüpü (1,5 mL) yerleştirin. NOT: Sıvı nitrojen tüplerin dışında soğumalı, ancak içeride olmamalıdır. Sıvı nitrojeni dikkatli bir şekilde işlediğinizden ve cildi sıvı nitrojene maruz bırakmadığınızdan emin olun. Kutudan tüpleri yerleştirmek ve çıkarmak için tokmaklar ve eldivenler kullanın.</li>
	<li>Bir harç kabına 4-5 taze vibratom dilimi yerleştirin.</li>
	<li>Harç kabındaki dilimlerin üzerine 5-10 mL sıvı N2 dökün.</li>
	<li>Sıvı azot buharlaşmadan önce flaş dondurma dilimlerini toz haline getirmek için pestle'ı hızla kullanın. NOT: Doku ince bir toz halinde yoğunlaşmalıdır. Değilse, elde edilene kadar ek sıvı azot ekleyin.</li>
	<li>Çelik laboratuvar kepçesi (sıvı nitrojen ile önseçimli) kullanarak, tozu iki soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne kepçeleyin.</li>
	<li>Protein lizizine devam etmek için RNA izolasyonu veya 500 μL RIPA tamponu (1x proteaz inhibitörleri içerir) ile devam etmek için 500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyerek tozu lyse edin.</li>
	<li>Ek RNA yalıtımı, BCA ölçümü ve batı lekesi olana kadar numuneleri -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>6. Canlılığın belirlenmesi
<ol><li>Vibratom hazırlığından sonra, iki akciğer dilimini 450 μL DMEM ortamlı ve 50 μL hücre canlılığı reaktifli 24 kuyulu bir kültür plakasına yerleştirin (dokunun tamamen batırıldığından emin olun).</li>
	<li>Numuneleri ışığa minimum maruz kalarak gece boyunca 37 °C inkübatörde %5 CO2'ye geri yerleştirin.</li>
	<li>Sabahları, renk değişimi için çözümü gözlemleyin. Doku uygun olduğunda mavi çözelti pembeye döner.</li>
</ol>7. Hücre etiketlemesinin korunması
<ol><li>TdTomato etiketi Cre pozitif hücrelerini indük etmek için toplam 5 gün boyunca (toplam doz 10 mg Tamoxifen) TAMOXIFEN (2 mg / gün) IP enjeksiyonu ile Ai14 tdTomato faresi ile çapraz transgenik bir Cdh5-CreERT2 tedavi edin.</li>
	<li>Enjeksiyondan bir hafta sonra, yukarıdaki 1 ila 3 adımlarını kullanarak akciğerleri hazırlayın.</li>
	<li>Hassas kesilmiş akciğer diliminin hazırlanmasından sonra, dokuyu bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin ve dokunun üzerine bir kapak parçası yerleştirin.</li>
	<li>TdTomato boyamasını tespit etmek için bir konfokal mikroskop kullanın (eksitasyon dalga boyu 555 nm kullanarak).</li>
</ol>

<ol><li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Gerontology+%26+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li>
<li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+%283D-LTCs%29+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437(2019).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).</li>
<li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+slices%3A+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li>
<li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li>
<li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li>
<li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li>
<li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li>
<li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902(2019).</li>
<li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698(2011).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT%2C+ACH%2C+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li>
<li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128(2014).</li>
<li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+dissection%3A+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li>
<li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).</li>
<li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).</li>
<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+function+and+endothelin-1%3A+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).</li>
<li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li>
<li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2%2B+from+intracellular+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).</li>
<li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu yazıda, özellikle vasküler yapının korunmuş kontrititesi ile üç boyutlu olarak görülebilen akciğer dokusunun mikrosliklerini elde etmek için PCLS uygulaması kullanılarak, vasküler yapıyı koruyan ve deneysel esnekliği optimize eden yüksek çözünürlüklü murine akciğer dokusu görüntüleri üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmıştır. Uygulanabilirlik reaktifini kullanarak, protokol özenle hazırlanmış ve korunmuş dilimlerin bir haftadan fazla yaşayabilirliği koruyabileceğini göstermektedir. Mikrosliklerin korunmuş ca...

Anatomik yapıdan ödün vermeden hücresel bileşenleri koruyan akciğer dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesinde meydana gelen gelişmeler pulmoner hastalıkların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Fizyolojik yapıyı korurken proteinleri, RNA'yı ve diğer biyolojik bileşikleri tanımlama yeteneği, çok sayıda pulmoner hastalıkta patofizyolojinin anlaşılmasını genişletebilecek hücrelerin mekansal düzeni hakkında hayati bilgiler sunar. Bu ayrıntılı görüntüler, hayvan modellerine uygulandığında pulmoner arter hipertansiyonu gibi pulmoner vasküler hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir ve potansiyel olarak iyileştirilmiş terapötik stratejilere yol açabilir.
Teknolojideki gelişmelere rağmen, murine akciğer dokusunun yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek zor olmaya devam ediyor. Solunum döngüsü, inhalasyon sırasında oluşan negatif intratorasik basınç tarafından tahrik edilir1. Geleneksel olarak biyopsiler elde edilirken ve akciğer örnekleri görüntüleme için hazırlanırken, negatif basınç gradyanı kaybolur ve bu da artık mevcut durumunda kendini temsil eden hava yolu ve vaskülatın çökmesine neden olabilir. Mevcut koşulları yansıtan gerçekçi görüntüler elde etmek için, pulmoner hava yolları yeniden şişirilmeli ve vaskülat perfüzyona maruz kalarak dinamik akciğeri statik bir fikstüre dönüştürmelidir. Bu farklı tekniklerin uygulanması, makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere yapısal bütünlüğün, pulmoner vaskülatın ve hücresel bileşenlerin korunmasına izin vererek akciğer dokusunun fizyolojik durumuna mümkün olduğunca yakın görülmesini sağlar.
Hassas kesim akciğer dilimleme (PCLS), pulmoner vaskülat2anatomisini ve fizyolojisini incelemek için ideal bir araçtır. PCLS, yapısal ve hücresel bileşenleri korurken akciğer dokusunun üç boyutlu olarak ayrıntılı görüntülenmesini sağlar. PCLS, hayvan ve insan modellerinde hücresel fonksiyonların canlı, yüksek çözünürlüklü görüntülerinin üç boyutta kullanılmasına izin vermek için kullanılmıştır, bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek, küçük hava yolu kasılmalarını ölçmek ve KOAH, ILD ve akciğer kanseri gibi kronik akciğer hastalıklarının patofizyolojisini incelemek için ideal biraraçtır 3. Benzer teknikler kullanılarak, PCLS örneklerinin vazokonstriktörlere maruz kalması akciğer yapısını ve damar kontrititesini koruyarak in vitro durumları çoğaltabilir. Sözleşmenin korunmasının yanı sıra, hazırlanan numuneler doğru hazırlandığında RNA dizilimi, Batı lekesi ve akış sitometrisi gibi ek analizlerden geçirilebilir. Son olarak, akciğer hasadından sonra tdTomato floresan ile işaretlenmiş muhabir renk etiketli hücreler, mikroslikler hazırladıktan sonra etiketlemeyi koruyabilir ve bu da hücre izleme çalışmaları için idealdir. Bu tekniklerin entegrasyonu, pulmoner vaskülür hastalığında sinyal basamaklarının ve potansiyel terapötik seçeneklerin daha ayrıntılı anlaşılmasına yol açabilecek hücrelerin mekansal düzenini ve damar kontrtinazlığını koruyan sofistike bir model sağlar.
Bu yazıda PCLS murine akciğer dokusu vasokonstriktörlere maruz kalarak korunmuş yapısal bütünlük ve damar kontrititesini ortaya koymuştur. Çalışma, uygun şekilde hazırlanan ve ele alınabilen dokunun 10 gün boyunca canlı kalabileceğini göstermektedir. Çalışma ayrıca endojen floresan (tdTomato) ile hücrelerin korunmasını göstererek, örneklerin pulmoner vaskülat ve mimarinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamasına izin vermektedir. Son olarak, doku dilimlerini RNA ölçümü için ve Batı lekesini alttaki mekanizmaları araştırmak için ele almanın ve hazırlamanın yolları açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Şırıngada 0.5cc fraksiyone heparin</td><td>BD</td> mL <td></td><td>başına 100 USP birimi</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>20 1/2 inç ölçer trakea kanülasyonu için künt uçlu iğne</td><td>Cml Kaynağı</td><td>90120050D</td><td></td></tr><tr><td>30cc şırınga</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Anti Anti çözelti</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik titreşimli bıçak mikrotomu</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Canlılığı Reaktifi (alamarBlue)</td> <td>Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium ve GLutaMAX, %10 FBS, %1 Pen/Strep ile desteklenmiş</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Endotelin-1</td><td>Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Havan ve Havan Tokmağı</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu</td><td>Thermoscientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi sütür 6/0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktif</td><td>İnvitrojen, Thermofisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Düşük Erime Noktalı Agaroz</td><td>İnvitrojen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Kanatlı kan alma seti (Kelebek iğnesi) 25-30G</td><td>BD</td><td>25-30G</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo pulmoner damar yapısı ve kontritite Çalışmaları İçin verimli bir araç olarak hassas kesim akciğer dilimleri

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Murine akciğer dokusunun görselleştirilmesi, alttaki hava yolu ve vaskülat ile ilgili değerli yapısal ve hücresel bilgiler sağlar. Bununla birlikte, fizyolojik koşulları gerçekten temsil eden pulmoner damarların korunması hala zorluklar ortaya koyuyor. Ek olarak, murine akciğerlerinin hassas konfigürasyonu, hem hücresel kompozisyonu hem de mimariyi koruyan yüksek kaliteli görüntüler için numuneler hazırlamakta teknik zorluklarla sonuçlanır. Benzer şekilde, hücresel kontritite tahlilleri, hücrelerin vazokonstriktörlere in vitroyanıt verme potansiyelini incelemek için yapılabilir, ancak bu tahliller sağlam akciğerin karmaşık ortamını yeniden üretmez. Bu teknik konuların aksine hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS) yöntemi, akciğer dokusunu bölgesel önyargı olmadan üç boyutlu olarak görselleştirmek için etkili bir alternatif olarak uygulanabilir ve 10 güne kadar canlı vekil kontritite modeli olarak hizmet vermektedir. PCLS kullanılarak hazırlanan doku, yapıyı ve mekansal yönelimi korumuştur, bu da hastalık süreçlerinin eks vivoincelenmesini ideal hale getirir. Endojen tdTomato etiketli hücrelerin, indüklenebilir bir tdTomato muhabir murine modelinden elde edilen PCLS'deki konumu konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirilebilir. Vazokonstriktörlere maruz kalındıktan sonra PCLS, hem damar kontrititesinin hem de zaman atlamalı bir modül tarafından yakalanabilen akciğer yapısının korunmasını gösterir. Batı blot ve RNA analizi gibi diğer prosedürlerle birlikte PCLS, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Hücrelere veya dokuya eklendiğinde, canlılık reaktifi, canlı dokunun azaltıcı ortamı tarafından değiştirilir ve pembe / kırmızıya döner ve yüksek floresan haline gelir. 0-1 ve 9-10. günden itibaren tespit edilen temsili renk değişiklikleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Belirtildiği gibi, çözüm maviye başladı ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle 1-4 saat içinde gerçekleşir; ancak, daha uzun bir süre gerekebilir. Canlılığı test etmek için, vibratomla hazırlanm...

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Hassas kesim akciğer dilimleri yöntemi, yapıyı ve mekansal yönelimleri bölgesel önyargı olmadan üç boyutta koruyacak ve damarlar ve hava yolu kontritite ölçümleri için canlı taşıyıcı model görevi görecektir. Zaman atlamalı görüntüleme, Batı lekesi ve RNA analizi ile birlikte, hassas kesilmiş akciğer dilimleri, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur. Başlamak için, ötenazi yetişkin fareyi bir supine konumuna getirin ve pençeleri ve burnu yapışkan bantla masaya bantlayarak yerine sabitleyin.Farenin ventral yüzeyini% 70 etanol ile püskürtün. Farenin karın derisini mesanenin bulunduğu yerde kaldırmak için önpsezleri ve orta çizgide kesmek için cerrahi makası kullanın, nefes nefese maruz kalmak için servikal bölgeye üstün hareket edin. Daha sonra alttaki fasya tabakasını kaldırmak için cımbız kullanın ve visseral organları ve mediastinal bölmeyi ortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanın, yine üstünden daha düşük kesim.Kalbi ve akciğeri açığa çıkarmak için orta çizgideki sternumu kesin. Diyaframı karaciğerden ve karın bölmesinden dikkatlice ayırın. Bağırsakların altındaki alt vena kavayı bulun ve kesin.Sağ ventrikülü bulduktan sonra, 25 ila 30 kalibrelik bir kelebek iğnesi kullanarak sağ ventrikülün içine %1 fraksiyone heparinin 0,5 mililitresini enjekte edin ve 10 ila 15 milimetre PBS ile yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yıkayın. Gırtlağın yerini tespit ettikten sonra, çevredeki fasya ve dokuyu parçalamak için künt uçlu cımbız kullanın, ardından cerrahi sütür nefes borusunun altına yerleştirin ve gevşek bir şekilde cerrahi bir düğüm bağlayın. Nefes borusuna ipe göre daha üstün küçük bir delik yerleştirin ve 20 kalibrelik kör uçlu bir iğne ile kanüle edin.Cerrahi bir düğüm kullanarak iğne ve trakea etrafındaki dikişi sıkın. Daha sonra nefes borusuna 2,5 ila 4 mililitre agazo enjekte edin ve akciğerin şişirmesini izleyin. Agarose enjeksiyonundan sonra, agarose katılaştırmak için akciğerin üzerine soğuk PBS dökün.Daha sonra nefes borusu cerrahi dikişten daha üstün kesin ve herhangi bir yapışıklık ve fasyayı çıkararak akciğeri ve kalbi mediastinyumdan kesin. Katılaşmadan sonra, DMEM'deki dokuyu buz üzerindeki bir Petri kabına yerleştirin ve hemen bir vibratom makinesi kullanarak bir lobu dilimleme işlemine devam edin. Akciğer dilimlerini hazırlamak için, örneği platforma süperglue ile takın ve medial tarafı yukarı bakacak şekilde tutun.Ardından örnek kabı PBS ile doldurun. Çevredeki PBS'yi ve numuneyi soğuk tutmak için kabı buzla doldurun. Vibratomu aç.Kalınlığı 300 mikrometreye, frekansı 100 Hertz'e, genliği 0,6 milimetreye ve hızı saniyede beş mikrometreye ayarlayın. Bir Allen anahtarı kullanarak, bıçak tutucuyu güvenli konuma getirin ve bir bıçak yerleştirmek için çeneleri açın. Sonra çeneleri bir Allen anahtarı ile sıkın.Örneği PBS'ye batırıldıklarından emin olarak kutunun üzerine yerleştirin. Kutuyu doğru konuma getirin ve güvenli olduğundan emin olun. Bıçak tutucuyu dilimleme için uygun konuma getirin.Vibratom bıçağını bloğun kenarına getirin ve bıçağı numunenin üst kısmına gelene kadar manuel olarak diraye diri diri dürt. Ayarları onaylayın ve vibratomu çalıştırın. Taze dilimler kesildikten sonra, örnekleri PBS'den çıkarın ve bir kerelik antimykotik antibiyotik içeren 10 mililitre DMEM ile steril bir Petri kabına yerleştirin.Tüm dilimleri bir Petri kabına yerleştirdikten sonra, bıçağı tamamen geri çekin ve bıçağı güvenli bir konuma getirmek için Allen anahtarını kullanın. Örnekleri DMEM'de 37 santigrat derecede saklayın. Ve bir vibratom dilimini mikroskop kaydıranına yerleştirin.Fazla ortamı çıkarmak için bir temizleme mendili kullanın. Numuneyi faz kontrastı mikroskopisine yerleştirin ve bir damarı tanımlamak için 10 ila 20X büyütme kullanın. Daha sonra slaydı tamamen batırmak için 60 milimolar potasyum klorür veya bir mikromoler endotelin-1 gibi 500 mikrolitre vazokonstriktör ekleyin.30 ila 60 saniye kayıt larak videoyu gözlemleyin ve yakalayın. Deneye başlamadan önce, küçük bir polistiren köpük kutusunu bir litre sıvı azotla doldurun ve kabın içine sıvı nitrojen ile iki adet 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Bir harç kabına dört ila beş taze vibratom dilimi yerleştirin.Dilimlerin üzerine 5 ila 10 mililitre sıvı azot dökün ve sıvı nitrojen buharlaşmadan önce dilimleri toz haline getirmek için pestle'yi hızla kullanın. Tozu iki soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne kepçeyle almak için önceden soğutulmuş bir çelik laboratuvar kepçesi kullanın ve RNA izolasyonu için 500 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi veya protein liziz için 500 mikrolitre RIPA tamponu ekleyerek tozu izleyin. Temsili canlılık deneyinde, PCLS dilimlerinin renk değişimi sıfırdan bire ve dokuzuncu günden 10'a kadar tespit edildi.Çözüm başlangıçta maviydi ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle bir ila dört saat içinde meydana geldi, ancak daha uzun bir süre gerekebilir. Vibratomla hazırlanan doku için 562 ve 613 nanometre dalga boylarındaki absorbans arasındaki günlük fark burada gösterilmiştir.Endotelin-1 ve potasyum klorür kullanılarak vibratomla hazırlanmış bir akciğer dokusundaki vaskülatın daralması burada görselleştirilebilir. Tamoksifen enjeksiyonundan bir hafta sonra hücrelerde tdTomato etiketlemesinin korunması bu akciğer dilimlerinde gösterilmiştir. Ek deneyler ve görüntülemelerden önce tüm kanı dolaşımdan çıkarmak için akciğer temizleme ve enflasyon adımını iyi yapmak en önemlisidir.Vasküler hastalıklara ek olarak, PCLS hava yolu ile ilgili hastalığın fizyolojisini incelemek için uygulanabilir ve klinik olarak ilgili senaryolarda insan akciğer dokuları üzerinde daha fazla test edilebilir.

precision-cut-lung-slices-as-an-efficient-tool-for-ex-vivo-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, izole edilmiş insan akciğerlerini agaroz ile şişirmek ve insan hassas kesimli akciğer dilimleri hazırlamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Hazırlanan ex vivo akciğer dilimleri daha ileri immünolojik deneyler için kullanılabilir.

İnsan Hassas Kesimli Akciğer Dilimlerinin Agaroz Bazlı Hazırlanması

Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon (HPV), alveolar hipoksi akciğer perfüzyonunun ventilasyonla eşleştiği önemli bir fizyolojik olgudur. HPV'ye katkıda bulunan başlıca vasküler segment, intra-acinar arterdir. Burada, 20-100 μm çapındaki murine pulmoner damarların HPV analizi için protokolümüzü açıklıyoruz.

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Akciğer hastalıklarında ve yaralanmaya bağlı alveol rejenerasyonunda akciğer morfolojisi ve fizyolojisini değerlendirmek için iç akciğer yüzey alanı (ISA) kritik bir kriterdir. Burada hem akciğer pnömonektomisinde hem de protez implantasyon fare modellerinde ISA için önyargı önlemeyi en aza indirecek standart bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Pnömonektomi ve Protez İmplantasyonu ile İç Akciğer Yüzey Alanının Ölçümü için Standart Bir Yöntem

3Rs prensibi içinde görüş-in seçimli-e doğru hayvan çalışmaları olarak solunum modelleri gelişmektedir. Özellikle solunum maddelerin risk değerlendirmesi için uygun deneyleri eksikliği vardır. Burada, biz insan hassas kesim akciğer dilimleri hava maddelerin değerlendirilmesi için nasıl kullanılacağını açıklar.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Bu protokol, desellülarize hassas kesilmiş akciğer dilimlerini alveoler epitel tip 2 hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile yeniden doldurarak tekrarlanabilir, küçük ölçekli mühendislik ürünü akciğer dokuları oluşturmak için bir yöntemi açıklar.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Akciğer kesitleri oluşturmak için vibratom ve agaroza gömülü akciğer dokusu kullanan bir doku işleme tekniği geliştirdik, böylece akciğer mimarisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin elde edilmesine izin verdik. Spesifik akciğer yapısal belirteçleri kullanarak uzamsal protein ekspresyonunu gözlemlemek için immünofloresan boyama kullandık.

Multipleks Floresan Görüntüleme için Agaroz Gömülü Akciğer Dokusunun Otomatik Vibratom Kesiti

Burada, İzolektin B4'ün tek boyamasını kullanarak tüm farelerin akciğer dokusu için pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlamak için basit ve ekonomik bir protokol açıklıyoruz.

Lobüller Boyunca Farelerde Pulmoner Mikrovasküler Yoğunluğun Ölçülmesi

Retina görüntü analizi microdolaşim görselleştirmek için dikkat çekmeyen bir işlemdir. Kardiyovasküler risk faktörlerinin etkisi retinal damar kalibre değişikliklere neden olabilir. Prosedürler kalibre açıklanan geminin hesaplamak için fundus görüntüleri ve adımları elde etmek.

Bir Uygun Aracı Olarak Fundus Fotoğraf Epidemiyolojik Çalışmaların Kardiyovasküler Hastalıklar Risk Faktörleri için Mikrovasküler Cevapları Eğitim için

Keşfedin hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS) yöntemini, pulmoner damar yapısı ve kontraktilete çalışmaları için kullanılan güçlü bir ex vivo model olarak. Bu teknik, canlı görüntüleme ve moleküler analizler için üç boyutlu akciğer mimarisini korur.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Daha fazla video keşfet